人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的：建立稳定的基因工程细胞系。方法：将含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）全长cDNA插入表达载体pSNAV2．0，产生重组质粒pSNAV2．0-TNFα，利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中，G418筛选阳性克隆hTNF／293，采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果：通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明：在质粒pSNAV2．0中插入片段正确。采用RT—PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达，分子量为17KDa。结论：成功构建重组质粒pSNAV2．0-TNFα，真核表达载体构建正确，转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白，并能分泌到细胞外。     

Notch1 胞内段荧光表达质粒的构建及鉴定

目的：构建能够在鼻咽癌细胞株中高效表达人Notchl信号胞内段（NIC）的荧光质粒。方法：通过RT—PCR获得人NIC的cDNA;利用基因重组技术插入到pEGFP—N1中;在脂质体介导下转染人低分化鼻咽癌细胞CNE2后,经荧光显微镜、RT—PCR和Westernblot检测NIC的表达情况。结果：RT—PCR方法得到一条2424bp的特异性扩增产物,酶切和基因测序结果表明重组质粒构建成功。转染48h后,检测到绿色荧光表达,RT～PCR和Westernblot的结果显示NIC的表达量升高。结论：正确构建了人NIC荧光表达质粒。该质粒能够在鼻咽癌细胞株中高效表达,为研究Notch信号通路在鼻咽癌中的作用奠定了实验基础。     

pEGFP-BLCAP真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pEGFP—BLCAP并转染骨肉瘤细胞SOSP—M。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP—M细胞中提取总RNA，经RT—PCR获得BLCAP基因的cDNA，测序正确后插入真核表达载体pEGFP—C2中。构建的重组质粒经脂质体介导转染SOSP—M细胞，经观察荧光蛋白表达和Western blot鉴定目的蛋白在转染后的SOSP—M细胞中的表达情况。结果：RT—PCR成功地扩增出一条约280bp的片段，经限制性内切酶分析和DNA序列测定证实目的基因cDNA已插入重组质粒；荧光显微镜下观察到转染后的SOSP—M细胞发出较强绿色荧光，Western blot证明BLCAP能以融合蛋白的形式在SOSP—M细胞中获得表达。结论：构建了真核表达载体pEGFP—BLCAP并成功表达目的蛋白。     

TRAIL真核表达治疗肝细胞癌作用的研究

目的：构建鼠源TRAIL（mTRAIL）真核表达质粒。研究其体内、外表达对肝癌细胞的诱导凋亡作用，抑制肝癌生长作用及与重组人FN多肽真核表达质粒pCH510协同抑制肝癌生长作用。方法：采用RTPCR及重组DNA技术构建mTRAIL真核表达质粒；体内、外进行基因转染；用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率，用TdTmediated dUTP nick end labeling (TUNEL)法及免疫组织化学技术检测肝癌细胞凋亡；小鼠实体瘤块模型研究基因转染抑制肝癌生长作用。结果：用RTPCR方法自小鼠脾细胞RNA扩增出TRAIL基因的全长cDNA，并克隆至真核表达载体pcDNA3.1中获重组质粒pX1；以pX1转染BHK细胞株后攻击肝癌细胞株H22细胞，可检测到肝癌细胞凋亡；肌肉内注射转染质粒DNA pX1，通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肝癌生长；pX1与FN多肽真核表达质粒pCH510有协同抑制肝癌生长作用。结论：质粒pX1可在细胞及小鼠体内表达；体内、外表达可诱导肝癌细胞凋亡并可通过该机制抑制肝癌生长；与FN多肽真核表达质粒pCH510有协同抑制肝癌生长作用。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

