静电吸附法与生物素-亲和素桥联法制备PSMA抗体靶向纳米微泡的对比实验研究

目的比较静电吸附法和生物素-亲和素桥联法制备前列腺特异性膜抗原（PSMA）抗体靶向纳米微泡的物理特性和靶向黏附率。方法分别应用静电吸附法和生物素一亲和素桥联法制备PSMA抗体靶向的纳米微泡,检测其物理性状;光镜下观察两种微泡与前列腺癌细胞LNCaP和c4—2的靶向能力,并与胃癌细胞MKN45对照;对比分析两种靶向纳米微泡的粒径、浓度及与前列腺癌细胞结合能力。结果两种靶向纳米微泡均呈圆形,表面光滑,大小均匀,分散度好,无聚集,粒径均〈1000nm。静电吸附法制备的靶向纳米微泡平均粒径为（702．96±66．65）nm,平均浓度为（3．46±0．30）×10^8／ml,与前列腺癌细胞LNCaP黏附率（77．2±3．19）％,与C4-2细胞黏附率（61．00±4．47）％;生物素-亲和素桥联法制备的靶向纳米微泡平均粒径为（609．90±37．40）nm,平均浓度约（4．52±0．19）×10^8／ml,与前列腺癌细胞LNCaP黏附率（96．60±1．14）％,与C4-2细胞黏附率（94．00±1．58）％。两种靶向纳米微泡的粒径、浓度及与前列腺癌细胞黏附率比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）;与胃癌细胞MKN45均无黏附。结论生物素-亲和素桥联法是一种高效、灵敏、稳定、特异性强的PSMA抗体靶向微泡制备方法,较静电吸附法具有更大的优势。     

携载PSMA单抗靶向前列腺癌的纳米级脂质微泡的制备及体外寻靶能力

目的制备携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡,并观察其体外寻靶能力。方法利用静电吸附法制备携载PSMA单抗靶向前列腺癌的脂质纳米级微泡,检测其一般特性;免疫荧光法检测抗体与纳米级微泡的结合情况;用细胞免疫荧光分析鉴定PSMA的表达及其在细胞膜上的定位;普通光镜下观察靶向微泡对前列腺癌细胞的寻靶能力,同时以胃癌细胞作对照。结果携载PSMA单抗的靶向纳米级微泡分布均匀,平均粒径为(623.70±66.05)nm,免疫荧光法显示微泡表面可见绿色荧光,细胞免疫荧光检测前列腺癌细胞膜高表达PSMA,体外寻靶实验显示该靶向微泡可与人前列腺癌LNCAP及C4-2细胞牢固结合,而与胃癌MKN45细胞不结合。结论本实验成功制备的携载PSMA单抗靶向人前列腺癌的纳米级脂质微泡具有较强的体外寻靶能力,能特异性地与前列腺癌细胞结合。     

叶酸靶向超声造影剂的制备及体外寻靶实验研究

目的 制备偶联叶酸的靶向超声微泡造影剂,鉴定其基本性质,并探讨体外寻靶能力.方法 将DSPE-PEG(2000)Folate溶入微泡成膜材料中,制备叶酸靶向超声微泡造影剂.用DFY型超声图像定量分析诊断仪检测微泡粒径和浓度.通过光镜和激光共聚焦显微仪观察该靶向造影剂对SKOV3细胞的体外寻靶情况,以普通超声微泡作对照.结果 靶向超声微泡的大小、粒径及分布与普通超声微泡相似.体外寻靶试验显示,该靶向微泡可以较多并牢固地聚集到SKOV3细胞表面,而普通微泡对照组未见特异性结合.结论 成功制备出偶联叶酸的靶向超声微泡造影剂.该造影剂在体外对高表达叶酸受体的SKOV3细胞具有较强的特异性亲合力,有望成为靶向显像卵巢癌的理想造影剂.     

PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡制备和体外寻靶能力实验研究

目的探究前列腺特异性膜抗原(PSMA)单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡的制备方法,对其体外寻靶能力予以观察。方法采用静电吸附法对PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡进行制备,观察其特性,对抗体与纳米级微泡结合情况予以免疫荧光法检测,采用细胞免疫荧光法对PSMA表达以及在细胞膜上的定位予以鉴定,观察靶向微泡对前列腺癌细胞的寻靶能力,并将胃癌细胞作为对照。结果 PSMA单抗靶向纳米级微泡呈现出均匀分布状态,平均粒径为(626.25±66.02)nm;经过免疫荧光法试验,显示微泡表面存在绿色荧光;对前列腺癌细胞膜给予细胞免疫荧光检测其PSMA呈现出高表达;体外寻靶实验显示靶向微泡能够实现与人前列腺癌LNCAP、C4-2细胞的结合,但其与胃癌MKN45细胞无法结合。结论 PSMA单抗靶向人前列腺癌纳米级脂质微泡体外寻靶能力强,能够实现与前列腺癌细胞的有机结合。     

