反义VEGF165基因转染对人神经母细胞瘤生物学行为的影响

目的探讨反义VEGF165基因转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长中的作用。方法构建正义和反义VEGF165真核表达载体,用脂质体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选稳定表达细胞克隆。应用RT-PCR证实外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA检测VEGF蛋白的表达水平,MTT法检测肿瘤细胞体外生长情况,并接种于裸鼠皮下,观察体内肿瘤增殖能力。结果RT-PCR证实转染反义VEGF的细胞中有外源性反义VEGF mRNA的表达,免疫细胞化学和EUSA显示VEGF蛋白表达明显降低,MTT实验显示转染前后细胞体外生长速度基本一致。而转染反义VEGF的肿瘤细胞裸鼠体内生长速度明显减慢。结论反义VEGF基因转染能够有效抑制SH-SY5Y细胞内源性VEGF蛋白的表达,抑制裸鼠体内肿瘤的生长。     

VEGF反义RNA抑制裸鼠恶性黑色素瘤生长的研究

目的研究VEGF反义RNA基因转染对裸鼠体内恶性黑色素种植瘤生长的影响。方法裸鼠皮下接种A375细胞，1周后瘤块形成并进行转种和分组治疗，根据瘤体内注射物的不同分为PBS组，Ad—GFP组，Ad—aVEGF组。每周瘤内注射2次，共注射4次。进行大体观察和组织形态学观察VEGF反义RNA基因的表达，最后检测微血管密度（micro-vascular density，MVD）的改变。结果建立了荷瘤裸鼠模型；在抑制体内肿瘤的生长和减少组织坏死方面，Ad—aVEGF组中肿瘤体积和坏死面积均小于PBS组和Ad—GFP组（P〈0．01），PBS组和Ad—GFP组两组无差异（P〉0．05）。各组裸鼠的体重、皮毛、食欲、行为等情况均未见明显异常；Ad—aVEGF组A375细胞VEGF表达减弱，肿瘤内的MVD减少。结论通过反义VEGF165基因阻断人恶性黑色素瘤的生长是可行的。     

抗HER-2工程抗体chA21对人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤血管生成的影响

目的 探讨抗HER-2工程抗体chA21对过表达HER-2的人卵巢癌细胞株SKOV3裸小鼠移植瘤血管生成的影响.方法 建立人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型,随机分成阴性对照组和chA21组,连续5周尾静脉注射给药,观察肿瘤生长变化;5周后处死裸鼠取下瘤体,利用组织芯片及免疫组化方法结合显微图像分析系统定量检测VEGF、DLL4表达情况,并用CD31免疫组化染色比较两组微血管密度(MVD)值.结果 chA21组肿瘤组织中VEGF、DLL4的表达及MVD值均显著低于阴性对照组(P<0.05).结论 抗HER-2工程抗体chA21能显著抑制人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤的血管生成.     

HOXB7 siRNA表达载体在裸鼠体内对人恶性黑色素瘤细胞株的影响

目的探讨转染同源盒第7基因(HOXB7)siRNA质粒表达载体对人恶性黑色素瘤细胞株A375在裸鼠体内生长的影响。方法裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤A375细胞,对2周后形成的瘤块进行分组干预。随机分为生理盐水对照组、阴性质粒组、HOXB7质粒组,观察转染后各组裸鼠移植瘤的生长情况;免疫组化法比较瘤体内微血管密度(MVD)。结果HOXB7质粒组的裸鼠移植瘤块生长慢、体积明显小于生理盐水对照组[(0.134±0.039)cm3比(1.006±0.235)cm3,P<0.05],而阴性质粒组瘤块体积大小与生理盐水对照组无统计学差异[(0.929±0.157)cm3比(1.006±0.235)cm3,P>0.05]。HOXB7质粒组裸鼠体内肿瘤MVD低于生理盐水对照组[(2.8±1.9)比(19.9±5.6),P<0.05],阴性质粒组与生理盐水对照组无统计学差异[(18.1±5.5)比(19.9±5.6),P>0.05]。结论针对HOXB7siRNA质粒表达载体可有效抑制A375细胞裸鼠体内肿瘤生长和瘤内血管生成。     

