P38激酶介导胆红素诱导的SHSY5Y细胞凋亡

观察P38激酶在胆红素诱导神经细胞凋亡中的作用 ,探讨参与此过程的信号转导通路。将胆红素 (2× 1 0 -2g L)直接作用于体外培养的人神经母细胞瘤细胞系SHSY5Y ,利用Hochest332 58染色在荧光显微镜下观察细胞核的形态是否发生凋亡样改变 ;用P38激酶抑制剂SB2 0 3580预处理细胞后 ,在倒置光显微镜下观察胆红素作用不同时间细胞形态的变化及存活情况 ;利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的改变。结果显示SHSY5Y细胞经胆红素作用后细胞核出现典型的凋亡样改变 ;细胞经SB2 0 3580预处理 1h ,胆红素作用 3h后凋亡率为 (1 2 1± 2 4) % ,对照组为(1 9 4± 2 7) % ;4h后凋亡率为 (39 3± 4 8) % ,对照组为 (66 2± 5 2 ) % ,差异有显著性意义 (P <0 0 1 )。提示P38激酶参与了胆红素诱导SHSY5Y细胞凋亡的信号转导过程     

P38丝裂原活化蛋白激酶在紫外线诱导角质形成细胞凋亡中的作用

目的 探讨中波紫外线(UVB)诱导角质形成细胞凋亡机制.方法 使用0、20、30、40、60、70、90 mJ/cm2 UVB辐射人角质形成细胞(HaCaT),辐射后0、1、2、3、4、6、24、48 h收集细胞和上清.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;ELISA检测上清液中TNF-α水平;Western blot检测P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)的表达.结果 UVB(30 mJ/cm2)辐射后,HaCaT细胞分泌TNF-α逐渐增加,24 h达高峰;P38抑制剂SB203580完全抑制TNF-α的分泌,部分阻止了细胞凋亡;以不同剂量UVB辐射HacaT细胞,在30 mJ/cm2时p-P38 MAPK表达量最高,且辐射后即可检测到p-P38 MAPK的表达,1 h时达高峰,以后逐渐下降,而P38MAPK表达量没有明显变化.结论 紫外线可通过激活P38 MAPK途经,促进TNF-α分泌来诱导角质形成细胞凋亡.     

P38MAPK、Caspase-8在Fas—AD诱导Bel-7402细胞凋亡中的作用

目的通过P38MAPK抑制剂SB203580及caspase-8抑制剂Ac-IEFD-cho的作用,确定P38MAPK、caspase-8的相互作用关系,进一步揭示Fas—AD诱导Bel-7402细胞凋亡的信号转导机制。方法通过RT—PCR法检测培养的Bel-7402细胞中P38MAPK mRNA、caspase．8 mRNA在Fas．AD、SB203580及Ac—IEFD—cho作用下的表达情况。结果在Fas-AD诱导Bel-7402细胞凋亡中,SB203580和Ac—IEFD—cho能分别抑制p38MAPK mRNA、caspase-8 mRNA的表达。结论在Bel-7402细胞凋亡中,P38MAPK与easpase-8参与Fas—AD凋亡途径,并且在mRNA水平进行相互调节。     

热休克转录因子4b的克隆表达及MAP激酶P38对其磷酸化调控

目的:构建热休克转录因子4b(Hsf4b)的真核表达载体,探讨MAP激酶P38对其磷酸化调控作用。方法:用人心脏cDNA文库为模板,应用囊括Hsf4b全长的引物进行PCR并在Hsf4b cDNA的N-端加入Flag标签。将PCR产物经KpnI和EcoRI酶切后,与该二酶线性化pcDNA3.0质粒一起连接获得重组质粒pcDNA-Flag-Hsf4b,将克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b转染HEK293T细胞,并用抗Flag抗体进行免疫印迹分析,免疫沉淀实验和体内Pulldown实验证明Hsf4b可与MAP激酶P38结合,激酶实验结果显示P38可体外磷酸化Hsf4b。结果:应用基因克隆技术,将人Hsf4b的cDNA克隆到真核表达质粒pcDNA3.0和pEBG中。pcDNA-Flag-Hsf4b可在真核细胞HEK293T中表达一个相对分子质量(Mr)约为60000的蛋白。进一步研究发现,Hsf4b可与MAP激酶P38结合,Hsf4b的C-端转录调控区参与和P38的结合,P38可体外磷酸化Hsf4b。结论:实验首次证明Hsf4b可结合并被P38磷酸化,为进一步探讨Hsf4b在晶状体发育过程中的作用提供新的信号通路。     

