基于ITS序列分析铁皮石斛与近缘类群的亲缘关系

目的:采用分子系统学方法分析铁皮石斛及其近缘种的遗传多样性,为准确进行基源鉴定、阐明属内的种间关系提供分子证据。方法:采集25种40个石斛样品分离提取DNA,PCR扩增ITS区及5.8S rDNA完整序列并测序,用Mega3.1软件进行分子遗传进化分析。采用邻接法和最大简约法分析铁皮石斛亲缘关系构造系统树。结果:对25种石斛类植物的ITS区序列进行分析,两种方法得到的系统树基本一致。ITS序列在石斛种间存在极其显著的差异,铁皮石斛与其它各种石斛均有各自特异性的序列位点。结论:ITS序列作为石斛属植物种间的分子鉴定标记是可行的。     

基于ITS2序列和特定引物区分铁皮石斛和伪品的PCR鉴别方法

目的:应用ITS2序列差异对铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)和类似石斛品种进行归类分析,并建立快速分析鉴别特定铁皮石斛的方法。方法:提取9批石斛药材品种的DNA,采用ITS2通用引物进行PCR扩展,测序。对ITS2序列进行BLAST序列比对,Bio Edit软件进行Clustal W多重对比,针对差异序列设计特异引物,PCR扩增,通过琼脂糖电泳进行铁皮石斛特定品种的鉴别。结果:碱基序列配对BLAST未能将#1~4样品准确归类,#5~9确定为铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)。9批样品进行ITS2序列多重对比,发现#1~4样品与#5~9样品的ITS2序列在23~49 bp位置存在显著差异,采用软件设计引物ITS2-specific R和ITS2-specific F,在退火温度为60℃PCR扩增,#5~9样品在136 bp出现条带,而#1~4在相应位置样品未见条带。结论:特定铁皮石斛品种的ITS2序列与伪品存在局部差异,能够通过PCR方法与伪品进行区分。该PCR鉴别方法将为区分特定铁皮石斛和伪品提供快速、有效的鉴别方法。     

基于DNA条形码的多花黄精系统发育和变异位点分析研究

目的对来自不同地域的多花黄精野生资源的核糖体内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)和psbA-trnH基因间隔区序列进行系统发育分析,探索不同地理来源的多花黄精资源的遗传多样性和亲缘关系。方法用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法扩增获得多花黄精ITS和psbA-trnH的核酸序列,与美国国家技术信息中心(NCBI)相对应的核酸序列比对获得多花黄精ITS2和psbA-trnH核酸序列。用邻接法(Neighbor joining)构建系统发育树,用Kimura two-parameter(K2-P)模型分析遗传距离,用Mega和DNAman软件进行多重比对分析。结果安徽青阳样品的ITS2序列为224bp,其余24份样品的ITS2序列均为225bp,福建泰宁的1份样品为620bp,其余24份多花黄精样品的psbA-trnH序列均为621 bp,2个序列分别存在7个和4个变异位点。采用ITS2序列构建的系统发育树将25份资源分为2个大的类群,湖南和贵州的5份资源种群聚为一类,其他20份资源聚为一类,遗传距离显示来自贵州花溪、剑河的样品和来自福建建阳的遗传距离最大;采用psbA-trnH序列构建的系统发育树则无法将不同地域多花黄精资源区分开。结论系统发育和变异位点分析为多花黄精资源的进化研究、道地性评价奠定了理论基础,变异位点的分析可用于相关资源的鉴定。     

基于ITS和ITS2序列的药用石斛DNA条形码鉴定研究

目的 探讨内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）和内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)片段作为DNA条形码鉴别我国41种药用石斛种类的可行性。方法 通过PCR扩增测序结合GenBank公共序列筛选分别获得我国41种药用石斛的核基因ITS和ITS2序列433条和410条,以Kimura-2-parameter(K2P)模型计算种间和种内遗传距离,以邻接法（neighbor-joining,NJ）构建系统发育树,并对ITS2二级结构进行预测分析。结果 基于遗传距离和NJ树分析结果均显示,ITS和ITS2作为DNA条形码可分别有效区分待测的30和31种药用石斛,物种鉴定效率分别为73.2%和75.6%。联合系统发育树和ITS2序列二级结构分析,药用石斛种类的鉴定效率可提升至87.8%。结论 ITS2作为DNA条形码对药用石斛的物种分辨率优于ITS,物种取样数量可显著影响DNA条形码对药用石斛的物种鉴定效率。结果丰富了我国石斛属植物的DNA条形码数据库,为保障药用石斛种质资源和药用安全提供了科学基础和技术...     