VEGF165反义RNA对人食管鳞癌细胞影响的实验研究

目的 :观察血管内皮生长因子16 5 (VEGF16 5 )反义RNA对人食管鳞癌细胞EC10 9的影响 ,探讨其治疗食管癌的可行性。方法 :采用亚克隆技术 ,构建并鉴定VEGF16 5 反义RNA的真核表达载体。以重组质粒转染人食管鳞癌细胞EC10 9后 ,将其接种于裸鼠皮下 ,分别利用原位杂交、激光共聚焦、图象分析及微血管计数等方法 ,观察转染前后EC10 9细胞的生物学性状和致瘤性。结果 :成功地构建了VEGF16 5 反义RNA的真核表达载体 ,并在EC10 9细胞中获得表达。转染细胞中VEGF16 5 的表达下降 75% ,其生物学性状不受外源基因表达的影响 ,但其在裸鼠皮下的致瘤性和和瘤组织中血管的生成明显下降。VEGF16 5 反义RNA转染组、空载体转染组和对照组中肿瘤的体积 ,分别为 (82 0± 112 .5)mm3 、(793 0± 10 3 5)mm3 和 (7850± 950 )mm3(P <0 .0 1) ;微血管的密度分别为 (8.5± 1.2 ) /mm2 、(44.3± 9.4) /mm2 和 (46.4± 12 .6) /mm2 (P <0 .0 1)。结论 :VEGF16 5反义RNA能够明显减少食管鳞癌细胞内VEGF16 5 的表达 ,具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用 ,可望用于实体肿瘤的辅助治疗。     

NK4基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的抑制作用

目的 探讨NK4基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的抑制作用及其机制.方法 采用NK4基因重组质粒pVITRO2-NK4转染的Raji细胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型,动态监测裸鼠体重和肿瘤大小.8周后获取瘤组织,分别采用免疫组化和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测移植瘤组织的细胞凋亡和微血管密度(microvessel density,MVD),并进行相关分析.结果 NK4基因转染组裸鼠移植瘤体积明显小于对照组(P<0.01),而对照组间差异无显著性(P>0.05);各组间裸鼠体重降低,差异无显著性(P<0.01).NK4基因转染组的淋巴瘤细胞AI值达237±10.94,而质粒pVITRO2转染组和未转染Raji组的AI值分别为79.7±30.8和81.7±22.2,NK4基因转染组明显高于对照组(P<0.001),而对照组间差异无显著性(P>0.05);NK4基因转染组MVD为4.7±1.52,而质粒pVITRO2转染组和未转染Raji组MVD分别为12.0±1.00和10.66±1.53,NK4基因转染组明显低于对照组(P<0.001),而对照组间差异无显著性(P>0.05).结论 NK4基因转染可明显抑制裸鼠人淋巴瘤移植瘤的生长,其可能通过抑制肿瘤血管新生和促肿瘤细胞凋亡而发挥其效应.     

抗血管内皮生长因子抑制裸鼠异位子宫内膜生长

目的构建子宫内膜异位种植裸鼠模型,在此基础上研究抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体在治疗中的作用及机制。方法将人子宫内膜组织种植到裸鼠体内,抗VEGF抗体作用于种植灶,进行分组对照研究。用TUNEL标记法检测细胞凋亡、PCNA检测细胞增殖和微血管密度(MVD)。结果实验组细胞凋亡强度明显高于对照组,细胞增殖强度在各组间无明显差异。实验组人源性MVD和鼠源性MVD都明显低于对照组(P<0.05)。结论抗VEGF抗体可能是通过促进子宫内膜细胞和血管内皮细胞的凋亡、抑制血管生成,继而抑制内膜异位种植生长,而对细胞增殖无明显抑制作用。     

miR-210对肾透明细胞癌血管生成的影响

目的探讨miR-210对肾透明细胞癌血管生成的影响。方法检测40例肾透明细胞癌组织标本中miR-210的表达,并分析其与相应癌组织中微血管密度(MVD)的关系。通过miR-210反义寡核苷酸(miR-210-ASO)技术抑制肾透明细胞癌细胞系786-O细胞中miR-210表达,RT-q PCR检测转染效果。三维培养实验观察对照组、阴性对照组和miR-210-ASO组肿瘤细胞上清液对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)管腔形成数量的影响。建立裸鼠移植瘤模型,应用endomucin免疫荧光染色于激光共聚焦显微镜下观察抑制miR-210对移植瘤生长,血管形成和VEGF表达的影响。结果肾透明细胞癌组织标本中miR-210的表达与微血管密度呈正相关(P0.05),经miR-210-ASO转染的786-O细胞其miR-210表达明显下降(P0.05)。miR-210-ASO组细胞上清液培养的HUVEC细胞管腔形成数量显著少于对照组和阴性对照组(P0.05)。miR-210-ASO组细胞形成的移植瘤体积小于对照组,且微血管数量和VEGF的表达量显著少于对照组(P0.05)。结论抑制miR-210可降低肾透明细胞癌中血管生成数量。     

