Genistein对兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的　探讨染料木黄酮 (genistein)对体外培养的兔晶状体上皮细胞增殖的影响。方法　用不同浓度的 genisteinDMSO溶液处理常规培养的第 3代兔晶状体上皮细胞 ,采用细胞计数法以及MTT法检测对晶状体上皮细胞增殖的影响。结果　 12 .5mg·L-1genistein对晶状体上皮细胞增殖无显著影响 ,genistein在 2 5mg·L-1可显著抑制体外培养的兔晶状体上皮细胞的增殖 ,抑制率为 32 .86 % ,5 0mg·L-1genistein抑制率为 4 9.2 4 % ,10 0mg·L-1genistein抑制作用最强 ,抑制率达 70 .72 % ,且genistein在 2 5～ 10 0mg·L-1其抑制作用呈剂量依赖性。结论　genistein在浓度≥ 2 5mg·L-1时可显著抑制体外培养的兔晶状体上皮细胞的增殖 ,且呈剂量依赖性。提示genistein可能在临床防治后发性白内障中有所帮助。     

过氧化氢诱导的急性氧化应激对人晶状体上皮细胞形态、生存率及衰老标记蛋白30(SMP30)表达的影响

目的 探讨过氧化氢诱导的急性氧化应激对人晶状体上皮细胞形态、生存率及衰老标记蛋白30(senescence marker protein30,SMP30)表达的影响.方法 采用不同浓度过氧化氢(0μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1)处理人晶状体上皮细胞24 h,建立不同浓度急性氧化应激模型,通过光镜观察、MTT分析细胞形态、生存率,Western blot检测SMP30蛋白的表达情况.结果 不同浓度过氧化氢处理细胞24 h后,100 μmol·L-1处理组和200 μmol·L-1处理组细胞密度、生长活力下降,细胞形态改变,开始出现变圆变大的细胞,胞体拉长,边界不清;300 μmol·L-1处理组细胞密度明显降低,细胞出现破碎,溃解.随着过氧化氢浓度的增高,细胞生存率逐渐下降,各处理组与对照组(Oμmol·L-)间相比,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).在对照组及100 μmol·L-1处理组、200 μmol·L-1处理组晶状体上皮细胞SMP30蛋白相对表达量分别为0.273±0.055、0.464±0.058、0.442±0.050,100 μmol·L-1处理组、200 μmol·L-处理组SMP30蛋白的表达均较对照组提高,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05),100 μmol·L-1处理组和200 μmol·L-1处理组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在急性氧化应激状态下人晶状体上皮细胞形态改变,生存率下降,SMP30蛋白表达上调,SMP30蛋白可能参与晶状体上皮细胞急性氧化应激损伤过程.     

不同浓度17β-雌二醇对雌性大鼠晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的观察不同浓度17β-雌二醇对H2O2诱导的雌性大鼠晶状体上皮细胞凋亡的影响及其对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的调控,探讨不同浓度雌激素对晶状体上皮细胞凋亡的作用及其机制,为合理应用雌激素防治白内障提供实验依据。方法摘取健康成年雌性SD大鼠的透明晶状体48枚,随机分为6组培养:17β-雌二醇+H2O2组1、17β-雌二醇+H2O2组2、17β-雌二醇+H2O2组3、17β-雌二醇+H2O2组4、H2O2组以及空白对照组。除空白对照组外,其他组以终浓度为300μmol.L-1过氧化氢制作晶状体上皮细胞凋亡模型,并分别加入不同终浓度17β-雌二醇干预,17β-雌二醇+H2O2组1至4的17β-雌二醇干预浓度分别为1×10-8mol.L-1、1×10-7mol.L-1、1×10-6mol.L-1、1×10-5mol.L-1。于细胞恒温培养箱中孵育24h后,撕取各组晶状体前囊及赤道部囊膜铺片,采用TUNEL法检测晶状体上皮细胞凋亡率,免疫组织化学SP法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的阳性表达率。结果 TUNEL法检测晶状体上皮细胞凋亡率结果显示:17β-雌二醇+H2O2各组晶状体上皮细胞凋亡率(0.4508±0.0203、0.4245±0.0196、0.4077±0.0163、0.3770±0.0205)均显著低于H2O2组(0.9048±0.0186),差异均具有显著统计学意义(均为P=0.000),并且与17β-雌二醇的浓度呈负相关。免疫组织化学SP法检测Bcl-2及Bax阳性表达率结果显示:在空白对照组晶状体上皮细胞中,Bcl-2和Bax均有表达,且Bcl-2的表达(0.8907±0.0190)远较Bax表达(0.0777±0.0234)强;H2O2可明显降低Bcl-2表达(0.0930±0.0110),提高Bax表达(0.9248±0.0238);与H2O2组比较,17β-雌二醇可明显提高Bcl-2表达(0.5662±0.0564、0.5872±0.0441、0.6212±0.0548、0.6682±0.0568),降低Bax表达(0.4677±0.0352、0.4472±0.0451、0.4077±0.0154、0.3587±0.0310),差异均有显著统计学意义(均为P=0.000)。结论 17β-雌二醇对H2O2诱导的离体培养雌性大鼠晶状体上皮细胞的凋亡有抑制作用,此抑制作用在一定范围内与17β-雌二醇的浓度呈正相关;对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的调控可能是17β-雌二醇抑制晶状体上皮细胞凋亡的分子机制之一。     

