全蝎的酶解工艺研究

目的以全蝎为研究对象,优选胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解全蝎的工艺条件,用抗肿瘤药效验证提取工艺的可行性.方法以丙氨酸含量为指标,以酶解温度、时间和酶底比为考察因素,用正交试验设计法筛选酶解的最佳工艺条件,并用凯氏定氮法测定此条件下的蛋白质的水解率.结果确定酶解工艺为:全蝎先用40℃人工胃液加入2.5%(酶底比)胃蛋白酶酶解4 h,残渣转入53℃人工肠液加入5.0%胰蛋白酶酶解4 h.用凯氏定氮法测得此条件下的蛋白质的水解率可达80.7%.结论经抗肿瘤药效验证,全蝎酶解提取物对肝癌H22有明显的抑癌活性,酶提物的抑瘤作用强于全蝎原粉.     

全蝎抗凝活性成分的研究

目的研究全蝎提取液抗凝活性成分。方法以紫外分光光度法测其抗凝蛋白含量,以凝血酶时间(TT)为指标,以提取次数、提取工艺、加热时间、反复冻融及酸碱度考察全蝎提取液抗凝活性成分的稳定性。结果其凝血酶时间与蛋白质含量呈正比关系(γ=0.9988),全蝎以提取2次为宜,对热的稳定性较差,与冻融的次数无关(P>0.05),易受pH的影响,经酸碱处理后的TT有所降低P(<0.05),在3种提取工艺中,冷浸液的活性最强(P<0.01)。结论全蝎提取液的抗凝活性成分易受提取次数、提取工艺、受热时间及pH的影响。     

几种无机阳离子对全蝎抗凝活性的影响

目的研究全蝎中无机阳离子对全蝎抗凝活性的影响。方法以凝血酶时间为指标,分别在全蝎提取液中加入相应不同浓度的无机阳离子,考察其对全蝎抗凝活性的影响。结果加入无机阳离子后,明显缩短了全蝎的凝血酶时间(P<0.01)。结论铵离子等无机阳离子对全蝎提取液抗凝活性有明显的影响。     

全蝎不同部位抗凝活性的比较研究

目的 采用不同提取方法比较全蝎不同部位的抗凝活性.方法 用凝血酶时间(TT)为指标,测定全蝎不同部位水提醇沉和冻融法提取液的抗凝血活性.结果 水提醇沉法全蝎凝血酶时间长于冻融法,两种提取方法中,各部位的凝血时间比较是蝎尾>蝎全体>蝎身.结论 全蝎抗凝活性成分提取方法中水提醇沉优于冻融法,抗凝活性成分主要集中于蝎尾.     

核桃粕蛋白提取工艺优化及其酶解产物活性研究

[目的]利用响应面法优化核桃粕蛋白提取工艺,并评价其木瓜蛋白酶解物的体外抗氧化活性,为核桃粕后续开发利用提供参考价值。[方法]采用碱溶酸沉法,以蛋白提取率为响应值,结合单因素及响应面实验探讨氢氧化钠（NaOH）浓度、液料比、提取温度及时间对核桃粕蛋白提取率的影响,优化核桃粕蛋白提取工艺,并利用体外抗氧化实验评价了木瓜蛋白酶解物的活性。[结果]响应面法优化的核桃粕蛋白提取工艺为：80∶1的0.04% NaOH溶液、65℃下提取1 h,平行实验的结果为36.01%,与预测值35.27%较接近,说明该工艺真实可靠、简单可行。核桃蛋白木瓜蛋白酶解物具有一定的清除DPPH、OH自由基及还原能力,可为后续的核桃粕保健食品开发与工业化生产提供方法及参考意义。[结论]优化了一种核桃粕蛋白提取工艺,并为核桃粕的综合开发及利用提供了重要的参考价值。     

仿生酶解法制备抗凝活性土鳖虫工艺研究

目的研究仿生酶解法水解土鳖虫的条件。方法以APTT和PT为指标,单因素考察仿生酶解法制备土鳖虫的工艺条件。结果土鳖虫酶解条件为：土鳖虫先用37℃人工胃液加入4%（酶底比）胃蛋白酶水解4h,再于人工肠液中加入4%胰蛋白酶水解3h。结论仿生酶解法适于提取具有抗凝活性的土鳖虫。     