基于DNA条形码分析的霍山石斛及其常见混伪品的初步研究

该研究选择叶绿体基因rbcL,matK及核基因组ITS2序列初步探讨石斛属植物的系统发育关系,筛选可用于石斛属药用植物鉴定的DNA条形码通用序列,分析应用DNA条形码对霍山石斛及伪品进行品种鉴定的可能性。使用ITS2,rbcL,matK序列的通用引物对石斛属植物进行扩增测序,通过比较各序列的扩增和测序成功率,种内和种间的变异等指标,运用Bio Edit,MEGA 5. 0等软件分析序列,构建NJ分子系统树,进而评价不同序列的鉴定能力。结果表明ITS2序列不仅在石斛属种内变异和种间变异最大,而且有明显的条形码间隙,种内变异和种间变异重合较少,ITS2序列不同石斛种形成单系分支的百分比也最高,能较好地区分不同种类的石斛。rbcL和matK序列扩增成功率低、NJ系统树可靠性不高,rbcL和matK序列构建的系统树中形成单系的物种支持百分比例均较低。因此ITS2序列可以作为DNA条形码用来鉴别霍山石斛和铜皮石斛、铁皮石斛。     

基于DNA条形码技术的北柴胡种子分子鉴定

目的:建立基于核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列的北柴胡种子分子鉴定方法,保障北柴胡栽培种子的物种准确。方法:收集北柴胡及主要栽培柴胡属物种种子、市售北柴胡种子样品共59份,探究不同取样量和不同水浴条件对种子DNA提取质量的影响,建立柴胡属种子DNA提取方法;通过聚合酶链式反应(PCR)和双向测序得ITS条形码序列。从GenBank下载34条北柴胡、红柴胡、黑柴胡等主要栽培柴胡属物种ITS序列,丰富北柴胡种子鉴定数据库;利用MEGA-X10. 0. 5进行变异位点分析并构建邻接(NJ)系统发育树,考察ITS序列对北柴胡种子的物种鉴定能力;基于BLAST方法和NJ系统发育树法对市售北柴胡种子进行DNA条形码鉴定。结果:共获得59条北柴胡、红柴胡、三岛柴胡及市售北柴胡种子的ITS序列,北柴胡ITS序列可分为6个单倍型,包含7个变异位点,NJ系统发育树表明北柴胡所有单倍型可形成独立的枝,与所收集样品中其他柴胡属栽培物种可相互区分,具备北柴胡种子物种鉴定能力。基于ITS条形码序列鉴定发现19份市售北柴胡种子中有3份为三岛柴胡,伪品率15. 8%。结论:基于ITS序列的DNA条形码技术可以准确可靠地鉴定北柴胡种子及其易混品,可为我国中药材种子规范化建设提供参考。     

不同种源银柴胡及其伪品的ITS2序列分析与鉴别

目的：采用基于内转录间隔区2 (ITS2)序列的分子鉴定法分别对17份不同种源银柴胡和6种伪品基原植物进行分析和鉴别。方法：对植物样品进行DNA提取、扩增、测序,并检索GenBank数据库,获取17份不同种源银柴胡及6种伪品的ITS2序列。采用ITS2数据库进行注释,去除5.8S和28S片段,获得完整的ITS2序列,利用MEGA 8.0软件进行序列比对、计算K2P遗传距离、构建邻接（NJ）系统发育树,采用美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库和“中药材DNA条形码鉴定系统”进行BLAST分析和物种鉴定,并利用ITS2数据库预测二级结构。结果：17份银柴胡样品共得到3个单倍型ITS2序列（YCH1、YCH2和YCH3）,经与银柴胡标准ITS2序列比对,发现YCH1和YCH2与标准序列一致,但YCH3有4处碱基缺失,表现出0.936的遗传距离,在系统发育树中被单独聚为一个分支,并具有不同的二级结构;6种伪品的ITS2序列在长度、鸟嘌呤+胞嘧啶占比、变异位点、遗传距离、NJ系统发育树和二级结构上均与银柴胡ITS2序列表现出明显的差异。结论：基于ITS2序列的分子鉴定方法可以有效鉴别银柴胡...     