p38 MAPK基因敲除对亚砷酸盐诱导细胞凋亡的影响

目的： 研究p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在应激刺激诱导的细胞凋亡中的作用。方法: p38+/+和p38-/-细胞用NaAsO₂刺激后，用多聚甲醛固定及DAPI染核，利用荧光显微镜观察细胞核的形态改变。NaAsO₂刺激的p38+/+和p38-/-细胞用Annexin V-FITC与PI双标后，用流式细胞分析仪分析细胞凋亡百分率。结果: NaAsO₂刺激后，大部分p38-/-细胞产生典型的凋亡细胞形态学变化，p38+/+细胞仅少数细胞出现核固缩。而且，p38-/-细胞中凋亡细胞百分率较刺激前和p38+/+细胞都显著增加，而p38+/+细胞的凋亡率没有明显变化。结论: p38基因敲除使细胞对亚砷酸盐应激刺激的耐受性下降，容易发生凋亡；p38丝裂原活化蛋白激酶可能在提高细胞的应激适应能力上发挥着重要的作用。     

柚皮素通过ROS/P38-MAPK信号通路调控肺癌A549细胞增殖及凋亡

目的:探讨柚皮素调控A549细胞增殖及凋亡的分子机制.方法:培养A549细胞,通过CCK-8法检测不同浓度的柚皮素(0、30、60、90、120 μmol/L)对A549细胞增殖的影响;流式细胞术检测各组细胞凋亡及ROS含量;WST-8法检测SOD活性以及硫代巴比妥酸法(TBA检测法)检测MDA含量;Western b...     

bax过表达对乙醇诱导的肝癌细胞凋亡的促进作用

目的探讨促凋亡基因bax过表达对乙醇诱导的原发性肝细胞癌(简称肝癌)细胞凋亡的调节作用。方法用脂质体介导的基因转染法将含有人bax cDNA的噬菌粒表达载体pBK-bax质粒导入人肝癌细胞系HCC-9204细胞中,同时设转染pBK-CMV空载体的和未转染的HCC-9204细胞对照。通过用G-418筛选后获得转入目的基因的细胞克隆。用免疫细胞化学ABC法、图像定量分析和Westert blot法检测bax蛋白在转染bax或空载体前后细胞中的表达情况。用6%乙醇分别作用于上述细胞6h后,MTT法检测细胞杀伤率,TUNEL染色法和流式细胞仪DNA含量分析法检测细胞凋亡的发生程度。结果转染后用G-418持续筛选2周,获得了导入bax或空载体的G-418抗性的细胞克隆。转染bax基因的细胞对bax蛋白的表达强度明显强于转染空载体或未转染的细胞,而转染空载体与未转染细胞的bax蛋白表达强度无明显差异。经低浓度乙醇作用后,转染bax的肝癌细胞的细胞杀伤率、TUNEL指数和亚二倍体凋亡峰比例均明显高于转染空载体或未转染的细胞。结论bax蛋白过表达能够促进低浓度乙醇诱导的肝癌HCC-9204细胞凋亡。     

p38有丝分裂原激酶活化参与继发性脊髓损伤后神经细胞凋亡的实验研究

探索脊髓损伤(SCI)后p38有丝分裂原激酶(p38MAPK)的表达及其与神经细胞凋亡的关系。采用Allen’s法建立大鼠急性SCI动物模型,用蛋白印迹法和免疫组织化学染色方法检测SCI后p38MAPK和caspase-3表达的变化;采用实时定量PCR法检测SCI后caspase-3 mRNA的表达;用原位末端标记法(TUNEL)检测SCI后神经细胞凋亡。结果表明SCI后总p38MAPK表达无变化,但p38MAPK磷酸化明显增多,于伤后6h达高峰;伤后24hcaspase-3表达明显增加。TUNEL检测显示,伤后6h受损伤的脊髓组织有少许凋亡细胞出现,24h细胞凋亡最明显。鞘内注射p38MAPK抑制剂SB203580,明显减少caspase-3的表达,并减少细胞凋亡。以上结果显示SCI后损伤局部p38MAPK激活诱导了caspase-3基因表达,导致神经细胞凋亡;抑制p38MAPK可以阻止SCI后继发的神经细胞凋亡。     