LY294002对bFGF诱导的兔晶状体上皮细胞增生的影响

目的探讨LY294002对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的兔晶状体上皮细胞（LECs）增生的影响。方法兔眼LECs经培养后,将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002分别加入LECs培养基中培养48h为LY294002组。另将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002＋bFGF（10mg／L）加入培养基中培养LECs48h。bFGF（10mg／L）诱导LECs增生48h为阳性对照组,空白对照组仅用无血清DMEM。MTT比色法测定吸光度（A）值,分析各组药物对LECs增生的抑制率,流式细胞仪检测各细胞周期的LECs百分率。结果bFGF组与空白对照组相比A值升高,LY294002组随着药物浓度的增加,4值明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）。bFGF＋LY294002组与LY294002组相比,A值下降更明显,差异有统计学意义（P〈0．01）。流式细胞仪分析LY294002对LECs的抑制作用与MTT呈现相同趋势,随着LY294002浓度的增加,处于G0／G1期的LECs逐渐增加（P〈0．01）,而S期和G2／M期逐渐减少。结论LY294002可明显抑制体外培养的bFGF诱导的兔LECs的增生,并呈剂量依赖关系,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

罗格列酮对高糖诱导视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的 探讨罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对高糖诱导视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)损伤的保护作用.方法 体外培养大鼠RGC细胞株RGC-5细胞,50 mol·L-1葡萄糖孵育细胞诱导损伤.应用CCK-8法测定并计算细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡,全自动氨基酸分析仪测定细胞谷氨酸(glutamic acid,Glu)释放量,测定细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性.结果 高糖(50 mol·L-1)以时间依赖的方式抑制了RGC-5细胞的生长,高糖处理24 h、48 h和72 h生长抑制率分别为(22.37±3.49)％、(42.18±6.34)％和(57.33±5.39)％(均为P ＜0.05);与高糖组比较,高糖+不同浓度RSG组(0.1×10-6 mol·L-1、10-6 mol·L-1、10×10-6 mol·L-1)处理48 h以剂量依赖的方式降低了高糖诱导的RGC-5细胞生长:生长抑制率高糖组(42.18±6.34)％,高糖+不同浓度RSG组分别为(35.66±4.73)％、(27.35±4.15)％和(25.17±3.42)％(均为P＜0.05).与对照组比较,高糖处理24 h、48 h和72 h以时间依赖的方式促进了细胞凋亡(均为P＜0.05);与高糖组比较,高糖+不同浓度RSG组(0.1×10-6 mol·L-1、10-6 mol·L-1和10×10-6mol·L-1)处理48 h以剂量依赖的方式降低了高糖诱导的RGC-5细胞凋亡:高糖组凋亡率为(31.55±5.34)％,高糖+不同浓度RSG组分别为(23.75±3.72)％、(18.75±2.17)％和(17.53±3.05)％(均为P＜0.05).与对照组比较,高糖组Glu释放量显著增加:2组分别为(85.64±12.75)μg·L-1和(246.84±33.48)μg·L-1(P＜0.05).与高糖组比较,高糖+不同浓度RSG(0.1×10-6mol·L-1、10-6 mol·L-1和10×10-6mol·L-1)处理48 h组Glu的释放以剂量依赖的方式减少:高糖组Glu释放量为(246.84 ±33.48)μg·L-1,高糖+不同浓度RSG组分别为(175.34±23.69)μg·L-1、(117.25±18.76) μg·L-1和(109.34±15.54) μg·L-1(均为P＜0.05).与对照组比较,高糖组SOD活性显著降低:分别为(3.06±0.38) kU·g-1和(0.56±0.07)kU·g-1(均为P＜0.05),而MAD水平显著增加:分别为(5.67±0.76) μmol·g-1和(37.64±4.37) μmol·g-1(均为P＜0.05).与高糖组相比较,高糖+不同浓度RSG处理48 h组细胞中SOD活性以剂量依赖的方式增加(均为P＜0.05),而MAD水平显著降低(均为P＜0.05).结论 RSG抑制了高糖诱导的RGC损伤,其机制与RSG减少了RGC中Glu的释放和抑制氧化应激有关.     