烷化剂耐药基因真核表达质粒的构建及在K562细胞中的表达

目的克隆烷化剂耐药基因MGMT，构建真核表达质粒并导入真核细胞进行表达，筛选稳定表达的细胞系。方法从人肝组织中克隆MGMT基因后重组构建真核表达粒质pIRES2-MGMT—EGFP并鉴定。通过脂质体法将目的基因导入K562细胞，应用RT—PCR及Western blot检测目的基因的表达并筛选稳定转染的细胞克隆。结果成功克隆MGMT并构建了真核表达质粒pIRES2-MGMT—EGFP。转染细胞后MGMT在mRNA及蛋白水平均有表达，而对照组则为阴性。结论含烷化剂耐药基因MGMT真核表达质粒的构建及转染后表达的成功为烷化剂耐药基因的相关研究奠定了良好的基础。     

stathmin基因的RNA干涉抑制人白血病K562细胞体外增殖的作用

目的：研究RNA干涉（RNA interference，RNAi）抑制stathmin基因表达后对人白血病K562细胞体外增殖的作用。方法：将合成的寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHI和HindIII双酶切后的pSilencer4．1-CMV neo真核表达载体。酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入K562细胞，RT—PCR检测其对mRNA的干涉效果；MTT比色法检测K562细胞体外增殖能力。结果：经酶切及测序鉴定，成功构建重组质粒。RT—PCR显示所构建的干涉载体成功地抑制了目的基因的转录，同时细胞增殖活性降低。结论：RNA干涉成功抑制stathmin基因表达并使人白血病K562细胞体外增殖活性明显降低。     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

异位hCGβ基因免疫诱导的特异性抗肿瘤免疫应答

目的　观察异位hCGβ基因免疫诱导的肿瘤特异性免疫应答及其抗肿瘤作用 ,为肿瘤的免疫生物治疗寻求新途径。方法　构建含hCGβ编码基因的质粒TR4 2 1 hCGβ ,对BALB/c小鼠实施基因免疫 ,并以空质粒为对照。采用ELISA法和3 H TdR掺入法分别检测免疫小鼠血清中特异性抗hCGβ IgG抗体及其对肿瘤细胞体外生长的抑制作用 ;特异抗原体外刺激免疫小鼠脾细胞后 ,用3 H TdR掺入法和3 H TdR释放法分别检测其特异性增殖活性和细胞毒活性 ;皮下接种SP2 /0 hCGβ细胞攻击免疫小鼠 ,以成瘤率及实体瘤重量评估体内抗瘤效果。结果　全部TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠均产生高水平的抗hCGβ IgG抗体 ,该抗体可抑制肿瘤细胞的体外生长 ,与对照血清相比 ,差异有显著差性 (P <0 .0 5 ) ;hCGβ蛋白、灭活SP2 /0 hCGβ细胞以及两者混合均能刺激TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞的体外增殖 (SI值分别为 1.5 3、1.81和 2 .0 5 ) ,与空质粒免疫小鼠相比 ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ;特异抗原刺激的TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠脾细胞对SP2 /0 hCGβ细胞的细胞毒活性明显高于SP2 /0细胞(P <0 .0 1) ;空质粒免疫小鼠接种SP2 /0 hCGβ细胞后成瘤率为 10 0 % ,瘤重达 3.37g ,而TR4 2 1 hCGβ质粒免疫小鼠的成瘤率为 16 .6 6 % ,瘤重为     

pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体的构建及其抗肿瘤作用研究

目的:探索小鼠IL-18基因治疗肿瘤的方法和疗效。方法:构建pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体,并用其转染HT-29细胞,RT-PCR和ELISA检测IL-18表达情况;将转染pSecTag2B-mIL-18质粒的HT-29培养上清,加入到小鼠T淋巴细胞培养液,ELISA、RT-PCR检测T淋巴细胞分泌IFN-γ;脂质体包被的pSecTag2B-mIL-18裸质粒,采用肌肉注射法转入Balb/c小鼠,检测IL-18蛋白表达情况;在Balb/c小鼠接种小鼠co-lon-26肿瘤细胞的同时,将表达载体pSecTag2B-mIL-18转入,观察抑制肿瘤生长的情况。结果:1)经酶切和测序鉴定,pSecTag2B-mIL-18真核分泌表达载体所表达的基因序列经比对完全正确。2)pSecTag2B-mIL-18转染HT-29细胞后,IL-18在mRNA和蛋白水平高表达。3)转染后的HT-29培养上清可刺激小鼠T淋巴细胞高水平分泌IFN-γ。4)用裸质粒肌肉注射法将pSecTag2B-mIL-18转入Balb/c小鼠,证明质粒均能够在小鼠肌肉中表达,且表达的蛋白均能分泌到外周血液循环中。5)接种co-lon26细胞的Balb/c小鼠,将pSecTag2B-mIL-18转入小鼠,结果表明IL-18单独应用能明显抑制肿瘤的生长。结论:pSecTag2B-mIL-18裸质粒肌肉注射具有显著的抗肿瘤作用。     

