人血浆凝血酶原和异常凝血酶原的BA-ELISA法检测

应用与凝血酶原及异常凝血酶原有免疫交叉反应的非Ca(Ⅱ)依赖性抗人凝血酶原抗体,建立夹心BA-ELISA法,检测人血浆凝血酶原的最低浓度可达1ng/ml。血浆经皂土和柠檬酸钡吸附处理,除去纤维蛋白原和凝血酶原后,可用本法检出存留于血浆中的微量异常凝血酶原,并测得健康人血浆异常凝血酶原的均值为74.61±19.43ng/ml。本法操作简便,特异性强,重复性好。     

磁定量免疫层析法降钙素原试剂盒性能评估研究

目的:评价磁定量免疫层析法降钙素原(PCT)检测试剂盒的临床性能。方法:以梅里埃VIDAS PCT试剂盒为参比试剂,对PCT检测试剂盒进行精密度、线性范围、方法学一致性的比对研究。结果:PCT检测试剂盒批内低值和高值的变异系数(CV)分别为6.67%(0.49ng/ml)和4.39%(4.89ng/ml),总精密度为7.26%(0.48ng/ml)和4.74%(4.91ng/ml),满足精密度检测要求。试剂盒线性范围具有良好的线性梯度关系(r2=0.9989)。方法学比对试验结果显示,PCT试剂盒检测结果与VIDAS检测结果具有良好的相关性,相关系数r2=0.9668,临床参考值0.5ng/ml和2ng/ml的检测结果与VIDAS的符合率为94.5%和93.6%,表明两者具有很好的一致性。结论:PCT检测试剂盒与VIDAS试剂盒在临床应用上具有等效性,可用于临床诊断及疗效监控。     

卵清蛋白多克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的 建立卵清蛋白(ovalbumin,OVA)双抗体夹心ELISA检测方法并进行验证,用于定量检测鸡胚流感疫苗中的OVA含量。方法 建立双抗体夹心酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),对该方法的反应条件进行优化,确定定量范围及检测下限,并对重复性、特异性和准确度进行验证。结果 建立的方法最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为2.5μg/ml和0.5μg/ml,最适封闭液配方为1%BSA+1%蔗糖。该方法的cut-off值为0.134,线性范围为0.313-20.000ng/ml,定量下限为0.078ng/ml。重复性好,板内变异系数为3.428%~25.953%,板间变异系数为5.375%~ 27.614%。特异性好,准确度高,检测结果与试剂盒检测结果符合率为91.43%~102.96%。稳定性好,预包被的酶标板冻存于-20℃,半年内检测样本变异系数为1.976%~14.409%。结论 建立了快速、简便、低成本的OVA定量检测方法,可用于鸡胚流感疫苗中OVA定量检测。     

高灵敏酶联免疫分析法测定人脂肪细胞瘦素分泌

目的 建立高灵敏、特异的酶联免疫分析法测定人脂肪细胞瘦素的分泌.方法 制备兔抗人瘦素多克隆抗体和鼠抗人瘦素单克隆抗体,建立生物素一亲和素放大酶联免疫分析方法(BAELISA),观测原代培养的人网膜前脂肪细胞分化过程中瘦素的分泌及曲格列酮对其影响.结果 BA-ELISA方法灵敏度可达0.03 ng/ml,曲线工作范围0.05～5 ng/ml,批内批间变异系数分别小于7.4%和9.3%,平均回收率97.8%.测定经柱层析分离的混合人血清或脂肪细胞培养上清,仅显示单峰游离瘦素.观测到人网膜前脂肪细胞随诱导分化成熟而瘦素分泌量递增;10 umol/L曲格列酮可使瘦素的分泌峰值增加1倍.健康成人空腹血清瘦素水平女性显著高于男性(均值:7.6 ng/ml vs 3.2 ng/ml,P<0.001),与体重指数均有较强的相关性(r=0.61、0.67;P<0.001).结论 建立了高灵敏的BA-ELISA测定游离瘦素水平,尤其适于瘦素浓度低的临床血样本测定及基础研究之用.     