Bak基因对Hela细胞的细胞周期和细胞凋亡的调控作用

目的 研究Ｂｃ１－２基因家族促凋亡蛋白Ｂａｋ在细胞凋亡细胞周期调控中的作用,评价它们作为肿瘤治疗的潜在靶基因的可能性。方法 采用一种可诱导性表达系统,（ＭＴ－Ⅱ调节系统）,在外加锌离子（ＺｎＳＯ４,１００μｍｏｌ／Ｌ）的条件下诱导Ｂａｋ基因表达。以Ｈｅｌａ细胞系作为靶细胞,获得表达Ｂａｋ基因的稳定转染子。结果 可诱导性Ｂａｋ基因过表达的Ｈｅｌａ细胞出现广泛死亡。ＴＵＮＥＬ染色证实细胞核碎片化,提示     

p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在紫外线诱导表皮细胞凋亡中的作用

大量流行病学调查及分子生物学实验研究表明：紫外线可通过诱导活性氧及细胞因子产生DNA损伤和基因表达的改变导致细胞凋亡,这个过程非常复杂,有多个信号转导途径参与.由于细胞凋亡与皮肤癌的发生密切相关,近年来UVB诱导表皮细胞凋亡引起了人们广泛的关注.p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是细胞内重要的信号传导系统之一,参与细胞生长、发育、分化和凋亡等一系列生理、病理过程.p38MAPK可被紫外线激活,并在紫外线诱发的细胞应答过程中发挥重要的作用.     

LPS影响p38蛋白在单核细胞内定位

目的： 探讨 LPS作用下p38蛋白激酶激活的动力学特点及其在细胞内超微结构中的定位。方法： 应用激酶活性测定、胶体金标记的免疫电镜技术观察LPS刺激前后p38蛋白激酶的动力学特点及在单核细胞株Raw264.7中的分布特征。结果： 动力学检测结果显示，LPS作用后15 min，p38磷酸化活性明显升高，30 min达到高峰，2 h达基线水平；p38在LPS浓度为100 μg/L时达最大激活效应。超微定位结果显示，未受刺激的及EGF刺激的细胞，p38在胞浆和胞核中金颗粒呈弥散性分布，金颗粒弥散在细胞的各个部分，如细胞质中线粒体、内质网、溶酶体；单核细胞株受到LPS刺激后，细胞核区的金颗粒明显增多，而胞浆区域的金颗粒显著减少。结论： 单核细胞株Raw264.7受LPS刺激后，其p38蛋白激酶由胞浆移位到胞核。     

P38信号通路在人脐静脉内皮细胞表达P-选择素中的作用

目的 :研究P38信号通路 (P38mitogen activatedproteinki nase ,P38MAPK)在人脐静脉内皮细胞表达P 选择素以及糖尿病动脉粥样硬化中的作用。方法 :分别以高葡萄糖、糖基化终产物 (AGE)、高胰岛素和过氧化氢刺激人脐静脉内皮细胞系ECV 30 4 ,再以P38MAPK特异性抑制剂SB2 0 35 80预处理 ,观察ECV 30 4细胞系中磷酸化P38MAPK和P 选择素的表达。结果 :4种刺激因素均可单独激活P38MAPK ,使磷酸化P38MAPK表达量明显增加 ,P 选择素表达量也明显增加 ;以SB2 0 35 80预处理后 ,P 选择素的表达被明显抑制。结论 :P38MAPK是P 选择素的上游信号分子 ,也可能是动脉粥样硬化发生的始动信号之一     

hR24L基因转染对MCF7细胞凋亡的影响

为研究人类DNA损伤修复基因hR2 4L与细胞凋亡的关系 ,首先用PCR方法扩增了hR2 4L基因的开放阅读框(ORF) ,成功地构建了正义和反义hR2 4L基因的逆转录病毒表达载体重组体。然后用这两种重组质粒转染MCF7细胞 ,筛选出的阳性克隆再分别用过氧化氢、丁酸钠和去血清饥饿诱导凋亡 ,用Northern印迹杂交分析hR2 4L基因表达情况 ,用流式细胞仪和电泳检测细胞凋亡。结果发现转染正义hR2 4L重组载体的细胞的hR2 4LmRNA表达水平升高 ,其凋亡面积所占比例 (2 1 2 1± 2 42 )比对照细胞 (46 16± 4 38)明显降低 ;而转染反义hR2 4L重组载体的细胞的hR2 4LmRNA表达水平则下降 ,但其凋亡峰面积所占比例 (31 0 5± 3 0 2 )比对照细胞也明显降低 ,表明两者均抑制过氧化氢和去血清饥饿诱导的凋亡 ,但它们对丁酸钠诱导的凋亡均无抑制作用。可见hR2 4L基因通过复杂的途径参与细胞凋亡的调控     