携细胞间黏附分子1抗体的Sono Vue微泡造影剂靶向识别受损内皮的实验研究

目的 探讨静电吸附法制备的携细胞间黏附分子1抗体靶向微泡在体外和体内的寻靶能力.方法 采用静电吸附法制备携ICAM-1抗体的靶向SonoVue微泡.体外培养经IL-1β刺激大量表达ICAM-1的人血管内皮细胞ECV304,采用免疫荧光法检测靶向微泡与其结合能力.构建兔急性心肌梗死模型,进行靶向微泡的心肌造影,采用冷冻切片和免疫荧光法榆测靶向微泡与受损血管内膜结合能力.结果 在体外实验中,可见大量携ICAM-1抗体靶向微泡与刺激后ECV304细胞紧密结合,仅有少量靶向微泡与正常ECV304细胞结合.体内实验中,可见大量携ICAM-1抗体靶向微泡在兔梗死心肌受损血管内膜处黏附,仅可见少量靶向微泡在正常血管内膜处黏附.结论 携ICAM-1抗体靶向微泡在体内、体外均能与受损血管内皮特异性结合,不仅有利于靶向超声造影显像,更为微泡携带药物或基因在局部定向释放开辟良好前景.     

携GL-7靶向微泡造影剂对高脂饮食兔腹主动脉内膜的靶向作用

目的 探讨携GL-7靶向微泡造影剂对高脂饮食兔腹主动脉内膜体外特异性结合及体内增强显影效果.方法 14只新西兰兔用高脂饮食法建立腹主动脉内膜损伤模型,并随机分为两组,4周后分别使用对照微泡和靶向微泡造影剂进行腹主动脉超声造影,以视频密度法评价两种造影剂对动脉内膜的增强效果,荧光显微镜观察两种造影剂体内结合情况及与动脉内膜荧光染色的结合情况及荧光强度统计分析.结果 对照微泡、靶向微泡造影后血管内膜回声均较造影前增强,靶向微泡造影与对照微泡造影比较,血管内膜峰值视频密度差异有统计学意义(P<0.05).荧光显微镜观察,靶向微泡血管腔内呈现绿色荧光,而对照微泡血管腔内仅有微弱的绿色荧光.动脉血管冰冻切片结果显示,靶向微泡造影组动脉内膜有绿色荧光表达,而对照微泡造影组绿色荧光表达较弱,两组荧光强度差异有统计学意义(P<0.05).结论 GL-7靶向微泡造影剂与兔动脉血管内膜体内、体外特异性结合,可显著增强兔腹主动脉内膜靶向显影.     

生物素-亲和素介导以KDR为靶点的脂质体超声造影剂体外靶向实验研究

目的 以与VEGF的主要受体KDR特异性结合的小肽K237为配体研制靶向脂质体超声造影剂并进行体外性能鉴定.方法 采用"生物素一亲和素"桥接法构建靶向微泡(P-Bio-Av-Bio-Mbs),将KDR不同程度表达的细胞LOVO、HUVECs和LS174T分别与P-Bio-Av-Bio-Mbs孵育,同时另将荧光标记生物素-亲和素桥接靶向脂质体微泡(FITC- P-Bio-Av-Bio-Mbs)、荧光标记的单纯小肽微泡复合物(FITC-P-Mbs)及荧光标记的普通脂质体微泡(FITC-Mbs)分别与LOVO细胞孵育,光镜及荧光显微镜观察微泡与细胞结合的花环形成率及荧光强度;分别以10 ?g、50 ?g的小肽K237预先与LOVO细胞孵育,再将P-Bio-Av-Bio-Mbs与LOVO细胞孵育,观察细胞周围微泡分布.结果 KDR强阳性表达的LOVO细胞周围花环形成率高达90.52%,荧光强度3级,KDR阳性表达的HUVECs周围花环形成率53.46%,荧光强度2级,KDR阴性表达的LS174T细胞周围少数微泡黏附,花环形成率5.57%.荧光强度0～1级,组间花环形成率比较差异有统计学意义(P<0.05).FITC-P-Bio-Av-Bio-Mbs、FITC-P-Mbs及FITC-Mbs与LOVO细胞结合,花环形成率分别为89.62%、7.56%、0%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05),荧光强度分别为3级、0～1级、0级.10?g预处理组靶细胞周围花环结构明显减少,50 ?g封闭组靶细胞周围无花环形成.结论 以KDR为靶点携小肽K237的靶向脂质体造影剂通过生物素-亲和素桥介导成功制备,在体外能与靶细胞高效特异结合.针对KDR为靶点进行肿瘤新生血管分子靶向显像可能为肿瘤早期诊断提供新的思路.     

