CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT方法的建立及其在结核分枝杆菌感染诊断中的应用价值

目的建立应用酶联免疫斑点试验(Enzyme Linked-Immunospot Assay,ELISPOT)检测结核分枝杆菌感染的方法 ,评价CFP10/ESAT6融合蛋白抗原在检测结核分枝杆菌感染中的应用价值。方法通过比较不同的实验条件确定ELIS-POT检测结核分枝杆菌感染方法的最佳细胞浓度、孵育时间、蛋白抗原浓度等,建立ELISPOT方法。以PPD皮肤试验作对照。结果 ELISPOT方法的最佳实验条件为:每孔细胞浓度2×105,CFP10/ESAT6融合蛋白抗原浓度20~40μg/mL,细胞孵育时间20h。应用PPD皮试检测30例健康体检者、38例非结核疾病患者和40例结核病患者的阳性率分别为40.0%、0%、72.5%,而ELISPOT检测的阳性率分别为20.0%、10.5%、92.5%。应用ELISPOT检测40例结核病痰菌阳性组和阴性组的灵敏度分别为94.4%、90.9%。结论应用CFP10/ESAT6融合蛋白作为抗原建立的ELISPOT方法可初步应用于诊断结核分枝杆菌感染、辅助结核病诊断。     

CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值。方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体。优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体。结果 重组质粒 pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。融合蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40%。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95%以上。Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500。检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化

目的克隆表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白并纯化,测抗原的免疫原性,为结核病的临床诊断提供有效的候选抗原。方法利用生物信息学分析免疫优势位点,设计不同引物,采用聚合酶链反应（PolymeraseChain Reaction,PCR）扩增出相应基因片段,插入pET30a表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达目的蛋白,亲和纯化后用H37Rv免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定其免疫原性。结果 PCR扩增的CFP10、ESAT6和Rv33425基因片段与基因文库（Genbank）报道的完全一致。三者在大肠杆菌BL21（DE3）中融合表达的产物约为22kDa,与预计大小相吻合。Ni-NTA亲和纯化出目的蛋白。ELISA显示该蛋白具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425融合基因片段的融合表达纯化后,可作为结核病免疫诊断的一个候选抗原。     

结核分枝杆菌ESAT6、CFP10基因DNA疫苗对小鼠免疫原性的初步研究

目的 研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果.方法 以构建的真核表达载体pEGFP-N1ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为：生理盐水组（SLYS）、卡介苗组（KJM）、pEGFP N1组（P-N1）、pEGFP-N1 ESAT6组（P-N1-E）、pEGFP N1-CFP10组（P-N1-C）、卡介苗加pEGFP-N1组（K＋P-N1）、卡介苗加pEGFP-N1-ESAT6组（K＋P-N1-E）和卡介苗加pEGFP-N1 CFP10组（K＋P-N1-C）.每只小鼠皮内注射100μL卡介苗,每只小鼠肌肉注射50μg质粒,每组共注射3次.以纯化的ESAT6、CFP10蛋白作为抗原,用DOT ELISA方法检测小鼠血清中的抗体;用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ的变化.结果 免疫3次后的小鼠血清中检测到针对CFP10蛋白的抗体,未检测到针对ESAT6蛋白的抗体.但二者血清中IFNγ水平都有显著上升,K＋P N1-C和K＋P-N1-E免疫3次后,测得的IFN-γ平均含量为（107.591±7.3281）pg/mL和（95.7503±9.0184） pg/mL,显著高于免前、一免、二免（P＜0.01）.结论 结核分枝杆菌ESAT6,CFP10基因DNA疫苗和卡介苗联合应用后可诱导小鼠产生有效的细胞免疫应答,为DNA疫苗的研究奠定一定的基础.     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白21 (Culture filtrate protein 21, CFP21)原核表达载体,获得CFP21蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,PCR 扩增cfp21基因,质粒PET28a ( + )为表达载体,构建PET28a（+）/cfp21质粒,转化入大肠埃希菌DH5α中,抽提质粒,PCR扩增,测序,转化到大肠埃希菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS PAGE分析,并用His Bind 蛋白纯化试剂盒纯化CFP21。结果构建、表达和纯化了CFP21,分子量约为24kD,主要以包涵体形式存在。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,纯化得到CFP21蛋白,为CFP21的进一步研究奠定基础。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定

目的 在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价.方法 以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白.以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定. 结果 结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上.重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5 μg/ml 重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml) 等效.结论 重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂.     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H₃₇R_v为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上。重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5μg/ml重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml)等效。结论重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂。     

酶联免疫斑点技术在结核病诊断中的应用现状

酶联免疫斑点技术（ELISPOT）由Czerkinsky等[1]于1983年根据酶联免疫吸附实验（ELISA）而建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学新技术.起初用于检测B淋巴细胞分泌抗体的数量来推断B淋巴细胞的功能,后来用于检测T淋巴细胞分泌细胞因子的数量来推断T淋巴细胞功能.Lalvani等首先将ELISPOT用于结核病的诊断后,相关报道日益增多.现将ELISPOT在结核病诊断中的进展综述如下.     