17-β雌二醇对H2O2诱导氧化损伤的晶状体上皮细胞的保护作用

目的 探讨17-β雌二醇对H2O2诱导氧化损伤的晶状体上皮细胞的保护作用.方法 将体外培乔的晶状体上皮细胞分为4组;空白对照组:以正常培养液培养;H2O2损伤组:给予培养融合状态达到80％的晶状体上皮细胞每孔加入100μmol·L-1H2O2,作用12 h;17-β雌二醇低浓度组:用10 μmol·L-1 17-β雌二醇孵育细胞24h后,加入H2O2作用12 h;17-β雌二醇高浓度组:用100 μmol·L-117-β雌二醇孵育细胞24 h后,加入H2O2作用12 h.通过CCK-8法测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光探针标记法测定细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),使用721 D分光光度计测定细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)含量.结果 H2O2损伤组晶状体上皮细胞经氧化损伤处理后,细胞存活率明显下降,与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).与H2 O2损伤组(59.34％)相比,17-β雌二醇低浓度组和高浓度组晶状体上皮细胞存活率分别提高到67.44％和78.52％,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).H2O2诱导损伤后,H2 O2损伤组晶状体上皮细胞凋亡率为(41.30±3.21)％,空白对照组为(1.67±0.32)％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.0I).17-β雌二醇低浓度组和高浓度组晶状体上皮细胞凋亡率分别为(20.97±1.13)％和(14.27±0.90)％,与H2 O2损伤组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).采用H2 DCFDA荧光探针检测胞内ROS变化情况,H2 O2损伤组细胞内ROS表达明显升高,DCF荧光信号明显增强,ROS主峰向基线右侧移位;17-β雌二醇低浓度组和高浓度组荧光信号强度逐渐减弱,ROS主峰向基线左侧移位.H2O2损伤组晶状体上皮细胞内CAT、SOD及GSH-Px含量均降低,与空白对照组相比差异均有统计学意义(均为P＜0.05);17-β雌二醇低浓度组和高浓度组CAT、SOD及GSH-Px含量较H2O2损伤组均逐渐升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 17-β雌二醇对H2 O2诱导损伤的晶状体上皮细胞具有明显的保护作用.     

miR-34a/SIRT1在H2O2诱导人晶状体上皮细胞氧化应激中的表达

目的 观察微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)和沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)在不同浓度H2O2诱导的人晶状体上皮细胞(SRA01/04细胞)氧化应激中的表达变化.方法 用不同浓度的H2O2(0μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、400 μmol·L-1)处理细胞24 h后,用CCK-8检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和RT-PCR检测miR-34a/SIRT1的表达.结果 CCK-8检测结果显示:100～400 μmol·L-1 H2O2对SRA01/04细胞有增殖抑制作用,且呈剂量依赖关系,与0μmol·L-1 H202组相比差异均有统计学意义(均为P＜0.01);流式细胞仪凋亡检测结果显示:0μmol·L-1 H2O2组细胞凋亡率为(6.1±1.2)％;100 μmol·L-1、200μmol·L-1、300 μmol·L-1 H2O2组细胞凋亡率分别为(26.3±1.8)％、(32.5±2.2)％、(64.7±5.3)％,各组与0μmol·L-1H2O2组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).RT-PCR检测结果显示:不同浓度H2 O2处理SRA01/04细胞后,细胞中的miR-34a表达水平呈剂量依赖性升高,而SIRT1表达水平呈相应下降,与0μmol·L-1 H2O2组相比差异均有统计学意义(均为P ＜0.001).结论 在一定浓度H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激中,miR-34a表达水平显著增加,而SIRT1表达水平显著下降.下调miR-34a表达可增加氧化应激人晶状体上皮细胞存活率.     