基于液质联用技术的抗化疗抗体大鼠体内定量分析方法研究

目的 建立准确、灵敏、可靠的液质分析方法对以单克隆抗体为代表的蛋白药物进行血药浓度测定和临床前药代动力学研究.方法 以抗化疗抗体(ACA-06)为模型药物,采取即时正交优化(OAO)策略建立选择反应监测(SRM)技术的定向质谱分析方法,并在此基础上对ACA-06大鼠体内药代动力学进行研究.结果 通过单次进样同时完成最优信号肽段选择和质谱条件的优化,根据OAO优化结果选定分别定位于ACA-06轻链和重链互补决定区(CDR)的2个高特异性、高灵敏度的肽段FSGVPDR和VNSAAFPAPIEK作为质谱检测的信号肽段.方法确证结果表明,本法在12.9~32250 ng/ml浓度范围内线性良好(r2:0.9819~0.9946),在血浆用量仅为2μl的情况下,定量下限为12.9 ng/ml.日内精密度(RSD)<11.5%,日间RSD<6%,准确度在-4.0%~4.3%之间.结论 本研究建立了LC/SRM-MS方法测定大鼠血浆中ACA-06,本方法特异、准确、灵敏,适用于ACA-06在大鼠体内的药代动力学研究.     

用建立的BA-ELISA检测尿毒症患者血清转铁蛋白的含量

过去检测人血清转铁蛋白(Transferrin,Tf)水平,常用总铁结合力(TIBC法)或环状单向免疫扩散法(SRID)进行。不仅用血量大,且方法繁琐,灵敏度差。为此,我们制备提纯了人血清Tf及兔抗人Tf抗体,建立了生物素-抗生物素蛋白-酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)检测Tf含量的方法,检测限量为0.8ng/ml,检测范围在1～120ng/ml。用于检测的血清样本以1:40000稀释,测得健康人(正常组n=40)血清Tf均值为3.02±0.32mg/ml,尿毒症患者(n=19)血清Tf均值为1.73±0.60mg/ml,明显低于正常组(P<0.001)。本法操作简便,灵敏度高,特异性强,血清量仅需10μl,适用于临床普查及对肾病患者的血清Tf含量的检测。     

应用时间分辨荧光免疫分析技术检测SARS病毒抗原的初步研究

目的 建立定量检测SARS冠状病毒N蛋白的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)。方法 采用经SARS-CoVN蛋白和配对实验筛选的两株抗SARSN蛋白单克隆抗体,以双抗体夹心法为基础建立检测SARS-CoVN抗原的时间分辨荧光免疫分析技术,进行方法学的评价,并与相应ELISA试剂盒进行比较。结果 该法的测量范围为(0.02~150)ng/ml,灵敏度为0.02ng/ml;批内、批间CV分别为(3.3~6.2)%和(5.3~9.6)%,与采用ELISA试剂盒检测灭活SARS-CoVN蛋白情况比较的结果一致。结论 本研究建立的检测SARSN蛋白的时间分辨荧光免疫分析技术灵敏度高,特异性好,具有潜在的临床应用价值。     

定量检测ProMBP双抗体夹心ELISA方法的建立

目的:建立定量检测ProMBP的双抗体夹心ELISA方法.方法:采用Protein A亲和层析法纯化自制的抗ProMBP单克隆抗体(mAb),并行SDS-PAGE和Western blot对纯化抗体特性进行鉴定;利用简易过碘酸钠法对抗ProMBP mAb进行标记辣根过氧化物(HRP)后行抗体配对实验;通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度;以纯化的妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)/ProMBP抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收性实验评价ELISA方法,初步对人血清中的ProMBP水平进行检测.结果:最佳配对组合为抗ProMBP mAb 4C6E5B9和HRP标记的抗ProMBP mAb 9G4A6G10,最适工作浓度分别为2.5 μg/ml和1:3 000,该方法的批内、批间变异系数分别为4.6%～6.2%和4.6%～10.5%,灵敏度达2.0 ng/ml,回收率为92%～113%.正常非妊娠血清、9～11周妊娠血清、15～17周妊娠血清ProMBP水平分别为(26.37±2.90)ng/ml、(357.71±33.60)ng/ml和(1088.77±58.13)ng/ml.结论:建立了一种可用于检测ProMBP的双抗体夹心ELISA方法.     

