弓形虫MIC 6羧基端蛋白片段的表达及其多克隆抗体的制备

目的克隆表达刚地弓形虫微线体蛋白6羧基端蛋白片段(Tg MIC6C),制备多克隆抗体。方法PCR扩增目的基因片段,克隆到pGEX-4T-1载体上,构建MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC6C融合蛋白,亲和层析融合蛋白;用纯化的融合蛋白混合免疫佐剂免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,纯化并分析抗体的特异性。结果构建了MIC6C/pGEX-4T-1原核表达系统并获得纯化的GST-MIC6C融合蛋白;获得了抗目的蛋白的多克隆抗体,抗体能特异地识别目的蛋白,抗体效价为1∶8 000。结论在体外获得了纯化的GST-MIC6C融合蛋白及其多克隆抗体,为后续GSTpull-down筛选与MIC6相互作用的蛋白奠定了基础。     

TgMIC6的优化表达及其多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30a-MIC6重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,经His亲和层析纯化后以His单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体纯化后分别运用ELISA和Western blot对其效价和特异性进行分析。结果成功构建了pET30a-MIC6原核表达载体。表达的TgMIC6融合蛋白相对分子质量为45×10~3,与预期相符,纯化后浓度为0.5 mg/ml。以纯化的融合蛋白为抗原制备兔源性抗血清,ELISA测定其效价为1∶25 600,抗体浓度3.2 mg/ml,纯度>90%,Western blot显示该抗体能识别TgMIC6重组蛋白和不同虫株内的天然MIC6蛋白。结论优化后的TgMIC6功能区在原核表达系统内高效表达,制备的TgMIC6多克隆抗体效价高,特异性强,可识别重组菌和不同虫株表达的TgMIC6。     

TgMIC6的优化表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达弓形虫微线体蛋白6(TgMIC6)结构功能域,并制备其多克隆抗体。方法运用Optigene TM密码子优化分析平台对弓形虫MIC6(TgMIC6)功能区的编码序列进行密码子优化,合成优化后的编码基因,并将其克隆入pET30a原核表达载体,构建pET30a-MIC6重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,经His亲和层析纯化后以His单克隆抗体为一抗进行Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体纯化后分别运用ELISA和Western blot对其效价和特异性进行分析。结果成功构建了pET30a-MIC6原核表达载体。表达的TgMIC6融合蛋白相对分子质量为45×10~3,与预期相符,纯化后浓度为0.5 mg/ml。以纯化的融合蛋白为抗原制备兔源性抗血清,ELISA测定其效价为1∶25 600,抗体浓度3.2 mg/ml,纯度90%,Western blot显示该抗体能识别TgMIC6重组蛋白和不同虫株内的天然MIC6蛋白。结论优化后的TgMIC6功能区在原核表达系统内高效表达,制备的TgMIC6多克隆抗体效价高,特异性强,可识别重组菌和不同虫株表达的TgMIC6。     

刚地弓形虫MIC8 CTD作用蛋白的筛选及鉴定

目的从刚地弓形虫速殖子裂解液中筛选并鉴定微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8CTD)的作用蛋白。方法分别以GST-MIC8CTD蛋白和GST蛋白(对照)作为探针蛋白,采用GST pull-down技术从弓形虫裂解液中筛选目标蛋白并进行SDS-PAGE分析;将目标蛋白转印至PVDF膜,测序,通过BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白;以目标蛋白抗体为一抗进行Western blot,分析GST pull-down产物与目标蛋白抗体的相互作用;分别用GSTMIC8CTD多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀试验,沉淀物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 PAGE显示GST-MIC8CTD蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带(分子质量单位约35~45ku),GST蛋白的pull-down产物中无此蛋白;BLAST2比对目标蛋白的氨基酸序列与弓形虫醛缩酶序列一致;ECM检测GST-MIC8CTD多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白组分可被相应的抗体识别,免疫前血清的免疫共沉淀产物中无可被识别的蛋白。结论经GST pull-down技术和免疫共沉淀试验筛选、鉴定,弓形虫MIC8CTD的作用蛋白为醛缩酶。     