脂质体介导pcDNA3.1-IDO转染hepG2细胞的初步研究

目的：建立脂质体介导pcDNA3.1-IDO转染人肝癌细胞株hepG2细胞的转染方法。方法：在大肠杆菌中扩增pcDNA3.1-IDO质粒,通过lipofectamineTM2000转染试剂将pcDNA3.1-IDO转入人肝癌细胞hepG2,同时设置空质粒转染组（pcDNA3.1-hepG2细胞）和空白对照组（hepG2细胞）。分别应用RT-PCR和Western blot方法检测吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）基因及IDO蛋白在hepG2细胞中的表达。结果：经RT-PCR和Western blot检测证实空质粒转染组和空白对照组hepG2细胞无IDO基因及蛋白的表达,而重组质粒组的hepG2细胞均表达IDO基因和蛋白。结论：通过脂质体介导成功地将pcDNA3.1-IDO转染入肝癌细胞株hepG2细胞。这为研究IDO基因奠定了基础。     

重组tBid融合蛋白基因的构建及其在HeLa细胞中的分泌表达

目的:构建重组的Immuno-tBid基因,并检测其在HeLa细胞中的分泌表达。方法:将肿瘤表面抗原HER2的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PE253-364aa)和tBid基因连接,并在5'端连接前导肽基因,构建成Immuno-tBid(e23sFv-PEII-tBid61/tBid76)基因。将其克隆到pCMV载体并转染HeLa细胞,G418筛选获得阳性克隆,Genomic-PCR和RT-PCR分别扩增相应的重组基因片段。建株的HeLa细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测。并通过间接免疫荧光染色和细胞计数观察建株的HeLa细胞生长和形态变化。结果:成功构建了重组的Immuno-tBid基因的真核表达载体(pCMV-e23sFv-PEII(253-364)-tBid61/tBid76)。稳定转染HeLa细胞,获得G418抗性的阳性HeLa细胞克隆,Genomic-PCR检测证实目的基因已整合到细胞基因组中。RT-PCR检测表明目的基因在RNA水平上的表达。细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测,证实建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。间接免疫荧光染色和核染色结果显示,分泌Immuno-tBid蛋白的HeLa细胞呈标准的S型曲线生长,形态正常。结论:成功构建了重组的Immuno-tBid基因,建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。     

SCF或（和）GM—CSF体内基因转染对“自杀基因”疗法抗肿瘤作用的增？…

目的 通过增强体内抗原提呈功能提高“自杀基因”疗法疗效,探讨其相关免疫学机理。方法 采用腺病毒介导的ＳＣＦ,ＧＭ－ＣＳＦ基因体内转染联合ＣＤ／５ＦＣ“自杀基因”疗法治疗小鼠的ＣＴ２６结肠腺癌,观察肿瘤的生长和荷瘤小鼠的存活期,不同方法所诱导的ＣＴＬ杀伤活性及肿瘤局部的细胞因子表达。结果 一次性低剂量腺病毒介导的ｍＧＭ－ＣＳＦ或（和）ｍＳＣＦ基因的体内转染,能增强“自杀基因”疗法的疗效,在肿瘤局部出     