褐藻糖胶及其与胶原复合物的体外抗凝血活性研究

用FTIR、UV对从海带中提取的褐藻糖胶结构进行了分析。采用部分凝血活醇时间、凝血酶原时间和凝血醇时间作为评价标准，对其体外抗凝血活性作了初步的评价，并与肝素的抗凝血活性作比较。结果表明：褐藻糖胶具有类似肝素的多糖结构，具有较好的抗凝血活性，但低于肝素。将褐藻糖胶固定于胶原上，所得的胶原-褐藻糖胶复合物仍具有一定的抗凝血活性。     

发酵全蝎粉杀酶前后各活性部位蛋白含量及抗癌活性研究

目的比较发酵全蝎粉杀酶前后各活性部位蛋白含量及对肺腺癌细胞（A549）的抑制作用。方法发酵全蝎粉经超声提取,杀酶后通过超滤、冻干浓缩后,浓缩液用MTT法测定对肺腺癌细胞（A549）的抑制率。结果用单因素方差分析比较组间差异,发酵全蝎粉杀酶前后分段蛋白对A549的抑制率与空白对照组有显著性差异,P<0.01。结论发酵全蝎粉杀酶前后均有一定的抗肿瘤作用,发酵全蝎粉杀酶前后均为寡肽类小分子蛋白抗肿瘤活性最强。杀酶后3K Da-30K Da段蛋白抗肿瘤活性有所增强,<3K Da段蛋白抗肿瘤活性有所减小,>30K Da段蛋白抗肿瘤活性无明显变化。     

磷酸二酯酶及其活性调节

磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)通过水解环核苷酸的3’磷酸酯键灭活cAMP/cGMP来控制细胞内cAMP/cGMP信使分子的浓度,参与调控哺乳类动物的记忆与学习、视觉、嗅觉、血小板聚集、醛固酮合成、胰岛素分泌、T细胞活化、阴茎勃起、生殖及生长等生理过程。本文就PDEs的分类、结构、组织分布、亚细胞定位及其活性调节研究进展综     

人血浆中MBL-MASP复合物的纯化与分离

目的 从人血浆中分离纯化甘露聚糖结合凝集素(MBL)和MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASP)。方法 用非活化Sepharose4B两步亲和层析纯化MBL-MASP复合物,再以SephacrylS-300柱凝胶过滤将MBL和MASP分离。在纯化MBL-MASP复合物的整个过程中,除凝胶过滤缓冲液外,均加入丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟(PMSF)和金属蛋白酶抑制剂1,10-邻二氮杂菲(1,10-phenanthroline),并控制温度在4 ℃。结果 获得高度纯化的MBL和酶原形式的MASP。SDS-PAGE和Westernblotting表明所纯化的MBL相对分子质量为28000和32000肽链构成的功能性多聚体;配体结合测定和酵母菌凝集试验证实所纯化的MBL具有生物学活性。结论 建立了一种比较简便的同时分离纯化MBL和MASP酶原的方法。     

聚—（羟丙基、丙基）—天冬酰胺材料体外酶解及植入小鼠体内的观察

目的：观察4种不同摩尔比的聚－（羟丙基、丙基）－天冬酰胺材料在体外酶解和植入小鼠体内后的变化。方法;用木瓜蛋白酶和胰酶对材料作了体外酶解试验,用凝胶色谱法对降解物碎片作了测定;用光镜、扫描电镜、透射电镜等对材料在埋植部位、肝、肾组织内的降解碎片进行观察;对材料植入小鼠体内后的生化指标（血红蛋白、白细胞、谷丙转氨酶、肌酐作了测定。结果：聚－（羟丙基、丙基）－天冬酰胺材料在体外能被逐步酶解。在植入小鼠体内的5周内,在埋植部位、肝、肾组织内能观察到材料的碎片。结论：聚－（羟丙基、丙基）－天冬酰胺材料能在体内、外逐步降解,植入小鼠体内后对动物的血象、肝、肾功能无明显的影响,具有生物相容性。     