几种人工栽培“枫斗类”石斛的多糖含量分析

目的:对比不同产地栽培铁皮石斛及其他3种"枫斗类"石斛药材的质量,为药用石斛资源的评价和开发利用提供依据和参考。方法:采用苯酚-硫酸法测定不同来源石斛的多糖含量。结果:来自7个不同产地的人工栽培铁皮石斛多糖含量在24.32%-38.55%之间,以云南普洱样品多糖含量最高,贵州遵义样品多糖含量最低;采用植株分生苗栽培的齿瓣石斛多糖含量要高于组培苗栽培的样品;人工栽培不同品种石斛的平均多糖含量分别为:铁皮石斛29.30%、兜唇石斛50.12%、齿瓣石斛41.89%及晶帽石斛27.98%。结论:栽培在不同地区的铁皮石斛多糖含量有明显差异;以石斛多糖含量为指标,齿瓣石斛和兜唇石斛具有较大开发价值和应用前景。     

基于DNA条形码的金槐系统发育和变异位点分析

目的：对来自不同居群的金槐资源的核糖体内转录间隔区2(ITS2)和叶绿体基因片段psbA-trnH、rbcL、matK进行系统发育分析,探索不同地理来源的金槐资源的遗传多样性。方法：用聚合酶链式反应（PCR）扩增获得金槐ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK的核酸序列,用邻接法（NJ）构建系统发育树,用Kimura 2-Parameter(K2P)模型分析遗传距离,用MEGA和BIOEDIT软件进行多重比对分析。结果：ITS2序列为278～279 bp;psbA-trnH为289 bp;rbcL为673 bp;matK为786～792 bp。ITS2和psbA-trnH都存在3个变异位点,rbcL没有变异位点,matK有13个变异位点。采用ITS2序列构建的系统发育树将金槐样品资源分为2个大类群,百宝实生树聚为一类,其余25份资源聚为一类。对于psbA-trnH序列,28份金槐资源的PCR扩增成功率为100%。psbA-trnH序列聚类结果显示,28份金槐资源可分为3个大的类群。庙头嫁接/实生树、枧塘嫁接树、文桥嫁接树、咸水实生树和大圩嫁接树组成一个类群;绍水实生树单独组成一...     

金钗石斛和铁皮石斛软腐病原菌的分离和鉴定

 目的 确定引起金钗石斛和铁皮石斛软腐病的病原菌,为制定高效、安全的防治措施提供依据。方法 采用普查和定点观察相结合对软腐病发病情况进行田间观察,采集两种石斛典型病株样本,按照柯赫氏法则对其病原菌进行分离、纯化、菌株鉴定及致病性测定。结果 在树皮为基质的苗床上软腐病在不同苗龄上均可发生,病原菌主要侵染幼嫩多汁的嫩芽和新枝,引起幼嫩茎叶的腐烂、萎焉和坏死等症状。通过对病原菌形态学观察,以及核糖体rDNA ITS序列分析,侵染石斛植株的2个分离菌株被鉴定为终极腐霉Pythium ultimum。致病性实验证明,这两个菌株为石斛软腐病的致病菌株。结论 金钗石斛和铁皮石斛是终极腐霉菌的自然寄主。     

金钗石斛的位点特异性PCR鉴别研究

目的建立一种简便、实用的金钗石斛的DNA分子鉴别方法。方法根据金钗石斛及其他黄草类、枫斗类石斛的rDNA ITS序列数据库,寻找金钗石斛特异性的序列位点,设计专用于金钗石斛鉴别的PCR引物,用该引物在不同条件下扩增石斛属植物的模板DNA,建立只有金钗石斛具有阳性扩增的PCR鉴别条件。结果在66℃、40 s的复性条件下进行鉴别PCR,金钗石斛的模板DNA扩增出约300 bp的阳性扩增带,而其他39种石斛的模板DNA在同样条件下无扩增产物。结论运用位点特异性PCR能有效地从其他石斛属植物中鉴别出金钗石斛,该方法具有高效、准确、简便、省时的特点,应用前景广泛。     