刚地弓形虫硫氧还蛋白基因的克隆 表达及鉴定

目的 目的 克隆刚地弓形虫硫氧还蛋白 （Thioredoxin,Trx） 基因, 构建原核表达载体, 通过诱导表达和纯化蛋白, 免 疫家兔制备多克隆抗体。方法 方法 采用PCR技术扩增刚地弓形虫Trx基因, 克隆至原核表达载体pET?28a （+） 中, 转化大肠 埃希菌 （E. coli） Rosetta, 用IPTG诱导目的蛋白表达, 采用镍亲和层析法获得纯化蛋白并免疫家兔制备多克隆抗体。利用 Western blotting技术鉴定多克隆抗体的特异性。结果 结果 成功从刚地弓形虫 cDNA 中扩增出 Trx 目的基因, 构建了 Trx/pET?28a （+） 重组质粒, 获得抗Trx重组蛋白的多克隆抗体。Western blotting技术检测出弓形虫Trx蛋白的特异性条 带。结论 结论 用制备的兔抗Trx多克隆抗体能检测弓形虫Trx在速殖子内的表达, 为进一步深入研究刚地弓形虫Trx功能 奠定了基础。     

登革2型病毒贵州分离株NS1部分基因原核表达蛋白及其多克隆抗体制备

目的原核表达、纯化DENV-2贵州分离株NS1部分序列表达蛋白,并制备其多克隆抗体以研究其功能。方法合成DENV-2M株NS1部分基因序列,克隆到原核表达载体pET28(a),转化大肠埃希菌BL21(DE3);用IPTG诱导表达,Ni柱亲和层析纯化、回收融合蛋白;用纯化融合蛋白免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价。结果原核表达了NS1部分序列融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶800。Western blot检测该蛋白能被His标签抗体识别。结论 DENV-2M株NS1部分序列表达蛋白可诱导小鼠产生较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究DENV-2M株NS1部分序列表达蛋白的免疫原性奠定了基础。     

血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗BC097361蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR技术,以LX02细胞总RNA为模板,扩增BC097361目的 基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-BC097361.转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-半乳糖苷诱导并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.大量表达后利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗BC097361蛋白的多克隆抗体.以纯化的BC097361蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测.结果 扩增获得BC097361基因片段,成功表达了BC097361相关蛋白,经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析得到证实.成功获得融合蛋白及兔抗BC097361多克隆抗体.酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价>1:320 000,Western blot、免疫组织化学检测证明多克隆抗体的特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达BC097361蛋白,获得高特异性、高效价兔抗BC097361蛋白的多克隆抗体,为今后研究BC097361蛋白的生物学特性奠定了基础.     

新肿瘤睾丸抗原Ropporin重组蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建新肿瘤睾丸抗原Ropporin原核表达载体,表达和纯化人Ropporin重组蛋白,并制备其兔抗血清.方法:人Ropporin全长cDNA克隆入pQE30载体,在大肠杆菌中利用IPTG诱导表达并纯化人Ropporin重组蛋白.利用人Ropporin重组蛋白免疫兔,制备人Ropporin多克隆抗体.结果:以构建的pQE30-Ropporin质粒转化大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达和纯化得到相对分子质量与鼠Ropporin蛋白一致的蛋白质,利用其免疫动物后.Western blot检测显示该蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔抗血清效价>1:512 000,对该蛋白具有高度特异性.结论:利用大肠杆菌原核表达系统表达和纯化了2LRopporin重组蛋白,并成功制备了人Ropporin多克隆抗体.     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原TPx蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体制备

目的 原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen, ESA)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase, TPx),并纯化TPx蛋白及制备兔多克隆抗体。方法 通过全基因合成的方法PCR扩增TPx基因。将扩增的TPx基因克隆至原核表达质粒pET30a载体中,构建重组质粒pET30a-TPx并转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,12%SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化,Western blot鉴定TPx重组蛋白的纯化效果。用纯化的TPx重组蛋白免疫新西兰兔,制备TPx多克隆抗体,ELISA测定纯化抗体的效价。结果 成功构建重组质粒pET30a-TPx,经IPTG诱导表达,获得以可溶性形式高效表达的TPx重组蛋白,相对分子质量约为22.43×10³,纯化后的带有His标签的TPx重组蛋白能被兔抗血清识别。用纯化的TPx重组蛋白免疫新西兰兔,获得TPx多克隆抗体,其ELISA效价为1∶1 126 400,抗体纯度为85...     

