染料木黄酮诱导膀胱癌T24细胞凋亡的实验研究

目的　研究染料木黄酮对人T2 4膀胱癌细胞的抑制作用和诱导凋亡作用 ,并探讨其作用机制。方法　将不同浓度的染料木黄酮作用于人T2 4膀胱癌细胞 ,用MTT法检测其有效作用浓度 ,分别采用透射电子显微镜、瑞氏染色、Hoechest332 5 8荧光染色、流式细胞仪观察和检测T2 4细胞凋亡情况。结果　MTT法测得染料木黄酮对T2 4细胞的IC50 值为32 80mg·L-1,浓度为 2～ 80mg·L-1的染料木黄酮具有诱导人T2 4膀胱癌细胞凋亡的作用 ,且随药物作用时间延长凋亡率逐渐增加。结论　染料木黄酮具有抗膀胱癌作用 ,其重要作用机制之一是诱导人T2 4膀胱癌细胞凋亡     

吉西他滨诱导膀胱癌T24细胞自噬的实验研究

目的 观察吉西他滨(gemcitabine,GEM)处理膀胱癌T24细胞后引起凋亡的同时是否诱导T24细胞自噬的产生,并初步探究其自噬产生的机制,以及自噬与凋亡之间的关系.方法 体外培养T24细胞,应用CCK-8法测定细胞抑制率;Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP的活化,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、底物蛋白P62和自噬潮,以及JNK通路相关蛋白Jnk1、P-Jnk、Bcl-2的表达情况;并通过透射电镜观察细胞超微结构自噬体的变化;Annexin V-PI双流式细胞术检测抑制自噬后细胞凋亡率的变化情况.结果 CCK-8检测结果显示吉西他滨能有效抑制膀胱癌T24细胞增殖;1.0 μg/mL吉西他滨处理T24细胞4h即可发生明显的自噬,透射电镜观察可见自噬体小体的形成;Western blot检测结果显示吉西他滨作用T24细胞后cleaved-Caspase-3、PARP和LC3-Ⅱ表达增高,P62表达降低;P-Jnk出现活化,Bcl-2发生降解;而抑制自噬后能显著增强吉西他滨诱导的膀胱癌T24细胞的凋亡.结论 吉西他滨介导膀胱癌T24细胞凋亡的同时又诱导保护性自噬,JNK信号通路参与调控其自噬的发生,抑制自噬可以明显增强膀胱癌T24细胞对吉西他滨的化疗敏感性.     

Expression of transcription factor Oct4 in bladder cancer cell line T24 and its effects on the biological characteristics of the cells

The expression of octamer binding factor 4 （Oct4） gene in bladder cancer cell line T24 and its effects on the biological characteristics of the cells were investigated. RT-PCR and Western blot were employed to detect the expression of Oct4 in T24 cells. The changes of biological characteristics in T24 cells were analyzed before and after gene-silencing by Boyden chamber and MTT. The results showed that the expression of Oct4 gene was detectable in T24 cells by RT-PCR and Western blot. The expression of Oct4 gene and protein was down-regulated by siRNA, and average number of transwell cells in interference group, negative control group and blank control group was 101.40±54.56, 104.20± 10.03 and 111.00±11.90, respectively. There was significant difference in the proliferation abilit,） of the cells from 48 h, 72 h to 96 h after the interference by siRNA between interference group and negative group or blank control group （P〈0.05）. It was suggested that Oct4 gene was related with proliferation ability of T24 cells, but not with invasive capability.     