药材与资源石豆兰属植物rDNA ITS序列的克隆与分析

目的通过测定11种石豆兰属植物的ITS序列,为石豆兰属植物分子鉴定和遗传多样性研究提供依据。方法利用PCR法从叶片基因组DNA中克隆ITS序列,并借助生物信息学软件对其进行分析。结果 11种石豆兰属植物的ITS全长为633～645 bp,5.8 S序列长度162 bp,ITS1和ITS2序列变异位点丰富,共168个,其中信息位点95个,序列存在大量的转换、颠换和缺失;5.8 S序列较为保守,仅含6个变异位点和2个信息位点;11种石豆兰属植物的遗传距离为0.002 2～0.212 0,其中齿瓣石豆兰与斑唇石豆兰之间的遗传距离最小,亲缘关系最为接近。序列已上传至NCBI,登录号为JN619409～JN619419。结论获得了11种石豆兰属植物的rDNA ITS序列,为石豆兰属植物分子鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。     

以石斛为例研究多基原及非药用目标选育品种的质量差异

目的:以石斛为例研究多基原及非药用目标选育品种的质量差异。方法:分析铁皮石斛和石斛药材的6个原生种、12个观赏选育石斛品种及1种石斛类药材中常见近缘易混品的5种化学成分和体外抗氧化活性,对比铁皮石斛与其中1种观赏秋石斛的免疫调节和抑菌活性差异。结果:铁皮石斛与石斛药材的多个基原物种、易混伪品金石斛之间的化学成分和体外抗氧化活性均存在差异;金钗石斛与其他4种同样可作为石斛药材使用的原生石斛相比,测定的5种成分中至少有2种成分差异有统计学意义(P<0.05);全部12种观赏石斛的5种成分中,至少有2种成分分别与铁皮石斛或金钗石斛差异有统计学意义(P<0.05),但在抗氧化活性指标中有个别品种与两者差异无统计学意义;铁皮石斛与观赏石斛的药理活性差异有统计学意义,表现在两者的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力和血清溶血素半数溶血值(HC 50)差异有统计学意义(P<0.05);两者不同提取部位的体外抑菌活性差异有统计学意义(P<0.05)。结论:来源不同物种或非药用目标选育品种的石斛药材质量存在差异,临床上应慎重选择使用。     

基于ITS2序列的东北透骨草及其混伪品DNA分子鉴定

目的应用ITS2条形码鉴定东北透骨草及其混伪品,为东北透骨草药材鉴定提供新方法。方法提取35份东北透骨草及其混伪品的基因组DNA,通过PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,测序结果提交至GenBank;从GenBank下载13种东北透骨草及其混伪品ITS2序列42条;对提交与下载的77条序列,应用MEGA7.0软件进行序列比对,计算种内和种间遗传距离,构建Neighber-jioning(NJ)系统进化树,并预测ITS2二级结构。结果东北透骨草3种基原的种内最大K2P遗传距离均远远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;NJ树结果显示东北透骨草及其混伪品药用植物均可明显区分,表现出良好的单系性;比较ITS2二级结构发现,东北透骨草与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别东北透骨草,为保障安全用药提供了新的技术手段。     

蛇床及其近缘物种的ITS2分子鉴定

目的：对传统中药蛇床子基原植物及其近缘物种的ITS2条形码序列进行分析,探讨药用植物蛇床子的分子鉴定方法。方法：采用PCR技术扩增蛇床ITS2基因片段,进行双向测序,运用CodonCodeAligner拼接后,用MEGA5．0软件进行相关数据分析,构建NJ树。应用Schuhz等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果：蛇床与其近缘物种ITS2序列间存在明显差异,基于ITS2序列的NJ树及其ITS2二级结构均可以将蛇床及其近缘物种区分开。结论：ITS2可有效地鉴别蛇床及其近缘物种。     

基于DNA条形码技术对喉红石斛的植物学分类研究

目的 利用DNA条形码技术探索喉红石斛Dendrobium christyanum的分类归属问题,并建立一种新的ITS2二级结构的信息挖掘方法。方法 提取分属5个组14种石斛的DNA,对ITS序列（ITS1-5.8 S-ITS2）进行PCR扩增,测序,获得ITS序列;基于序列信息,计算遗传距离、构建系统发育树,对ITS2的二级结构进行预测,并对其进行量化、聚类分析。结果 喉红石斛与黑毛组的矮石斛D.bellatulum、长距石斛D.longicornu的遗传距离最小,NJ系统发育树与ITS2二级结构的系统聚类图均显示喉红石斛与黑毛组石斛聚为一支,且喉红石斛与黑毛组石斛的二级结构图基本一致。结论 喉红石斛与黑毛组石斛的亲缘关系最近,应归属于黑毛组;新建立的ITS2二级结构量化分析方法可提供更多的分类信息,具有更高水平的分类潜能。这是首次运用DNA条形码进行石斛组间的分类研究,为石斛属植物系统提供了重要依据。     

