IgA肾病肾阴虚证cDNA文库的构建

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人IgA肾病肾阴虚证cDNA消减文库。方法选择IgA肾病且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用TrizolBD法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaⅠ酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,然后将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建IgA肾病肾阴虚证消减文库。结果用SSH方法筛选出了IgA肾病肾阴虚证的差异cDNA片段,其中正向消减文库共获得325个阳性克隆,反向消减文库获得306个阳性克隆,从而成功地构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA消减文库。结论SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段,成功构建了IgA肾病肾阴虚证的cDNA文库,为进一步克隆肾阴虚证的相关基因奠定了基础。     

慢性肾炎肾阴虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交(SSH)技术构建汉族人慢性肾炎(CGN)肾阴虚证cDNA消减文库。方法:选择汉族人CGN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建CGN肾阴虚证消减文库。结果:用SSH方法筛选出了CGN肾阴虚证的差异cDNA片段,得到了386个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了CGN肾阴虚证的cDNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建CGN肾阴虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆CGN肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

人毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因cDNA文库的构建

目的 构建毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的消减cDNA文库。方法 分别提取凝集性生长和非凝集性生长状态下毛乳头细胞中的总RNA，应用SMART cDNA合成技术和抑制性消减杂交技术分离毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因的cDNA片段并建立消减cDNA文库；利用PCR对随机挑选的100个白色菌落进行插入片段的验证，对其中证实有插入片段的30个克隆进行cDNA斑点杂交验证。结果 所构建的消减cDNA文库扩增后得到320个阳性克隆，随机挑选的100个阳性克隆中95％的均有长度在100—600bp的插入片段，cDNA斑点杂交验证显示27个(90．0％)克隆为阳性。结论 结合SMART cDNA合成技术，应用抑制性消减杂交成功地构建了毛乳头细胞凝集性生长差异表达基因消减cDNA文库，为进一步筛选和克隆毛乳头细胞凝集性生长相关基因奠定了基础。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的：采用消减抑制杂交技术,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况,分离食管癌相关基因片段,构建食管癌的消减cDNA文库。方法：以食管癌组织为测试子（tester),以正常食管粘膜组织为驱赶子（driver),用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建食管消减cDNA文库。结果：用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段,经蓝白斑筛选,得到220个白色克隆;再用PCR方法快速筛选出100个两分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R 的阳性重组质粒100个,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论：构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆,对于消减文库的构建具有重要意义。     

经前期综合征肝气逆证猕猴脑组织差减cDNA文库的构建

构建经前期综合征（PMS）肝气逆证猕猴与正常猕猴大脑边缘系统正向与反向差减文库,并对猕猴cDNA文库进行了系统测序和分析,以期筛选出与PMS肝气逆证相关的基因,尤其是与PMS肝气逆证有关的一些神经递质、性激素受体的基因。差减文库构建成功,为弄清PMS肝气逆证差异表达基因奠定了基础。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的克隆和鉴定大剂量辐射前后大鼠空肠上皮细胞IEC-6差异表达基因,为探索肠上皮细胞辐射损伤修复的分子机制提供线索.方法IEC-6细胞经35Gyγ射线照射后由抑制性消减杂交(SSH)方法和T/A克隆技术进行差异表达基因消减cDNA文库的构建,用反向Northerm杂交法对库中的EST序列进行筛选,挑取阳性克隆测序,和GenBank比对后挑选有限克隆进行正向Northerm杂交进行验证.结果扩增消减杂交cDNA文库得到约2 000个克隆,随机选取96个白色克隆进行PCR扩增,用反向Northern杂交法对库中的EST片段进行筛选得到15个阳性克隆,代表12个基因的转录产物,部分基因功能已经明确,涉及细胞骨架、细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面,另外还获得一新的cDNA序列.结论SSH法建立了IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库,一次获得多条差异显示EsT片段,基因种类涉及细胞骨架,细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面,这些基因可能在肠上皮细胞的辐射损伤反应中起重要作用.     

二烯丙基二硫诱导HT-29细胞差异表达cDNA文库的构建

目的:构建二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人结肠癌HT-29细胞差异表达cDNA文库,以期寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因。方法:用120μmol/L的DADS处理人结肠癌HT-29细胞,从DADS处理组及对照组HT-29细胞中提取poly A+RNA,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交(SSH)技术构建DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA消减文库,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果:成功构建具有高消减效率的DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,文库扩增得到了500个克隆,随机挑取100个制备质粒,酶切分析均得到150~1 300 bp大小插入片段,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论:建立了DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,为进一步寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因奠定了基础。     

cDNA文库的构建策略

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用．近年来，随着分子生物学技术的发展，cDNA文库构建方法有了很大改进和提高．就cDNA文库构建的方法作一综述，     