瑞香狼毒水提物小鼠血清对人膀胱癌T24细胞增殖的影响

目的：探讨瑞香狼毒水提物（SCLA）的抗癌作用及机制。方法：以不同剂量SCLA灌胃给药后,于不同时间采集小鼠血清,处理体外培养的人膀胱癌T24细胞,用MTS比色法,于酶标仪上测定吸光度值,观察SCLA对细胞增殖的影响。结果：SCLA小鼠血清显著降低T24细胞增殖。结论：瑞香狼毒抑制人膀胱癌T24细胞增殖,可能成为膀胱癌新的治疗药物。     

维生素K3对人膀胱癌细胞株T24凋亡的诱导作用

目的 观察不同浓度的维生素K3(VK3)对人膀胱癌细胞株T24凋亡的诱导作用.方法 采用噻唑蓝(MTT)法观察不同浓度VK3(0,2,5,10,20 μmol/L)对T24细胞增殖的影响,采用流式细胞术检测不同浓度的VK3对细胞凋亡率的影响.结果 0,2,5,10,20 μmol/L VK3作用T24细胞48 h后,生长抑制率分别为(5.80±0.038)%,(13.30±0.036)%,(26.55±0.032)%,(42.58±0.028)%和(65.35±0.034)%,细胞凋亡率分别为(2.86±0.4)%,(5.16±0.7)%,(10.85±1.1)%,(23.01±0.8)%和(75.80±1.2)%,其中10 μmol/L,20 μmol/L VK3对T24细胞生长有明显抑制作用(P<0.05). 结论 10-20 μmol/L VK3在体外作用48 h后可明显地诱导膀胱癌T24细胞株发生凋亡.     

siRNA沉默膀胱癌T24细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的研究

目的 研究siRNA对膀胱癌细胞T24 DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的沉默作用.方法 将筛选出的siRNA转染入膀胱癌T24细胞分为空白组、脂质体组、阴性对照组和siRNA组,分别运用RT-PCR、Western blot检测转染后不同时段DNMT1 mRNA水平、蛋白水平变化.结果 筛选出的siRNA转染膀胱癌T24细胞DNMT1 24 h开始出现mRNA减少,24 h、48 h、72 h分别降至(66.05±4.87)％、(39.36±4.53)％和(40.86±4.81)％(P＜0.05).转染后24 h、48 h、72 h蛋白水平分别降至(90.21±3.68)％、(71.45±3.44)％和(67.74±3.38)％(P＜0.05).结论 siRNA能有效地沉默膀胱癌细胞T24 DNMT1的表达.     

siRNA沉默膀胱癌肝素酶基因对T24细胞增殖及MMP-2表达的影响

目的研究siRNA干扰沉默膀胱癌肝素酶基因对T24细胞增殖及MMP-2表达的影响 方法体外化学合成肝素酶特异性小干扰RNA（siRNA）,用脂质体2000转染至T24膀胱移行细胞癌细胞内,常规分为正常对照组、空白对照组、阴性对照组和转染实验组进行实验,用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况,反转录聚合酶链法（RT-PCR）检测肝素酶基因的表达,免疫细胞化学方法检测MMP 2的表达。结果RNA干扰沉默T24膀胱移行细胞癌细胞肝素酶基因后,T24细胞增殖活力下降,三个不同干扰组细胞活力分别下降了(28.55±3.66)%、(27.20±3.25)%和(37.29±4.82)%。肝素酶mRNA表达下降,膀胱移行细胞癌细胞中MMP-2（明胶酶A）的表达亦明显下降（P均＜0.05）。结论RNA干扰肝素酶基因后,细胞活力及肝素酶mRNA表达水平下降并且明显抑制膀胱癌细胞中MMP-2的表达。     

黄芩素联合U0126促进人膀胱癌T24细胞凋亡的分子机制研究

目的 探讨黄芩素联合U0126促进人膀胱癌细胞系T24凋亡的分子机制.方法 用黄芩素和U0126处理人膀胱癌T24细胞株,(1)CCK8检测细胞增殖;(2)流式细胞仪检测T24细胞周期的变化;(3)显微镜观察细胞凋亡;(4)流式细胞仪检测早期细胞凋亡和晚期细胞凋亡;(5)Real Time PCR检测细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达水平;(6)Western blot检测细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达水平.结果 黄芩素或U0126浓度越高,T24细胞增殖能力逐渐下降(P<0.05);不同浓度的黄芩素刺激人膀胱癌细胞株T24,T24细胞数量随浓度上升而逐渐减少(P<0.05);黄芩素与U0126联合处理组的T24细胞株S期的细胞数量显著低于黄芩素、U0126单独处理组(P<0.05);黄芩素与U0126联合处理组的T24细胞株早期凋亡和晚期凋亡均显著高于黄芩素、U0126单独处理组(P<0.05);黄芩素与U0126联合处理组的T24细胞株ERK1/2、Bcl-2和P38的mRNA表达水平显著低于黄芩素或U0126单独处理组(P<0.05);黄芩素与U0126联合处理组的T24细胞ERK1/2、P38的磷酸化水平以及Bcl-2的蛋白表达量均显著低于黄芩素或U0126单独处理组(P<0.05).结论 黄芩素和U0126均可显著抑制人膀胱癌细胞增殖,诱导T24早期凋亡和晚期凋亡且具有浓度依赖性,且两者具有协同效应.因此,黄芩素和U0126可用于治疗膀胱癌.     