基于DNA条形码和二级结构鉴定菟丝子及其易混伪品

目的：利用DNA条形码ITS2碱基序列及其二级结构对菟丝子及其混伪品金灯藤进行鉴定。方法：从安徽亳州药材市场收集10份菟丝子、5份南方菟丝子、5份金灯藤样品,提取基因组DNA后,利用ITS2序列扩增引物进行PCR及测序,并从GenBank下载菟丝子、南方菟丝子、金灯藤ITS2序列。利用MEGA 11.0对序列进行比对分析,计算种内、种间遗传距离,利用邻接法（NJ）构建系统聚类树,通过数据库预测ITS2二级结构。结果：菟丝子、南方菟丝子、金灯藤构建的NJ树分别聚为一支,基于ITS2碱基序列的种间遗传距离能准确鉴别菟丝子、南方菟丝子、金灯藤;菟丝子、南方菟丝子、金灯藤的二级结构在整体上有较大区别,能够明显区分。结论：基于ITS2序列可以准确地鉴别菟丝子及其混伪品。     

刺革菌科4种药用真菌的ITS区序列分析

目的对刺革菌科桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孔菌及鲍姆木层孔菌4种药用真菌rDNA ITS片段进行分析,探讨该片段在中外同类真菌的系统学及鉴别研究意义。方法对这4种药用真菌的rDNA ITS区进行了PCR扩增、测序,运用Clustal X、Mega3.1等软件对ITS区序列进行分析。结果获得rDNA ITS1、ITS2和5.8SrDNA完整序列,桦褐孔菌、缝裂木层孔菌、松针层孔菌、鲍姆木层孔菌的ITS1序列长度范围为244~324bp,ITS2序列长度范围为229~274bp。以圆瘤孢多孔菌(DQ200923)为外类群,用分子进化遗传分析软件得到了包括这4种药用真菌及GenBank中3个与这4种中3种相应真菌的ITS序列的系统发育树。这一分析结果与来自形态学的鉴别结果相吻合。结论ITS序列可作为这4种药用真菌分子鉴定的依据。     

川芎及其近缘物种的ITS2序列分析与鉴别研究

目的：对常用中药川芎及其近缘物种进行分子鉴定,以确保该药材的质量及临床安全用药。方法：采用PCR技术,获得ITS2基因片段,进行双向测序,运用CodonCode Aligner拼接后,用MEGA5．0软件进行相关数据分析,构建NJ树。应用Schuhz等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果：川芎与其近缘物种ITS2序列间存在明显差异,基于ITS2序列的NJ树及其ITS2二级结构均可以将川芎及其近缘物种区分开。结论：ITS2可有效地鉴别中药川芎及其近缘物种,在中药鉴定中应用前景广阔。     

F型、H型居群的铁皮石斛rDNAITS区序列差异及SNP现象的研究

目的 :研究铁皮石斛主产区F型和H型居群rDNAITS碱基序列的差异。方法 :运用PCR直接测序法对广西、贵州、云南铁皮石斛主要居群的rDNAITS区 (包括ITS1,5 .8SrDNA ,ITS2 )碱基序列进行了序列测定。结果 :在铁皮石斛各居群中 ,F型居群与H型居群植株的rDNAITS区碱基序列有 2个位点差异 ,且变异分别发生在ITS1区及 5.8S区内。研究表明 :铁皮石斛居群内部rDNAITS区的差异与植物生活型的差异呈一定的相关性 ,H型居群的铁皮石斛是F型的变种。在F型与H型居群间 ,其 5.8SrDNA区存在单核苷酸多态 (SNP)现象。首次报道了铁皮石斛ITS区的碱基序列 ,ITS区总长度为 634bp ,其中ITS1为 231bp ,5.8S为 163bp ,ITS2为 240bp。结论 :rDNAITS区碱基序列的比较分析进一步证明铁皮石斛F型居群与H型居群间具有显著的差异性。