肾阴虚证的中医研究进展

＂五脏之阴气,非此不能滋＂,肾阴也。《中藏经》论述了其证候表现：＂肾生病,则口热舌干,咽肿,上气,……腰脊急痛,嗜卧,足下热而痛;病久不已,则腿痛,小便闭,……＂脑为髓之海＂、＂肾气通于耳,肾和则耳能闻五音矣＂、＂女子以肾为先天＂＂、胞络者,系于肾＂、＂命门者……女子以系胞。＂因此,肾阴虚证作为临床常见证候,多见于中医腰痛,眩晕,耳鸣耳聋,月经病,绝经前后诸症等。亦见于西医肾病、耳部疾患、高血压、妇科病中。近年来众多学者也利用中药的有效成分进行动物实验性肾阴虚证的研究,观察对客观指标的影响,并取得了一定的成果。     

肾虚证相关基因的研究

本文提出研究肾虚证的相关基因可以从单一病证入手，应用基因芯片、RDA方法、基因序列分析等现代分子生物学技术筛选肾虚证患者的差异基因，最后研究这些基因与肾虚证表型的内在联系，只有证实某些基因能对肾虚证的病理生理状态施加影响，才可确定此基因是肾虚证的相关基因。此研究思路与方法还可用于其他中医证候相关基因的研究。     

顺铂致小鼠卵巢功能早衰肝肾阴虚证机制研究

目的探讨化疗药顺铂(CDDP)致卵巢功能早衰(POF)肝肾阴虚证的机制。方法腹腔注射化疗药顺铂,观察小鼠一般状态、体重、皮表温度、卵巢排卵、生殖激素和cAMP的变化情况。结果顺铂腹腔注射后小鼠体重减轻,进食水量减少,尿量减少,体温升高,排卵明显受到抑制。其中3mg/kg给药组血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平降低,促卵泡生成激素(FSH)和黄体生成素(LH)水平升高,血浆环腺苷酸(cAMP)含量升高。结论腹腔注射法所造卵巢功能早衰肝肾阴虚证模型的发病机理与临床病理一致,生物学行为接近于实际症状,其中3mg/kg给药量小鼠的内分泌功能和生化指标变化特征与临床相似,是系统研究卵巢功能早衰肝肾阴虚证的适宜造模方法。     

滋肾生肝法治疗肝肾阴虚型更年期综合征临床研究

目的观察滋肾生肝法治疗肝肾阴虚型更年期综合征的临床疗效。方法将我院门诊480例肝肾阴虚型更年期综合征患者随机分为中药组与西药组,其中中药组240例给予自拟的中药,西药组240例接受雌孕激素周期疗法,给予谷维素、复合维生素及雌孕激素。观察两组用药前后的主要症状的改善情况,血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成激素（LH）的水平变化。结果中药组和西药组总有效率比较差异无统计学意义（P〉0.05）;在中医症候改善方面,中药组优于西药组（P〈0.05）;在激素水平变化方面,中药组与西药组比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论滋肾生肝法在改善肝肾阴虚型更年期综合征患者症状、内分泌方面具有优势,且无任何副作用。     

肾阴虚抑郁症大鼠模型的建立及评价

目的建立肾阴虚抑郁症大鼠模型。方法将50只大鼠随机分为正常组、单纯应激组、温燥组、甲状腺素组及激怒组;采用慢性温和不可预见性慢性应激建立抑郁症"病"模的同时,正常组、单纯应激组灌胃生理盐水,甲状腺素组灌胃甲状腺素,温燥组灌胃温燥药;激怒组采用长期激怒法并灌胃生理盐水。使大鼠在抑郁的基础上表现出一定的阴虚"证,"以大鼠一般状态、敞箱试验、液体消耗试验、血清雌二醇(E2)、睾酮(T)及血浆环腺苷酸(cAMP)、环鸟苷酸(cGMP)作为检测指标,对各模型进行比较。结果与正常组比较,各模型组的体质量、水平得分、垂直得分、中央格停留时间、糖水消耗、总液体消耗各指标测值减少,温燥组、甲状腺素组及激怒组普遍出现活动减少,大便干燥,毛湿无光泽,易惊怒以及血浆cAMP含量升高,其中甲状腺素组和激怒组大鼠血清E2、E2/T比值显著升高。结论甲状腺素合并应激抑郁模型所致的肾阴虚抑郁,更符合临床实际,简单易行,可作为肾阴虚抑郁症造模方法之一。     