HPLC法测定房水中伊曲康唑的含量

目的本文建立了HPLC法测定房水样品中伊曲康唑药物的分析方法,并且对眼内药物的药代动力学进行了研究。方法以反相色谱法测定了房水样品中的伊曲康唑含量。结果样品中药物的最低检测浓度为5ng/ml,在5~300ng/ml药物浓度范围内线性关系良好,r=0.9995。眼内药物的药代动力学研究表明伊曲康唑滴眼后2h内的各时间点房水中均可检测出伊曲康唑的含量,在30min时的含量最高为(1.36±0.26)mg/L。房水中药物浓度半衰期约为63.9min。结论本方法适用于临床药物浓度监测。     

生物素-抗生物素蛋白酶联免疫系统的临床应用并与ELISA的比较研究

应用生物素-抗生物素蛋白酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)测定总 IgE,粉尘螨特异性 IgE 及细胞培养液中 IgE,与 ELISA 相比,具有快速、敏感,重复性好、特异性强的特点。测出的最低 IgE 浓度为0.1ng/ml。正常人及哮喘患者血清 IgE 几何均值分别为179.23IU/ml 和8.29IU/ml,有极显著差异(P<0.01)。测定总 IgE 时 BA-ELISA 与 ELISA 有较好相关关系(r=0.9473).91%皮试( )哮喘患者粉尘螨特异性 IgE 测定( )。哮喘患者血清粉尘螨特异性 IgE 水平(38±33IU/ml)明显高于正常人(5.7±1.9IU/ml)。哮喘患者皮试与粉尘螨特异性 IgE 的符合率,BA-ELISA 为93%,ELISA 为86%。加入粉尘螨或 SAH IgE 均能显著抑制粉尘螨特异性 IgE 的检测。同时用BA-ELISA 及 ELISA 两种方法测定了单核细胞培养液中 IgE 含量。结果表明:用 BA-ELISA 测定时,过敏患者与正常人间细胞培养液中 IgE 水平的差异较 ELISA 测定更为显著(BA-ELISA 为2.54/1,ELISA 为1.4(?)1)。     

重组人EGF-IL-18融合蛋白直接竞争ELISA方法的建立

目的：建立检测给药食蟹猴血清中重组人表皮生长因子-白介素-18 （rhEGF-IL-18）融合蛋白含量的直接竞争ELISA方法,为该融合蛋白的动力学研究提供方法学.方法：用棋盘法确定包被抗体和酶标抗原工作浓度,建立直接竞争ELISA方法,并对其进行方法学评价.结果：包被抗体和酶标抗原的最适工作浓度为4 μg/mL和1∶1 000.建立的标准曲线的曲线范围为100～ 900 ng/mL,R2为0.9898;日内精密度和日间精密度的最大变异系数分别为2.42％和2.20％;回收率95.3％ ～103.0％;样品在室温放置1 h、冻融2次和冻存20 d三种条件下检测结果均较稳定,相对标准差均小于15％;定量下限为20.0 ng/mL.结论：本研究建立的ELISA方法稳定且可行.     

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

目的:研究乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法,为相关的研究提供一定的参考。方法:采用ELISA定量分析方法,应用试剂盒HBsAg标准品从浓度8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度标准曲线,并以8、4、2ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度,并进行检测限和精密度等方法学验证。结果:用此类研究方法验证的准确度达到了97.06%,其中2ng/ml的RSD为16.78%,检测限LOD检测的RSD水平为0.170ng/ml,低浓度的样品的精密度和检测都低于高浓度样品,不适合检测。结论:HBsAg的ELISA法进行定量分析的试剂盒并不适用于临床标本的分析。     

ELISA法检测可溶性人类白细胞抗原-Ⅰ及广东人参考值的测定

目的探讨可溶性人类白细胞抗原-Ⅰ(sHLA-Ⅰ)的定量检测技术,并用于检测广东地区人群的参考值。方法以W6/32包被酶标板,捕捉样品中sHLA-Ⅰ,β2微球蛋白抗体为一抗,再加酶标二抗及底物显色。根据不同浓度标准sHLA-Ⅰ显色后Dλ值的标准曲线,检测60 例正常广东人的sHLA-Ⅰ含量。结果sHLA-Ⅰ最低检测限为2.84 ng/ml,批内变异系数为5.80%,批间变异系数为9.00%,回收率为98.57%~100.15%。广东人sHLA-Ⅰ正常值为(699.54±360.10)ng/ml。结论ELISA法检测sHLA-Ⅰ具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。     