人膀胱癌T24细胞及其SCID小鼠移植瘤组织中KDR的表达

目的 检测KDR在人膀胱癌T24细胞及其SCID小鼠移植瘤组织中的表达。方法 常规培养T24细胞，建立荷人膀胱癌移植瘤SCID小鼠动物模型，使用抗KDR单克隆抗体，通过免疫荧光、免疫组化检测KDR在T24细胞及瘤体组织上的表达；结果 KDR在T24细胞及瘤体组织中均呈阳性表达。结论 本研究结果为进一步研究抗KDR单抗在荷T24细胞移植瘤动物体内分布及对瘤体生长的抑制效应奠定了实验基础。     

干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及对膀胱癌细胞体外增殖影响

目的:初步研究干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及其对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响?方法:利用免疫组织化学和免疫荧光法检测Sox2在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24的表达;将构建成功的pcDNA3.1-SOX2-EGFP质粒转染膀胱癌细胞,采用半定量RT-PCR和Western blot检测Sox2的表达,进一步通过MTT实验初步探讨Sox2对膀胱癌细胞T24体外增殖能力的影响?结果:膀胱癌Sox2高表达率为68.6%;构建的pcDNA3.1-SOX2-EGFP转染膀胱癌细胞T24后能够成功表达;MTT实验显示,Sox2可促进膀胱癌细胞株T24体外增殖(P < 0.05)?结论:Sox2在膀胱癌组织及细胞均可检测到表达,并能促进膀胱癌细胞株T24的体外增殖?     

TERE1(UBIAD1)基因对膀胱癌细胞系T24凋亡的影响

目的 研究外源导入TERE1 (UBIAD1)基因对膀胱癌细胞系T24的影响.方法 利用脂质体LipofectamineTM 2000,将外源TERE1( UBIAD1)基因导入T24细胞.转染TERE1 (UBIAD1)基因一定时间后,利用血球计数板计数细胞数目,MTT方法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡.结果 转染基因48h后,较之对照组,实验组细胞数目减少了80.3％,差异有统计学意义(P=6.6E-07),且随转染时间的延长细胞数目逐渐降低.MTT方法检测到转染TERE1( UBIAD1)基因48h后实验组细胞活力值为0.4178,较之对照组,细胞活力抑制率达65.6％,差异有统计学意义(P=0.00023).流式细胞仪检测到转染TERE1 (UBIAD1)基因48h后实验组T24细胞出现凋亡峰,PI和ANNEXIN V-FITC双染实验发现处于凋亡期的细胞占总数的93.73％.结论 外源导入TERE1 (UBIAD1)基因后膀胱癌T24细胞的数目和活力降低,细胞走向凋亡.     