酶联免疫斑点技术及其在结核诊断中的研究进展

结核病已经成为一个严重的公共卫生问题，我国已有1／3人口感染了结核菌，受感染人数超过了4亿，据研究受感染人口中有10％的人发生结核病。因此，提高早期诊断结核病和结核潜伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的水平对于结核病的控制具有极为重要的价值。结核病的诊断主要依靠影像学检查、结核菌素试验（tuberculin skin test，TST）及痰结核菌培养等方法。     

ESAT6和CFP10融合蛋白抑制巨噬细胞自噬体形成的实验研究

目的观察ESAT6和CFP10融合蛋白对感染MTB的巨噬细胞自噬体形成的抑制作用。方法雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞自噬体形成后,用MTB毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用25μg/mL的ESAT6-CFP10融合蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,计数MTB的菌落数。提取巨噬细胞总RNA和蛋白,以RT-PCR和免疫印迹方法检测自噬相关基因（atg）表达水平的变化。结果 ESAT6-CFP10融合蛋白后可抑制巨噬细胞中自噬体的形成,显著提高CFU指数（P〈0.05）,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显（P〈0.05）。结论 ESAT6和CFP10融合蛋白可通过调控atg表达水平影响巨噬细胞自噬功能。     

结核分枝杆菌CFPl0-ESAT6-TB7．7的融合表达及其在小鼠上的细胞免疫学特性

目的构建结核分枝杆菌CFPl0-ESAT6-TB7．7融合蛋白的表达质粒,利用大肠杆菌表达系统获得原核蛋白,在小鼠模型上评价其细胞免疫学特性。方法通过PCR扩增出lhp—linker-esat6-linker和linker-Rv2654c片段,构建正确的pET32a（＋）-lhp—linker-esat6-linker—Rv2654e原核表达质粒,转化BL21（DE3）后在IPTG诱导下表达,并纯化该融合蛋白,westernblot验证蛋白的免疫原性,通过T细胞增殖实验和夹心ELISA评价其细胞免疫学特性。结果成功构建pET32a（＋）-lhp-linker—esat6-linker-Rv2654e原核表达质粒,SDS-PAGE显示在45kDa处出现目的条带,Westernblot证明融合蛋白对anti—ESAT6,ant-CFPl0,anti-His单抗和rGST—TB7．7多抗血清均有反应,说明该融合蛋白具有良好的免疫反应性,T淋巴细胞增殖实验显示该蛋白能明显引起小鼠的T细胞免疫反应。夹心ELISA实验也表明,融合蛋白刺激产生的IFN-7和IL-4水平与对照组相比均有显著性差异,同时融合蛋白诱导产生的IFN-7水平明显高于IL-4。结论CFPl0-ESAT6-TB7．7融合蛋白在大肠杆菌系统中实现可溶性表达,并获得免疫反应性良好的纯化产物,该融合蛋白能引起明显的T细胞增殖,具有诱导Th1型免疫应答的特性。     

结核分枝杆菌CFP10疫苗研究进展

本文综述了结核分枝杆菌1hp基因及表达蛋白CFP10的抗原性和免疫性，为结核病的疫苗研究和免疫机制研究提供参考。     

结核分枝杆菌CFP32蛋白的原核表达及其细胞免疫学检测价值评价

目的 克隆、表达与纯化结核分枝杆菌CFP32蛋白,并对其进行细胞免疫学特性评价。方法 PCR扩增cfp32基因片段,与pET-30a(+)构建重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,对融合蛋白进行纯化,ELISPOT试验测定其细胞免疫应答,通过牛结核外周血IFN-γ释放试验,评价其作为刺激原的能力。结果 构建了正确基因序列的重组质粒,并在BL21(DE3)中高效可溶性表达,融合蛋白大小为32 ku,纯度达91.8%。ELISPOT显示CFP32蛋白刺激机体分泌IFN-γ和IL-4的细胞数相当,呈现Th1/Th2的平衡。在牛结核外周血IFN-γ释放试验中,其阳性符合率和阴性符合率分别为40%和73.3%,与牛型PPD刺激结果的相关系数为0.684。结论 成功构建CFP32蛋白重组表达菌,该蛋白引起的免疫应答趋向于Th1/Th2的平衡,并且有作为刺激原用于牛结核病检测的潜力。     

重组耻垢分枝杆菌Msmc^2-CFP10-ESAT6的构建

目的构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pB-CG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别。结论结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达。