桑叶多糖SDS-1和SDT-1的系统分离纯化

对桑叶水提取的粗多糖在离子交换纤维素上的吸附量进行了考察,然后利用离子交换纤维素柱色谱将粗多糖分为4个电荷性质不同的亚组分SD0、SD0.1、SD0.2、SD0.3。通过桑叶粗多糖在离子交换纤维素的吸附解吸行为可知,桑叶多糖主要以酸性多糖的形式存在。其中主要组分SD0.2进一步采用Sephacryl S-200凝胶介质进行纯化,采用苯酚-硫酸法和高效凝胶过滤色谱法同时进行检测,得到均一多糖SDS-1和SDT-1。SDS-1的Mw=8.9×104,Mn=7.5×104,分散度D=1.18;SDT-1的Mw=1.54×104,Mn=1.42×104,D=1.08。     

Purification and characterization of anti-clotting protein component （ACPF-7221） from venom of Agkistrodon acutus

Background Snake venom contains a number of components with different pharmacological and biological activities, especially in cancer therapy, and has increasingly become a research focus. This study was designed to isolate and purify a novel anti-clotting protein component from the venom of Agkistrodon acutus, and to explore its physico-chemical properties and biological activity. Methods The venom of Agkistrodon was isolated and purified by ion-exchange chromatography on diethylaminoethyl （DEAE）-Sepharose Fast Flow, molecular sieve filtration through Sephadex G75, SP-Sepharose Fast Flow and molecular sieve filtration through Sephadex G50. We detected the activated partial thromboplastin time （APTT） of the eluant to select the anti-clotting protein component of interest. The molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrphoresis （SDS-PAGE） and liquid chromatography. Its protein content was detected by bicinchoninic acid （BCA）. Results SDS-PAGE vertical gel electrophoresis showed that the anticoagulant factor is a tripolymer composed of three proteins whose molecular weights are 25 KDa, 30 KDa and 50 KDa. The factor contains about 65% percent protein. Conclusions A novel anti-clotting protein component was purified by ion-exchange chromatography and molecular sieve filtration from the venom of Agkistrodon acutus and was found to be composed of three kinds of proteins.     

血管活性肠肽在关节炎关节软骨中的表达及临床意义

目的:探讨血管活性肠肽(VIP)在不同退变程度骨关节炎软骨中的表达,及其与骨关节炎发病以及软骨退变程度的关系,为临床防治提供思路.方法:选取中南大学湘雅医院骨科进行关节置换的骨关节炎患者关节软骨标本26个,另选取因外伤行截肢的膝关节软骨或股骨颈暴力骨折的股骨头正常关节软骨标本10个为对照组,根据大体观察凿取正常和OA不...     

异丙酚预处理对脂多糖（LPS）诱导的人肺微血管内皮细胞（HPMVCs）血管紧张素转化酶（ACE）的表达与活性的影响

 目的 在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMVCs)损伤模型中,观察异丙酚预处理对血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)的影响,探讨异丙酚肺保护作用的可能机制。方法 以体外培养的HPMVCs 3~5代作为实验对象,将细胞随机分为4组(n=8)：对照组(C组)、异丙酚组(P组)、LPS组(L组)和异丙酚预处理组(P+L组)。药物终浓度：LPS 5 μg/mL,异丙酚50 μmol/L。按上述分组,加入LPS前1 h加入异丙酚。于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。分别培养12、24、48、72 h后采用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)法测细胞活力。细胞孵育12 h后,采用改良分光光度法检测各组培养液和细胞中的ACE活性,real-time PCR检测ACE、TNF-α、IL-1β和MCP-1 mRNA表达水平,同时ELISA测定细胞培养液中TNF-α、IL-1β和MCP-1的蛋白含量。结果 (1)各组细胞在72 h内的细胞活力无显著差异(P>0.05);(2)与C组相比,P组各检测指标均无显著差异(P>0.05);(3)与C组相比,L组TNF-α、IL-1β和MCP-1的蛋白含量及其基因表达水平均显著升高,分泌型ACE活性增加,细胞ACE活性降低,ACE mRNA表达下调(P<0.05);(4)与L组相比,P+L组分泌的TNF-α、IL-1β和MCP-1及其mRNA表达显著降低,细胞ACE活性增加,ACE mRNA表达上调(P<0.05),分泌型ACE活性不变(P>0.05)。结论 异丙酚在转录水平调节HPMVCs中ACE的表达,可能是异丙酚保护HPMVCs的作用机制之一。     