HSP70高表达的T24细胞克隆筛选及其生物学特性

目的 筛选耐热T24细胞亚克隆,研究其生物学特性变化。方法 用热暴露筛选,联合应用免疫荧光化学方法及流式细胞仪筛选高表达HSP70的T24细胞亚克隆,计数法测定其细胞生长曲线及细胞倍增时间,流式细胞仪分析其细胞周期的变化。分子生物学方法及细胞化学方法观察有无凋亡出现。结果 有限稀释法筛选获取耐热T24单克隆细胞株（HrT24)共26株,应用免疫荧光法筛选出HSP70阳性克隆12株,取荧光较强的两株命名为HrT24e,HrT24j,FCM（平均荧光强度为0．29）检测HSPs分子的阳性表达率T24,HrT24e,HrT24j分别为2．4％,37．6％,65．8％。细胞周期分析显示T24,HrT24e,HrT24j增殖指数（proliferation index,PI分别为44．3％,39．0％,38．5％,HrT24e与T24相比差异有显意义（Yates corrected,χ^2=5.56,P=0.0183),HrT24e与T24j相比差异无显意义（Yates corrected,χ^2=0.03,P=0.543)。HrT24e与HrT24j凋亡率分别为4．7％,5．9％。分子生物学方法观察到DNA凋亡梯带出现,细胞化学方法观察到凋亡小体。结论 HrT24细胞HSP70表达增加,出现了一定的增殖抑制现象,同时观察到细胞凋亡,推测它们有较好的免疫原性。     

膀胱移行细胞癌内树突状细胞和T淋巴细胞的检测及其意义

目的：研究膀胱移行细胞癌内树突状细胞（DC）及T淋巴细胞的浸润程度与肿瘤的病理分级和预后的关系。方法：应用免疫组化ABC法，选用抗S－100蛋白多克隆抗体和CD45RO单克隆抗体对55例膀胱移行细胞癌内的DC和T淋巴细胞进行检测。结果：膀胱移行细胞癌内DC及T淋巴细胞的浸润程度与肿瘤的病理分级和预后关系十分密切，结论：作为抗原提呈细胞的DC和具有特异抗肿瘤免疫活性的T淋巴细胞能较全面客观地反映膀胱移行细胞癌宿主局部抗肿瘤免疫状态，两者是判断膀胱移行细胞癌预后的可靠性指标。     

冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞的诱导凋亡作用及机制

目的 研究冬凌草甲素(Oridonin,ORI)对膀胱癌T24细胞的作用及机制.方法 MTT法检测ORI对T24细胞的生长抑制作用;光学显微镜和Hoechst 33258染色法荧光显微镜观察细胞的形态学变化;流式细胞仪检测凋亡变化;分光光度法检测Caspase 3的活性变化;Western blot检测bcl-2和bax表达的变化.结果 ORI对T24细胞有明显的生长抑制作用,呈明显的时间-效应关系和浓度-效应关系.随着ORI作用时间延长,T24细胞凋亡增加,见凋亡小体出现.随着ORI作用时间的延长,T24细胞的Caspase 3活性逐渐增加,bcl-2的表达逐渐减弱,bax的表达逐渐增强.结论 ORI对膀胱癌T24细胞有明显的诱导凋亡作用;机制可能是活化Caspase 3和下调bcl-2/bax.     

靶向沉默Notch1基因对膀胱癌细胞系T24增殖的影响

目的探讨Notch1基因沉默对人膀胱癌细胞增殖的影响。方法用pGenesil质粒构建靶向Notch1的siRNA真核表达载体psiRNA1,并将其转染到膀胱癌细胞系T24中,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)、流式细胞术(FCM)检测Notch1沉默后膀胱癌细胞生长变化、细胞周期和凋亡情况。逆转录聚合酶链反应（RT PCR）和蛋白印记法（Western Blot）检测Notch1基因的mRNA和蛋白在转染前后表达变化。结果转染psiRNA1质粒后T24细胞的生长受到显著抑制,呈一定的时间依赖性（60?h内）,凋亡率增加,G0/G1期细胞明显增多（未转染组、空载体组、阴性对照组）,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,且Notch1基因在mRNA和蛋白水平表达相对于对照组明显下调（P＜0.05）。结论沉默Notch1基因能够抑制膀胱癌细胞的增殖,Notch1在膀胱癌中可能具有癌基因的作用。     