弓形虫TgMIC16多克隆抗体制备 纯化 及其在亚细胞定位中的应用

目的 制备并纯化弓形虫微线蛋白16（TgMIC16）兔源多克隆抗体,并利用制备的多克隆抗体对该蛋白进行亚细胞定位。方法 利用原核表达、纯化的TgMIC16重组蛋白与等体积弗氏佐剂混合,背部皮下、多点注射免疫新西兰大白兔,于第3次加强免疫后的第14天收集兔血清,Protein A亲和纯化柱纯化,用ELISA和蛋白质印迹（Western blotting）分别检测抗体效价和抗体特异性。用弓形虫RH株速殖子感染人包皮成纤维（HFF）细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,采用间接免疫荧光（IFA）检测TgMIC16 在感染细胞中的定位。结果 间接ELISA 结果显示,制备的TgMIC16多克隆抗体滴度为1∶512 000;Western blotting 结果显示,TgMIC16抗体特异性良好;IFA结果显示,TgMIC16定位在弓形虫微线体。结论 本研究制备并纯化了抗弓形虫TgMIC16兔源多克隆抗体,并成功应用于TgMIC16在弓形虫微线体的免疫荧光定位。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

Anti-endothelial cell antibodies in connective tissue diseases associated with pulmonary arterial hypertension

Objective

To investigate the prevalence of anti-endothelial cell antibodies (AECA) in connective tissue diseases (CTD) associated with pulmonary arterial hypertension (PAH) and to corroborate the pathologic function of AECA in PAH-associated CTDs.

Methods

AECA were detected by cellular enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in sera of 19 PAH-associated CTD patients, 22 CTD patients without PAH involvement, and 20 age- and sex-matched healthy individuals as controls. Using IgG purified from the sera of AECA-positive, AECA-negative, and healthy subjects, the effects of AECA on the expression of ICAM-1 and the chemokine regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted (RANTES) in cultured endothelial cells were also evaluated.

Results

A total of 12 of the 19 (63.2%) CTD patients with PAH, 9 of the 22 (40.9%) CTD patients without PAH, and 1 of the 20 (5%) healthy controls were positive for AECA, which were calculated as ELISA ratio (ER) values. ER values in PAH-associated CTD patients were significantly higher than those with CTD without PAH (3.68±2.05 versus 1.67±1.07, P<0.001). IgG purified from AECA-positive sera induced a significantly increased level of ICAM-1 expression after 48 h incubation (795.2±32.5 pg/mL) compared with AECA-negative or healthy control IgG (231.5±27.1 and 192.8±33.4 pg/mL, respectively; P<0.001). In addition, RANTES production by cultured human pulmonary arterial endothelial cells (HPAECs) increased in both a time- and concentration-dependent manner in response to incubation with purified AECA-positive IgG.

Conclusions

AECA could be involved in CTD and might participate in the pathogenesis of PAH-associated CTD.     

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因（TaRPI。8）,探索其应用前景。方法用RT—PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPI．8基因,克隆到原核表达质粒pET一28a（＋）中,在大肠埃希茵BL21／DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a（＋）一TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21／DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPI．8基因可在大肠埃希菌BL21／DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原的表达及血清学诊断价值的比较

目的诱导表达并纯化细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原,比较两个重组蛋白对囊型包虫病(CE)的血清学诊断价值。方法 IPTG诱导转染至E.coliBL21(DE3)LysS的pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2重组原核表达质粒,表达和纯化EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白,用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白,并通过超声裂解法进行纯化,以CE病人及囊虫病人血清为一抗,Western blot法检测两个重组蛋白免疫反应性。结果细粒棘球绦虫重组抗原pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2重组原核表达质粒得到成功诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析,重组蛋白分子质量单位为28 ku和38 ku;Western blot结果表明,EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白均能被CE病人血清特异性识别,16份CE病人血清中,以EgAgB8/1重组蛋白为抗原时11份阳性,以EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白为抗原时...     

A protein kinase that phosphorylates the C-terminal repeat domain of the largest subunit of RNA polymerase II.

The unique C-terminal repeat domain (CTD) of the largest subunit (IIa) of eukaryotic RNA polymerase II consists of multiple repeats of the heptapeptide consensus sequence Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. The number of repeats ranges from 26 in yeast to 42 in Drosophila to 52 in mouse. The CTD is essential in vivo, but its structure and function are not yet understood. The CTD can be phosphorylated at multiple serine and threonine residues, generating a form of the largest subunit (II0) with markedly reduced mobility in NaDodSO4/polyacrylamide gels. To investigate this extensive phosphorylation, which presumably modulates functional properties of RNA polymerase II, we began efforts to purify a specific CTD kinase. Using CTD-containing fusion proteins as substrates, we have purified a CTD kinase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. The enzyme extensively phosphorylates the CTD portion of both the fusion proteins and intact subunit IIa, producing products with reduced electrophoretic mobilities. The properties of the CTD kinase suggest that it is distinct from previously described protein kinases. Analogous activities were also detected in Drosophila and HeLa cell extracts.     