肝癌、肺癌、胃癌患者血清GST-π含量的测定及其临床意义

采用Guesdon法制备出生物素化兔抗人GST-π抗体(B-IgG)。以生物素-亲和素-酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)测定了肝癌、肺癌、胃癌患者血清和胎儿脐带血血清中的GST-π含量。测定结果,肝癌、肺癌、胃癌患者血清中GST-π含量分别为7.25±6.47ng/ml,4.3±1.85ng/ml,3.74±2.25ng/ml,比正常人的1.16+0.81ng/ml均显著升高,胎儿脐带血血清中GST-π含量为1.14±0.88ng/ml,与正常人相比无明显差异。故认为,血清中GST-π很有可能成为肝癌、肺癌、胃癌的一个肿瘤标志。     

白色念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

目的:建立定量检测白色念珠菌烯醇化酶(enolase,Eno)的双抗体夹心ELISA法,并应用于不同真菌培养上清液的检测,探讨其在侵袭性念珠菌感染中潜在的诊断价值?方法:将白色念珠菌Eno单抗作为包被抗体,HRP标记的羊抗Eno作为检测抗体,利用重组白色念珠菌Eno蛋白作为标准品评价该方法的精密度?线性范围?最低检测下限等性能指标?用建立的双抗体夹心ELISA法定量检测不同真菌培养上清和白色念珠菌在不同温度下培养上清中Eno水平?结果:Eno浓度为20 ng/ml和5 ng/ml时,批内和批间精密度分别为6.61%?9.19%和6.98%?13.81%,最低检出下限为1.25 ng/ml,线性范围为1.25~50.00 ng/ml?白色念珠菌37℃培养24 h时的上清中Eno含量为3.06 ng/ml,培养120 h时Eno水平上升到33.43 ng/ml,Eno水平与白色念珠菌菌丝含量呈正相关?本方法与近平滑念珠菌有微弱交叉反应,与热带念珠菌?光滑念珠菌?季也蒙念珠菌?新型隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应?结论:成功建立了定量检测白色念珠菌Eno的双抗体夹心ELISA法,在侵袭性念珠菌感染研究中具有潜在的应用价值?     

反相高效液相色谱法测定人血浆中拉呋替丁的浓度

目的:建立人血浆样品中拉呋替丁的反相高效液相色谱测定方法。方法:采用反相高效液相色谱法,血浆样品经1.0mol/L的氢氧化钠溶液处理,药物用有机溶剂将从血浆中萃取,以左羟丙哌嗪为内标物,使用Zorbax Eclipse XDBC18柱和C18保护柱测定,紫外检测波长为275nm;流速为1.1ml/min,柱温为40℃。结果:线性范围为8.0~800.0ng/ml(r=0.9993),最低定量浓度为8.0ng/ml,低、中、高三种浓度日内RSD(n=6)分别为4.5%、3.2%、1.2%,日间RSD(n=6)分别为5.1%、3.7%、2.2%,平均回收率为76.0%。结论:该方法精确、敏感,适用于拉呋替丁的药代动力学研究。     

酶联免疫吸附试验检测人叶酸受体抗体IgM方法的建立及评价

目的 建立酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血浆叶酸受体抗体IgM的方法。方法 将从正常分娩健康产妇的胎盘中提取、纯化人叶酸受体蛋白稀释至5 ng/μl,作为抗原包被96孔板,以羊抗人IgM作为二抗,以健康人混合血浆作为标准品,浓度设定为1。采用ELISA检测人血浆叶酸受体抗体IgM水平,并评价该方法的灵敏度、精密度和稳定性。分别以人叶酸受体蛋白和牛源叶酸结合蛋白作为包被蛋白,检测24例健康新生儿母亲和20例神经管畸形患儿母亲的血浆标本叶酸受体抗体IgM水平,比较两种包被蛋白的检测结果。结果 ELISA方法可以检测的人血浆叶酸受体抗体IgM浓度为6.25×10-4~8.00×10-2,最低检测限为3.12×10-4。该方法检测高、中和低浓度血浆叶酸受体自身抗体IgM的批内差异分别为6.61%、3.50%和5.12%,批间差异分别为4.54%、5.49%和5.44%,此方法检测不同稀释倍数样品中叶酸受体自身抗体IgM浓度的测定值均在均数±10%范围内。人叶酸受体包被检测板测得的健康新生儿母亲(t=-11.9,P<0.001)及神经管畸形患儿母亲(t=7.35,P<0.001)的叶酸受体抗体IgM浓度均显著高于牛源叶酸结合蛋白包被检测板的测定值。结论 本研究成功建立了检测人血浆叶酸受体抗体IgM的ELISA方法,该方法以人叶酸受体蛋白作为包被蛋白,检测灵敏度高,精密度好,结果稳定。     