HOXB7 siRNA表达载体在裸鼠体内对人恶性黑色素瘤细胞株的影响

目的 探讨转染同源盒第7基因(HOXB7)siRNA质粒表达载体对人恶性黑色素瘤细胞株A375在裸鼠体内生长的影响.方法 裸鼠皮下接种人恶性黑色素瘤A375细胞,对2周后形成的瘤块进行分组干预.随机分为生理盐水对照组、阴性质粒组、HOXB7质粒组,观察转染后各组裸鼠移植瘤的生长情况;免疫组化法比较瘤体内微血管密度(MVD).结果 HOXB7质粒组的裸鼠移植瘤块生长慢、体积明显小于生理盐水对照组[(0.134±0.039)cm3比(1.006±0.235)cm3,P＜0.05],而阴性质粒组瘤块体积大小与生理盐水对照组无统计学差异[(0.929±0.157)cm3比(1.006±0.235)cm3,P＞0.05].HOXB7质粒组裸鼠体内肿瘤MVD低于生理盐水对照组[(2.8±1.9)比(19.9±5.6),P＜0.05],阴性质粒组与生理盐水对照组无统计学差异[(18.1±5.5)比(19.9±5.6),P＞0.05].结论 针对HOXB7 siRNA质粒表达载体可有效抑制A375细胞裸鼠体内肿瘤生长和瘤内血管生成.     

右旋柠烯乳剂对人胃癌移植瘤生长和转移的抑制作用

目的　研究并探讨右旋柠烯乳剂 (D limonene)对人胃癌生长和转移的抑制作用及其机制。　方法　采用人胃癌BGC 82 3细胞株经反复传代成实体瘤的完整组织块 ,建立人胃癌裸小鼠原位移植瘤模型。将 4 0只荷瘤裸小鼠随机分成 4组 ,移植后第 5d开始分别用生理盐水灌胃、5 氟尿嘧啶 (5 FU)腹腔注射、D limonene灌胃、D limonene灌胃 +5 FU腹腔注射共 7周。第 8周处死动物 ,测量原位肿瘤瘤重并计算抑瘤率 ,检测肿瘤细胞凋亡指数 (AI)、肿瘤微血管密度 (MVD)及免疫组织化学测定肿瘤组织血管内皮生长因子 (VEGF)的表达变化 ,光镜与电镜观察组织细胞超微结构变化 ;观察荷瘤鼠腹膜、肝、其他脏器肿瘤转移及腹水情况。　结果　D limonene组、联用组分别与对照组相比 ,胃癌的原位肿瘤瘤重与抑瘤率、AI、MVD、VEGF下调 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。腹膜、肝转移受到明显抑制 (P <0 0 5 )。　结论　D limonene通过抑制肿瘤微血管形成 ,诱导胃癌细胞凋亡 ,抑制了体内胃癌的生长和转移。     

反义人端粒酶RNA对胃癌细胞生长的抑制效应

目的 探讨反义人端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）对胃癌细胞的生长抑制作用。方法 将反义ｈＴＲ真核表达载体经脂质体介导转染入胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化、生长速率及致瘤性。结果 反义ｈＴＲ在潮霉素筛选的阳性克隆中稳定表达,正义ｈＴＲ表达下调,并出现凋亡改变。基因转染细胞体外传代培养的生长速率大多减慢,在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。荷瘤鼠存活时间延长。结论     

HGF基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促进作用

 目的：探讨肝细胞生长因子（HGF）基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促进作用及其机制。方法：采用HGF基因重组质粒pVITRO2-HGF转染的Raji细胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型,动态监测裸鼠体重和肿瘤大小;8周后获取瘤组织,分别采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL) 和免疫组化检测移植瘤组织的细胞凋亡和微血管密度（MVD）,并进行相关分析。结果：造模成功率为96.7%。HGF转染组的瘤体积明显大于HGF转染+VP-16组(P<0.01)、未转染组与空载体组(P<0.01),HGF转染+VP-16组也大于对照组(P<0.01),未转染组与空载体组间无显著差异(P>0.05)。pVITRO2-HGF转染组凋亡指数显著低于对照组(P<0.01),经VP-16诱导后凋亡增加(P<0.01),但仍低于对照组(P<0.01)。pVITRO2-HGF转染组的MVD显著高于对照组(P<0.01),但经VP-16诱导后血管增生降低（P<0.01）,但仍高于对照组 (P<0.05),对照组间无显著差异(P>0.05) 。结论：HGF基因转染可显著促进裸鼠人淋巴瘤移植瘤的生长,明显抑制凋亡的发生,这一效应可能与其促进肿瘤血管新生和抑制肿瘤细胞凋亡有关。     