伴大豆球蛋白水解肽对灌喂大肠杆菌(E.coli)的小鼠肠道微生物区系和健康的影响

目的研究服用伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽的小鼠，灌喂E．coli后的健康状况，分析小鼠灌喂E．coli后24h,48h粪样微生物区系的变化。方法应用PCR—DGGE技术对小鼠粪棹微生物区系进行相似性分析；应用连续稀释PCR的方法检测小鼠灌喂E，coli后24h，48h粪样中细菌的数量；同时观察小鼠灌喂E．coli后的健康状况。结果小鼠灌喂E．coli后24h，盐酸彻底水解伴大豆球蛋白液组（HCLFHC）和灌菌对照组（CON）的相似性较高（71．5％），伴大豆球蛋白组（Conglycinin）和伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽组（PTC）与正常对照组（CONN）的相似性都较高（分别为82．4％和72．9％）；灌喂E．coli后48h，CONN组和CON组的相似性不高（59．6％）。PTC组和CONN组的相似性较高（73．7％），PTC组和Conglycinin组、HcL—FHC组、CON组的相似性都不高（分别为51．4％、563％、48．1％），PTC组小鼠粪中细菌的数量明显低于CON组和HCL—FHC组．同时PTC组健康小鼠的数量明显多于其它处理组。结论伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽能维持肠道健康的微生物区系。降低肠道细菌的数量，维持感染E．coli后小鼠的健康。     

舟山眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化、理化及酶学性质

目的 从舟山眼镜蛇蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶(LAO),测定其理化和酶学性质.方法 应用Sephadex G-100凝胶色谱和POROS CM20离子交换色谱分离纯化LAO;Wellner和Lichtenberg法测定LAO活力,SDS-PAGE法测定相对分子质量.结果 舟山眼镜蛇蛇毒经Sephadex G-100凝胶色谱和两次POROS 20离子交换色谱后,获得LAO纯品(暂定名NA-LAO).NA-LAO在非还原和还原条件下相对分子质量均为58 kD左右;其反应最适pH为8.0,最适温度为60℃,对L-苯丙氨酸的米氏常数(Km)为3.08 mmoL/L.结论 应用凝胶过滤色谱和离子交换色谱可从舟山眼镜蛇毒中分离纯化LAO.     

吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的色胺酮类抑制剂筛选及其体外抗肿瘤作用

 目的  评价色胺酮衍生物吲哚胺2,3-双加氧酶 (indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的抑制活性,并研究其作为 IDO 抑制剂的抗肿瘤作用。方法  采用基因工程手段表达、纯化重组人 IDO (rhIDO),建立 IDO 活性检测体系;以色胺酮衍生物作为对象,进行 IDO 抑制活性初筛,对抑制类型、半数抑制浓度以及抑制常数进行测定;构建高表达人 IDO 的 pcDNA3.1(+) hIDO 转染 HEK 293 细胞,评价色胺酮衍生物在细胞水平上的 IDO 抑制活性;采用 MTT 比色法考察色胺酮衍生物3对人非小细胞肺癌A549细胞的生长抑制作用。结果  6个被测色胺酮衍生物均具有IDO抑制活性,且细胞水平上的抑制效力高于酶活水平,抑制效力均优于目前通用的IDO抑制剂1 甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT)。色胺酮衍生物 3 作为最强的 IDO 抑制剂,其Ki值为 0.161 μmol/L。MTT 实验结果显示,色胺酮衍生物3 显著抑制 A549 细胞生长,IC50 为 8.77 μmol/L。结论  色胺酮衍生物是一类新型高效的 IDO 抑制剂,在体外对 A549 细胞具有较强的抗肿瘤活性。