ADMA对内皮生长晕细胞凋亡及其相关p38丝裂素活化蛋白激酶表达的影响

目的:探讨非对称性二甲基精氨酸(ADMA)对内皮生长晕细胞(EOCs)凋亡和黏附能力的影响以及凋亡相关p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)表达水平的变化。方法:分离脐血中单个核细胞并原代培养扩增内皮生长晕细胞,免疫细胞化学染色和荧光染色法鉴定其内皮细胞特性。将浓度为0、1、5、10、30μmol/L ADMA与内皮生长晕细胞作用48 h,流式细胞仪检测细胞凋亡率,DAPI染色及AnnexinV/PI双染观察凋亡细胞核形态变化。在倒置显微镜下观察计数重黏附细胞数来测定细胞黏附能力。用特异性的phospho-p38MAPK抗体的W esternb lotting检测p38MAPK的活性。结果:采用贴壁法培养的细胞具有多种内皮细胞特性。ADMA(1-30μmol/L)诱导内皮生长晕细胞的凋亡(P0.01),同时ADMA(5-30μmol/L)使phospho-p38MAPK蛋白表达增加,两者作用均呈浓度依赖性。ADMA作用组和对照组相比,激光共聚焦显微镜下可见更显著的细胞凋亡形态学改变。除1μmol/L ADMA外,5、10、30μmol/L ADMA均可抑制内皮生长晕细胞的黏附能力。结论:ADMA能诱导内皮生长晕细胞发生凋亡并抑制其黏附能力,ADMA诱导内皮生长晕细胞发生凋亡可能与p38 MAPK磷酸化水平上升有关。     

硒对糖尿病患者的内皮细胞表达P38信号通路和MCP-1的影响

目的:探讨P38MAPK和MCP-1的关系及其在糖尿病动脉粥样硬化中的作用以及硒的作用机制。方法:分别以高葡萄糖、糖基化终末产物(AGE)、胰岛素或过氧化氢体外孵育人脐静脉内皮细胞(HUVEC),并以Westernblot法或RT-PCR法检测P38MAPK和MCP-1在HUVEC的表达。检测并比较有无P38MAPK特异抑制剂SB203580或硒预处理,以上4种因素对P38MAPK和MCP-1在HUVEC表达的影响。结果:高葡萄糖、AGE、胰岛素或过氧化氢均可独立激活P38MAPK,并增加MCP-1在HUVEC的表达。SB203580显著抑制MCP-1的表达。硒抑制P38MAPK的活化并减少MCP-1的表达。结论:P38MAPK是MCP-1的上游信号分子,表明P38MAPK可能是糖尿病动脉粥样硬化发生的始动信号之一。硒可能通过抑制P38MAPK磷酸化而抑制MCP-1表达,有预防动脉粥样硬化作用。     

P38 MAPK-BCL-xL途径参与低氧预适应减轻小鼠脑缺血性损伤

目的 探讨P38丝裂原激活蛋白激酶(P38MAPK)-BCL-xL抗凋亡途径在低氧预适应(HPC)保护小鼠缺血脑组织中的作用。方法 SPF级雄性BALB/c小鼠(18～22g,8～10w)随机分为4组：常氧假手术(NS),常氧缺血(NI),HPC假手术(HS)和HPC缺血(HI)组。利用小鼠整体HPC模型、脑中动脉梗塞(MCAO)致脑皮层局部缺血模型及P38MAPK抑制剂SB203580的干预,用原位末端标记法(TUNEL) 观察神经细胞凋亡;用蛋白印迹(Western blot)检测抗凋亡蛋白BCL-xL的表达;用免疫沉淀技术探讨BCL-xL与P38MAPK之间的相互作用。结果 HPC可明显减少缺血皮层半影区内神经细胞凋亡数量,提高半影区线粒体内BCL-xL蛋白水平;侧脑室注射P38MAPK抑制剂SB203580可消除HPC在缺血半影区内的抗凋亡作用;免疫沉淀结果提示,BCL-xL与P38MAPK可能存在直接相互作用。结论 HPC可能通过P38MAPK-BCL-xL抗凋亡途径实现对缺血脑组织的保护作用。     

应用改良的免疫胶体金包埋方法检测p38蛋白激酶在Raw细胞中的定位

目的:采用两种包埋方法Lowicryl K4M低温包埋和改良Spurr包埋,观察p38在Raw264.7细胞中的免疫电镜定位,摸索出一种操作简单、适用于南方潮湿多雨天气的免疫电镜包埋方法。方法:分别采用低温包埋剂Lowicryl K4M和改良Spurr树脂包埋两种方法,经包埋后染色,观察p38蛋白激酶在Raw264.7中的超微结构分布。结果:改良Spurr树脂包埋后结果显示,未受刺激的及EGF刺激的Raw264.7中,p38在胞浆和胞核中金颗粒弥散在细胞的各个部分,受到LPS刺激后,细胞核区的金颗粒明显增多,而胞浆区域的金颗粒显著减少,观察到的Raw细胞超微结构清晰、免疫胶体金定位准确,与低温包埋剂Lowicryl K4M包埋结果完全一致。结论:相对于Lowicryl K4M,Spurr树脂价格低廉,粘度低、抗湿性能好、切割性能佳、操作简单,是一种适用于南方潮湿多雨天气的免疫电镜包埋剂,可以替代低温包埋剂Lowicryl K4M。