快速检测人血清可溶性CD40配体ELISA试剂盒的研制及评价

目的 建立快速灵敏、特异和稳定的检测人血清可溶性CD40配体(sCD40L)酶联免疫测定(ELISA)试剂盒.方法 采用自制的鼠抗人CD40L单克隆抗体La为包被抗体,识别人CD40L不同位点的生物素标记的自制单克隆抗体Lb为检测抗体,以HRP-链亲合素-多聚赖氨酸复合物为反应底物,采用反应板包被孔中直接加入检测抗体,试验时仅需再加入HBP-链亲合素-多聚赖氨酸复合物,研制一种快速双抗体夹心的检测人血清sCD40L ELISA试剂盒,并测定400例健康人血清sCD40L含量.结果 成功研制出快速检测人血清sCD40L ELISA试剂盒,灵敏度为0.06 ng/ml.该试剂盒于4℃放置3个月,CV＜±5.7%,回收率为96.2%～105.9%,提示该检测系统具有良好的灵敏度、稳定性和准确性,与国外商品化同类试剂盒的分析结果相似.应用该试剂盒测得400例健康人血清sCD40L含量为(2.13±2.00)ng/ml.结论 研制成功快速、灵敏、特异和稳定的检测人血清sCD40L ELISA试剂盒,能够对血清中sCD40L进行准确定量分析.     

LC-MS/MS法测定大鼠血浆中的左旋紫堇达明及其药代动力学研究

目的：建立快速、灵敏的LC-MS/MS分析方法定量测定大鼠血浆中左旋紫堇达明（L-CDL）的浓度,经系统方法学验证后,应用于该药的大鼠药代动力学研究。方法以普萘洛尔为内标,以水（含0.1%甲酸与5 mmol/L的甲酸铵）和乙腈（含0.1%甲酸）为流动相,血浆样品中的L-CDL和内标经C18（2.1 mm×750 mm,3μm）柱分离后,质谱电喷雾离子化源（ESI）正离子多反应监测（MRM）方式分别对离子对m/z 342?192.1和m/z 260?116.2进行检测。方法验证包括专属性、标准曲线与定量下限、批内和批间精密度、准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。结果 L-CDL在大鼠血浆样品的定量线性范围为1~5000 ng/ml,最低定量下限为1 ng/ml,批内和批间精密度（RSD）＜10%,回收率93.5%~102.8%,基质效应108.3%~112.5%。大鼠经胃给予L-CDL 10 mg/kg后的主要药动学参数Cmax、T1/2、AUC0-24分别为：（557.8±330.1）ng/ml、（7.04±3.93）h、（2408±630）h·ng/ml。结论建立的LC-MS/MS方法简便、快速、灵敏,适用于L-CDL在大鼠体内的药代动力学研究。     

LC-MS法测定人血浆中格列苯脲及其在健康志愿者中的药代动力学

目的:测定人血浆中格列苯脲的浓度,并研究在中国志愿者中单剂量口服5 mg后的药代动力学过程.方法:用液-液萃取法提取血浆中药物.采用液相色谱-质谱联用的分析手段,建立人血浆中格列苯脲浓度的测定方法.结果:格列苯脲在1.56～400 μg/L浓度范围内线性良好(r=0.9999),其在人血浆中的回收率大于80%,日内、日间RSD分别为3.6%～6.8% 和6.1%～8.4%.最低检测限为0.5 ng/ml.该药在人体内的主要动力学参数为:AUC0-∞=(813.6±254.2)μg·h/L,AUC0-t =(790.6±248.2) μg·h/L,cmax=(130.1±64.8) ng/ml,tmax=(2.6±1.8) h和t1/2=(2.7±1.9) h.结论:本方法专属性强,灵敏度高,可准确测定格列苯脲在人血浆中的浓度.