hOSM在COS-7细胞中表达及对人A375黑色素瘤细胞的生长抑制作用

目的:克隆人抑瘤素(hOSM)基因并构建真核表达载体,在COS-7细胞中表达具有抑制人A375黑色素瘤细胞生长的基因重组蛋白。方法:用PMA刺激U937细胞,抽提总RNA,经RT-PCR获得cDNA,与pUCmT载体连接,经PCR获得全长hOSM基因,再与pcDNA3·1/myc-his(-)A真核表达载体连接,构建真核表达重组质粒pcDNA3·1A-hOSM,经PCR和限制性酶切及DNA测序鉴定后,在COS-7细胞中进行瞬时表达,采用RT-PCR鉴定hOSM基因的转录,MTT法检测表达产物抑制A375细胞生长的活性。结果:重组入载体中的基因片段不仅方向正确,而且所克隆的hOSM基因,与GeneBank报告序列完全一致,并成功地在COS-7细胞中瞬时表达了具有抑制A375细胞生长的rhOSM蛋白。结论:本研究成功地克隆出hOSM基因并在COS-7细胞中获得瞬时表达,证明了表达的基因重组蛋白具有抑制人A375黑色素瘤细胞生长的活性,为在真核细胞中进行稳定表达,深入研究rhOSM的生物学功能创造了条件。     

pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒的构建及在MCF-7乳腺癌细胞中的转染

目的构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒, 并进行鉴定。为进一步研究Smad3在抑制乳腺癌生长机制中起到的作用提供实验基础。方法 利用RT-PCR方法从MCF-7乳腺癌细胞中获得cDNA, 应用PCR方法扩增、提取 Smad3的基因片段, 酶切后与pEGFP-C3真核表达载体连接, 构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒, 进行测序、酶切鉴定, 表明质粒构建成功。将构建的质粒瞬时转染至MCF-7乳腺癌细胞中, 通过荧光倒置显微镜观察、RT-PCR技术及Westen blot技术鉴定转染是否成功。结果 本实验成功构建了pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒。结论 pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒瞬时转染到MCF-7细胞中, 可使Smad3在基因与蛋白水平的表达显著上调。     

人B7-H3基因的克隆及其重组蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:克隆人B7-H3(CD276)基因的完全编码区序列,在毕赤酵母中表达B7-H3重组蛋白并纯化.方法:应用RT-PCR从人肺癌A549细胞中克隆B7-H3基因的完全编码区序列并在3'端加入6×His标签基因,克隆于毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建表达质粒pPIC9K/B7-H3,以该质粒转染酵母菌株GS115,在含有不同浓度遗传霉素(G418)的YPD平板上进行筛选,然后挑取单克隆进行PCR鉴定,甲醇诱导表达鉴定结果为阳性的酵母重组子,表达产物通过离子交换柱纯化后经SDS-PAGE电泳和Western Blot进行检测.结果:应用RT-PCR从人肺癌A549细胞中获得约1 500bp、与目的基因大小相符的条带,且测序正确;构建的酵母表达质粒pPIC9K/B7-H3表达框正确无误;阳性酵母重组子表达产物经6×His标签纯化后,SDS-PAGE电泳显示在70kD处有与预期大小相符的蛋白条带,Western Blot显示该蛋白可分别与抗6×His单克隆抗体及抗人B7-H3抗体呈特异性反应.结论:成功克隆了人B7-H3基因的完全编码区序列,在毕赤酵母中表达并进一步纯化,为B7-H3在肿瘤发生、发展中的作用及机制研究奠定了基础.     

CONSTRUCTION OF EUKARYOTIC EXPRESSION VECTOR FOR HUMAN CCL21 AND CHARACTERIZATION OF ITS CHEMOTACTIC ACTIVITY

Objective： To obtain recombinant human CCL21 with biological activity from eukary0tic expression system for further use in cancer gene therapy. Methods： A fragment of human CCL21 gene was obtained from pSK-hCCL21 plasmid digested by Xho I and BamH I, inserted into the responding sites of eukaryotic expression vector pVAX1, and then transfected into COS-7 cells by electroporation method. The expression of hCCL21 protein was detected by western blotting analysis. The in vitro chemotaxis assay was used to test the chemotactic function of the expression product to lymphocytes. Results： Human CCL21 protein was expressed by transfected COS-7 cells with recombinant plasmid containing hCCL21 gene, and was verified by western blotting. The in vitro chemotaxis assay demonstrated that human CCL21 protein had a potent chemotactic function to lymphocytes. Conclusion： Human CCL21 was successfully and transiently expressed in eukaryotic cells, which lays some foundation for the study of CCL21 gene therapy in murine tumor models.