EGFL7基因沉默对裸鼠乳腺癌血管生成的影响

目的探讨类表皮生长因子域7（EGFL7）基因沉默对乳腺癌裸鼠模型瘤内血管生成的影响。方法构建EGFL7短发夹状RNA表达质粒并转染SGC-7901细胞（pshEGFL7组）,以空质粒转染为对照组。观察两组皮下种植瘤生长曲线及体积。免疫组织化学法检测抗-CD34、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板反应蛋白（TSP1）表达;RT—PCR检测MMP-2和TIMP2表达。结果pshEGFL7组种植瘤体积为（1．86±0．65）cm^3,微血管密度（MVD）为20．84±6．38,分级为1～2级,对照组体积为（4．86±1．15）cm^3,MVD为39．48±9．01,分级为3～4级,两组种植瘤体积、MVD和分级的差异有统计学意义,P值均〈0．05。EGFL7组TSP1蛋白阳性表达,而VEGF蛋白为弱阳性或阴性表达,MMP-2mRNA表达下调,TIMP2mRNA表达上调,与对照组比较差异有统计学意义,P值均〈0．01。结论EGFL7基因沉默可降低乳腺痛种植瘤血管牛成．与调节MMP-2／TIMP2表汰和影响VEGF/TSP1平衡有关。     

In vitro and in vivo study of the expression vector encoding vascular endothelial growth factor

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an angiogenic cytokine with potential therapeutic applications in human diseases. It is a mitogen primarily for endothelial cells. The transfer of the cDNA encoding VEGF to ischemic tissues, which cannot be revascularized otherwise, represents a novel and promising approach to the treatment of vascular disorders. In this work the VEGF165 cDNA was cloned into the expression vector pSecTag2B. The activity of the construct was studied in cell culture as well as in vivo. Western blotting study showed that the cells transfected with the vector secreted significantly higher amounts of VEGF to the culture medium than the non-transfected cells. In vivo study revealed an increased number of new vessels in animals injected with vector encoding VEGF as compared with empty plasmid. Also, tumor cells transfected with the VEGF plasmid exhibited extensive vascularization.     

硫修饰脂质体包裹VEGF反义寡核苷酸对肺癌血管生成及转移的抑制作用

目的：探讨硫修饰脂质体包裹的VEGF反义寡核苷酸对肺癌血管生成和转移的抑制作用。方法：将硫修饰脂质体包裹的VEGF反义寡核苷酸（ASODN）、正义寡核苷酸（SODN）、错义寡核苷酸（MODN）加入培养的Lewis肺癌细胞中，采用免疫组织化学方法检测肺癌细胞中VEGF蛋白表达，观察经ODN处理的条件培养基对牛主动脉内皮细胞增殖的影响。另外，复制小鼠Lems肺癌模型40只，随机分为对照组、VEGFASODN组、VEGFSODN组及VEGFMSODN组，每组10只，接种肿瘤细胞24小时内，给予脂质体、VEGFASODN、VEGFSODN、VEGFMSODN皮下注射，每周2次，连续4周。检测皮下肿瘤的变化和肺转移率，并用免疫组织化学方法检测肿瘤组织微血管密度（MVD），超声检测肿瘤组织Ps、砌变化。结果：ASODN能够下调肺癌细胞中VEGF蛋白的表达，经ASODN处理的条件培养基能显著抑制牛主动脉内皮细胞的增殖。ASODN组小鼠肿瘤生长及肺转移受到显著抑制，MVD、PS、RI与其它各组相比有明显差异（P〈0．01）。结论：硫修饰脂质体包裹的VEGF反义寡核苷酸能够显著抑制肺癌血管生成，进而抑制肿瘤生长及转移。     

多基因共沉默治疗人喉鳞癌裸鼠移植瘤

目的 探讨针对血管内皮生长因子(VEGF)、端粒酶逆转录酶(TERT)、Bcl-xl的3个短发夹状双链RNA(shRNA)的串联表达质粒对人喉鳞癌裸鼠移植瘤生长抑制作用及其机制.方法 构建串联表达3个shRNA的质粒pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl.建立人喉鳞癌Hep-2细胞系荷瘤裸鼠模型.将该质粒转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况.荧光定量即时PCR检测三种目的 基因的mRNA在肿瘤组织中的表达情况,Western blot法检测三种蛋白的表达,原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤细胞凋亡,免疫组织化学sP法检测肿瘤组织微血管密度.结果 与治疗前比较,质粒pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl注射裸鼠皮下移植瘤后,肿瘤生长明显受抑制,治疗后14 d抑瘤率达91.2%.三个目的 基因的mRNA及蛋白表达水平比治疗前均有显著下降.移植瘤组织内检测到大量凋亡细胞,凋亡指数为(60.34±5.32)%.治疗组微血管密度明显低于生理盐水对照组及阴性质粒处理组.结论 pEGFP-shVEGF-shTERT-shBcl-xl能高效特异性地同时抑制3个靶基因在人喉鳞癌Hep-2细胞中的表达,增强基因沉默的多样性,并显著的抑制移植瘤的生长,提示未来应用多基因共沉默治疗喉鳞癌可能具有广阔的前景.