兔膀胱移行上皮种子细胞的培养及扩增

目的 对膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养，探讨用于膀胱组织工程研究的移行上皮种子细胞的培养方法。方法 采用组织块培养法，将获取的移行上皮组织小块在添加附加成分的无血清F12培养基进行培养，观察培养细胞的形态及生长增殖情况，并对传代培养的细胞进行免疫组化染色鉴定。结果 原代移行上皮组织培养约9-10d时细胞可达90％的汇合，传代培养的移行上皮细胞生长稳定期较长，细胞至5—6代时生长状态仍然良好。免疫组化染色显示培养细胞为移行上皮细胞。结论 采用组织块培养法能成功地原代培养兔膀胱移行上皮细胞，在添加附加成分的F12培养基中移行上皮细胞能够稳定地传代培养，表明该法可为膀胱组织工程的研究提供一定数量活性良好的移行上皮细胞。     

腺病毒介导的ING4基因对人膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制

目的 探讨腺病毒介导的人生长抑制因子4(ING4)基因对人膀胱移行细胞癌T24细胞体外抑癌效应及其分子机制.方法 将含ING4的重组腺病毒(Ad-ING4)转染T24细胞,以空载体组、未转染组细胞作对照.应用半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测各组ING4基因及蛋白质在T24细胞中的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组T24细胞生长情况;流式细胞术(FCM)和Hochest 33258染色法检测各组T24细胞凋亡变化;半定量RT-PCR法检测各组细胞中凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)、p53、缺氧诱导因子(HIF)1α和半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达;Western印迹法检测各组细胞中caspase-3蛋白的表达.结果 腺病毒介导的ING4基因在T24细胞中成功表达,能明显诱导T24细胞凋亡,其凋亡率可达17.2%±4.1%,高于空载体组(4.7%±1.2%)和未转染组(4.8%±1.2%,P<0.05);外源性ING4基因可引起T24细胞中p53、Bax基因表达上凋(1.40±0.11比0.27±0.04,1.50±0.12比0.60±0.05)和Bcl-2、HIF-1α基因表达下凋(0.19±0.02比1.20±0.08,0.33±0.03比0.98±0.06,均P<0.05),并促进caspase-3活化.结论 腺病毒介导的ING4基因在体外可通过上凋p53、Bax/Bcl-2基因和下凋HIF-1α基因表达,导致caspase-3的活化而抑制人膀胱移行细胞癌T24细胞的生长,并诱导其凋亡.     

CD24蛋白在膀胱癌中的表达及意义

目的探讨CD24蛋白在膀胱癌中的表达及其与膀胱癌临床特征的关系。方法采用免疫组化方法对43例膀胱肿瘤、10例正常膀胱组织中CD24的表达进行检测。结果CD24蛋白主要表达于膀胱恶性肿瘤细胞的细胞膜和胞浆中,其阳性例数为27例,阳性率为62．8％,在正常膀胱组织中1例阳性表达,阳性率10％。在43例膀胱肿瘤石蜡标本中,CD24表达强度与肿瘤分级和分期有关,恶性程度高的肿瘤阳性表达高于恶性程度低的肿瘤,浸润性癌也高于非浸润性癌（P〈0．05）。结论①CD24在膀胱癌中的表达明显高于在正常膀胱组织中的表达。②CD24高表达与膀胱移行细胞癌的分化和浸润性进展密切相关。③CD24高表达可能成为判断膀胱移行细胞癌预后的一个重要指标。     

CD4＋CD25＋调节性T细胞在肺癌患者外周血的表达及临床意义

目的：探讨晚期肺癌患者外周血中CD4＋CD25＋调节性T细胞（Treg）的表达及其临床意义。方法：采用流式细胞仪检测30例肺癌患者化疗前、后外周血中Treg的水平,并与30例健康人（对照组）进行比较。结果：（1）肺癌患者外周血中Treg比例为（15.0±2.3）%明显高于对照组（7.1±2.0）%（P〈0.001）;（2）化疗前肺癌患者外周血中Treg为（15.0±2.3）%明显高于化疗后的（6.8±1.8）%（P〈0.001）;（3）Treg水平与病理类型无关（P〉0.05）,与临床分期有关（P〈0.01）。结论：晚期肺癌患者外周血中Treg升高,其水平变化可能可以作为评估肺癌患者疗效的指标。