尾加压素Ⅱ对人晶状体上皮细胞一氧化氮合成的影响

目的探讨新型生物活性物质尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ,U-Ⅱ)对人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)内一氧化氮合酶(nitric oxide sythase,NOS)活性及一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的影响。方法用不同浓度的U-Ⅱ(1×10-9mol.L-1、10×10-9mol.L-1、100×10-9mol.L-1)干扰体外培养的HLEC,采用化学比色法和硝酸还原酶法测定HLEC内NOS活性和NO含量。结果空白对照组、(1×10-9mol.L-1、10×10-9mol.L-1、100×10-9mol.L-1)U-Ⅱ组的NOS活力值分别为(3.407±0.168)U.mg-1、(4.058±0.169)U.mg-1、(4.921±0.298)U.mg-1和(5.598±0.897)U.mg-1;NO含量分别为(0.747±0.183)μmol.g-1、(1.238±0.232)μmol.g-1、(1.531±0.101)μmol.g-1、(1.850±0.114)μmol.g-1。与空白对照组相比,U-Ⅱ呈浓度依赖性增强细胞内的NOS活性,刺激NO合成,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。结论 U-Ⅱ可使HLEC内NOS活性增强和NO生成增多,提示U-Ⅱ可能通过NOS/NO途径促进HLEC增殖。     

LY294002联合奥曲肽对bFGF诱导的兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的　探讨ＬＹ２９４００２联合奥曲肽对碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ｂＦＧＦ）诱导的兔晶状体上皮细胞（ｌｅｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ,ＬＥＣｓ）增殖的影响。方法　兔眼ＬＥＣｓ经原代和传代培养后,共分为４组:空白对照组、增殖对照组、实验药物组、增殖药物组。空白对照组使用仅含无血清ＤＭＥＭ培养;增殖对照组使用加ｂＦＧＦ（１０ｍｇ·Ｌ－１）的无血清ＤＭＥＭ;实验药物组培养时在不加ｂＦＧＦ增殖的情况下分别单独应用１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ＬＹ２９４００２、单独应用１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１奥曲肽和联合应用１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ＬＹ２９４００２与１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１奥曲肽来培养;增殖药物组在加ｂＦＧＦ增殖的情况下分别单独应用１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ＬＹ２９４００２、单独应用１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１奥曲肽和联合应用１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１ＬＹ２９４００２和１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１奥曲肽进行细胞培养,每组重复５次。各组分别培养４８ｈ。ＭＴＴ比色法测定吸光度（Ａ值）分析各组细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测各周期细胞的百分率。结果　增殖对照组与空白对照组相比,吸光度Ａ值升高（Ｐ＜０．０５）;实验药物组中各组分别与空白对照组相比,吸光度Ａ值均有不同程度下降（均为Ｐ＜０．０５）;增殖药物组中各组分别与增殖对照组相比,吸光度Ａ值明显下降（均为Ｐ＜０．０５）;生长抑制率与吸光度Ａ值趋势相同。经流式细胞仪分析,实验药物组中联合用药组与两个单独用药组相比Ｇ０／Ｇ１期细胞比例增高,Ｓ期细胞比例降低（均为Ｐ＜０．０５）;增殖药物组中,联合用药组与两个单独用药组相比也出现Ｇ０／Ｇ１期细胞比例增高,Ｓ期细胞比例降低（均为Ｐ＜０．０５）。结论　ＬＹ２９４００２联合奥曲肽较单独用药对ＬＥＣｓ的增殖抑制作用更强。这为临床筛选药物防治后发性白内障提供依据。     

r-tPA对兔眼晶状体上皮细胞影响的实验研究

目的　研究体外细胞培养中基因重组的组织纤维蛋白溶解酶原激活物(recombination tissue plasminigen activator,r- t PA)对兔晶状体上皮细胞增殖的抑制作用及有效浓度 ,为晶状体后囊混浊的药物预防提供新线索。方法　首先进行兔晶状体上皮细胞的原代与传代培养。传代培养的兔晶状体上皮细胞分为 6个实验组 ,分别加入 2 mg· L- 1 、4mg·L- 1 、8mg· L- 1 、16 mg· L- 1 、32 m g· L- 1 的 r- t PA,设空白对照组 ,在加药后不同时间进行细胞计数 ,3H- TDR掺入实验 ,研究 r- t PA对晶状体上皮细胞增殖的影响。结果　 r- t PA对体外培养的兔晶状体上皮细胞的增殖有显著抑制作用 ,呈浓度依赖性改变。 4mg· L- 1 r- t PA已有显著抑制作用 ,16 mg· L- 1基本发挥最大作用。结论　 r- t PA能有效抑制体外培养晶状体上皮细胞的增殖 ,通过进一步在体研究 ,可能成为预防后囊膜混浊的理想药物