原发性肝癌肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞的特征性差异基因

目的：探讨原发性肝癌肝肾阴虚证患者外周血单个核细胞的特征性差异基因。方法：选取肝肾阴虚证与非肝肾阴虚证肝癌患者作为研究对象,以肝肾阴虚证肝癌患者为试验组,以非肝肾阴虚证肝癌患者作为对照组;选用全基因组表达谱芯片,研究肝肾阴虚证的基因表达谱,并进行差异表达基因分析,基于GeneOntology（http：／／www．geneontology．org／）和KEGG（http：／／www．genome．jp／kegg／）数据库对差异基因进行功能（geneontology,GO）和通路（pathway）注释,并选取显著性差异基因构建共表达网络图。扩大样本量,运用实时荧光定量聚合酶链反应与蛋白质印迹法分别从mRNA及蛋白层面对显著性差异基因进行验证。结果：肝肾阴虚证组和非肝肾阴虚证组间存在差异基因表达特征图谱,获得差异表达的基因共615个。GO注释后,差异基因表达具有278个显著性功能差异,主要涉及跨膜转运、细胞周期停滞、细胞转录、诱导凋亡等。Pathway标记后,上调差异基因参与显著性信号转导通路16项,下调差异基因参与显著性信号转导通路10项,包括抗原加工与递呈转导通路、代谢途径转导通路、细胞周期转导通路、蛋白质输出转导通路等。用差异基因构建共表达网络图,筛选出3个显著性差异基因（SEC62[SEC62homolog（S．cerevisiae）]、CCNBl[cyclinB1]、BIRC3[baculovirallAPrepeat-containing3]）。扩大样本量进行验证,肝肾阴虚证肝癌患者SEC62、CCNBl、BIRC3基因的mRNA（P〈0．01）和蛋白（P〈0．01）表达水平均显著低于非肝肾阴虚证肝癌患者。结论：本研究从基因组学的角度反映出肝肾阴虚证肝癌患者与非肝肾阴虚证肝癌患者之间存在着差异表达基因,进一步证实了“证”是多基因在mRNA和（或）蛋白质水平发生改变并导致人体偏离正常状态的假说。     

Cloning and sequencing genes related to preeclampsia

PreeclamPsia is a major cOmPlication of humanpregnancies, affecting 5% to 7% of pregnant women. Itis among the most significant causes of maternal and fe-tal morbidity and mortality, clinically characterized bythe onset of hyPertension and proteinuria. The etiologyofpreeclampsia remains speculative1'l. The accumulatedevidences strongly suggest that failure or incompletetrophoblastic invasion(end of the first, beginning of thesecond trimester)of ti1e spiral arteries, resulting in nar-rowed sp…     

阴虚证动物模型诊断指标及分析

通过查阅现有关于阴虚证动物实验的文章,认为以往研究涉及肾阴虚、肺阴虚、脾阴虚、胃阴虚、肝阴虚,总结出阴虚动物模型的造模方法、一般观察状态、检测指标、药物反证.为评价阴虚动物模型提供参考,为建立更统一的评价体系提供思路.     

雄性激素不敏感综合征家系中可育与不育患者间的差异表达基因

目的利用抑制消减杂交方法筛选和鉴定某雄性激素不敏感综合征家系中1名可育患者与1名不育患者间的差异表达基因。方法分别以可育患者(MJ)和不育患者(ZGJ)的生殖器皮肤成纤维细胞(GSF)为实验方,构建正向和反向消减文库。通过菌落原位杂交、点杂交、Southern印迹法逐步筛选得到候选阳性克隆,利用Northern印迹法验证,并将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析。结果构建了这两名患者GSF的正向和反向消减文库,筛选得到反向消减文库中2个Northern阳性克隆,以及两文库中11个无Northern杂交信号、可能代表低丰度转录本的候选克隆。测序和同源性分析显示2个Northern阳性克隆分别与自家趋化素(autotaxin-t)基因和钙结合蛋白S100A6基因高度同源。结论以上2个Northern阳性克隆以及11个无Northern杂交信号的克隆可能代表两患者GSF的差异表达基因,有助于阐明雄性激素不敏感综合征家系中患者表型多样性及育性保留的分子机制。     

妊娠高血压综合征发病相关基因的克隆

目的 应用妊娠高血压综合征（妊高征）患胎盘研究其发病相关基因。方法 利用基于PCR的改良消减杂交技术，首先建立了该病相关的cDNA消减库。随机筛选出20个含有差异表达片段的克隆，经过反向点杂交，弃掉6个假阳性克隆，确定14个克隆为妊高征发病相关基因。结果 经过序列测定和同源性比较（BLAST），发现11个为已知基因，其中1号基因为necein家族基因；3个为新基因，这3个新基因已完成了全部插入片段的序列测定，并登录GenBank,登录号为AF232216，AF232217，AF233648。结论 妊高征患胎盘基因表达谱和正常妊娠胎盘相比，发生改变。这可能与妊高征的发病有关。