结核分枝杆菌Hsp65的表达、纯化与鉴定

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后,通过基因内部的单一酶切位点进行连接。将完整的hsp65基因克隆到pProEX HTa载体并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。获得的纯化蛋白与10例临床可疑结核病人血清进行Western-blot分析。结果获得的结核分枝杆菌Hsp65基因序列与GenBank公布的一致;表达蛋白相对分子质量为65 kDa,与文献报道相同;Western-blot结果显示,在相对分子量约65 kDa处与鼠抗MTB Hsp65 mAb特异性结合带;纯化的目的蛋白与8例病人血清有特异性结合条带,2例为阴性,该结果与临床诊断一致。结论成功表达、纯化和鉴定了Hsp65蛋白,为其在结核病诊断研究中的应用奠定了基础。     

Anti-ribosomal P protein antibodies detected by immunoblotting in patients with connective tissue diseases: their specificity for SLE and association with IgG anticardiolipin antibodies

OBJECTIVE: To assess the prevalence and clinical and serological associations of anti-ribosomal P protein antibodies (anti-P antibodies) in patients with connective tissue diseases (CTDs) and investigate the immunobiological nature of autoantibody clustering in which anti-P antibodies play a part. METHODS: IgG anti-P antibodies in the sera of 267 patients with CTDs and 31 healthy subjects were analysed by immunoblotting performed on cytoplasmic extract of Raji cells. 60 patients with systemic lupus erythematosus (SLE), 32 systemic sclerosis, 46 primary Sj?gren's syndrome, 16 poly/dermatomyositis, 11 rheumatoid arthritis, 8 undifferentiated CTD, 72 overlap CTD, and 22 primary antiphospholipid syndrome were studied. Anti-P antibodies were affinity purified by elution from nitrocellulose bound antigen and tested by ELISA for their binding activity to cardiolipin. RESULTS: Anti-P antibodies were detected in 16 (6%) patients and in none of the controls: 12/60 SLE (20%) and 4/80 undifferentiated/overlap patients with CTD (5%). A close association of IgG antibodies with P proteins and with cardiolipin was seen in lupus sera (p=0.0009, odds ratio 18.33). Anti-P antibodies from 9 of 12 anti-P lupus serum samples could be affinity purified and none of the affinity purified fractions cross reacted with ELISA plate coated cardiolipin. CONCLUSIONS: Anti-P immunoreactivity is a specific marker of SLE and lupus-like disease and its detection is recommended as a powerful diagnostic tool. Anti-P antibodies are strongly clustered with IgG anticardiolipin antibodies in lupus sera, even if they are independently elicited. This suggests that their cognate autoantigens play a part in a common pathogenetic pathway in SLE.     

pTWIN1-EgAgB8/3自剪切融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的 表达获得较纯的细粒棘球绦虫AgB8/3重组抗原(rEgAgB8/3)。方法 根据GeneBank登陆号(AF362442)下载目的基因核酸序列,利用DNAman软件设计引物,对EgAgB8/3编码分泌型多肽片段的核酸序列进行PCR扩增,测序鉴定其正确性后定向连入原核表达质粒pTWIN1上,并转化至大肠杆菌ER2566,IPTG诱导表达CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白后进行纯化,用SDS-PAGE电泳和western blot分析鉴定融合蛋白与目的蛋白rEgAgB8/3的表达量和纯度。结果 成功克隆获得EgAgB8/3基因目的片段和具有蛋白自剪切功能的重组表达载体pTWIN1-EgAgB8/3,并鉴定其表达的融合蛋白主要以可溶形式存在;构建的重组载体中融合标签的几丁质结合域(CBD)和内含肽(intein1)分别使亲和层析纯化和融合标签自剪切一步完成。结论 成功的构建重组表达载体pTWIN1-EgAgB8/3,获得高表达融合蛋白CBD-intein1-EgAgB8/3,并经简单后续处理即可获得含极少任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白rEgAgB8/3,尽可能保证了其原有的结构和活性,为抗rEgAgB8/3特异性单克隆抗体的快速制备奠定了基础。