靶向血管内皮生长因子受体2超声造影剂的制备及其体外寻靶能力实验研究

目的:制备靶向血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)超声造影剂,评价其物理性质及对肿瘤细胞的寻靶能力。方法:利用生物素-亲和素桥接法将微米级超声造影剂USphere与VEGFR2抗体结合,制备靶向VEGFR2超声造影剂,检测其粒径分布;用免疫荧光法检测不同细胞株(高转移肝肿瘤细胞MHCC-97H及正常肝细胞LO2)中VEGFR2表达强度,以及靶向与非靶向VEGFR2超声造影剂对MHCC-97H和LO2细胞的结合能力。结果:靶向VEGFR2超声造影剂微泡分布均匀,平均粒径(1 012.67±78.59)nm,免疫荧光法显示VEGFR2抗体可特异性连接于微泡表面。标记荧光的VEGFR2抗体在MHCC-97H细胞高表达,在LO2细胞低表达。免疫荧光定量显示靶向VEGFR2造影剂在MHCC-97H细胞中的荧光强度比值(微泡荧光强度/细胞荧光强度)为0.75±0.32,显著高于其他3组(P0.01)。结论:本研究成功制备靶向VEGFR2超声造影剂,其大小稳定均一,可与高表达VEGFR2的MHCC-97H细胞特异性结合。     

叶酸介导靶向高分子造影剂的制备及体外识别研究

目的 合成叶酸介导靶向的聚乳酸共聚物,以其为靶向膜材制备靶向造影剂,表征造影剂性质.方法 以自制的叶酸-脯氨酸-乳酸共聚物(Fa-PLLA-Hpr)为膜材,应用双乳化-冷冻干燥法制备叶酸介导靶向高分子造影剂(MB-Fa-PLLA).采用激光粒径测量仪检测微泡的粒径,通过光镜观察该靶向造影剂(靶向造影剂实验组)对人卵巢癌SKOV3细胞的体外寻靶情况,并与游离叶酸干预组及空白对照组(普通微泡)比较.结果 FT-IR表征了靶向膜材的结构.成功制备叶酸介导靶向聚乳酸共聚物MB-Fa-PLLA.MB-Fa-PLLA在光镜下大小分布均匀,形态圆整,65％的微粒直径分布为500～800 nm,呈单峰分布,其亲水性较普通高分子微泡更好.体外寻靶实验显示,MB-Fa-PLLA可以较多并牢固地聚集到SKOV3细胞表面,而普通微泡未见特异性结合.结论 MB-Fa-PLLA亲水性好,对高表达叶酸受体的SKOV3细胞具有较强特异性亲合力,其有望成为靶向显像叶酸高表达肿瘤的理想造影剂.     

抗内皮细胞黏附分子-1靶向微泡介导hAng-1基因转染治疗兔心肌缺血的实验研究

目的 探讨应用抗心肌内皮细胞粘附分子-1（ICAM-1）靶向微泡能否提高血管生成素-1基因在缺血心肌中的转染效率.方法 体外实验检测抗ICAM-1靶向微泡与经人白细胞介素-1β刺激后的ECV304细胞结合的程度.体内实验分三组：①对照组：hAng-1基因＋超声照射;②非靶向微泡组：携hAng-1基因微泡＋超声照射;③靶向微泡组：携hAng-1基因的抗ICAM-1靶向微泡＋超声照射.制作兔急性心梗模型,分别用上述三种方法从静脉导入hAng-1基因.2周后心肌造影检测梗死心肌灌注状况聚合酶链反应（RT-PCR）检测hAng-1基因的mRNA表达以评价转染疗效.结果 携抗ICAM-1抗体的微泡在体外能大量靶向结合到产生炎性反应的ECV304细胞周边.应用靶向微泡转染2周后,左室内径减小,射血分数升高,但与非靶向微泡比较,差异无统计学意义（P〉0.05）,而心肌造影显示心肌内造影剂填充量较非靶向微泡组增多,且 RT-PCR定量灰度分析hAng-1mRNA（1.04±0.08）高于非靶向微泡组（0.53±0.04）,差异有统计学意义（P〈0.01）.结论 微泡与抗ICAM-1抗体连接后形成靶向微泡载体,可明显提高hAng-1基因在体内的转染效率,增加心肌梗死后局部的血管新生效应.     

LHRHa靶向微泡造影剂的制备及体外寻靶实验

目的 制备人卵巢癌靶向超声造影剂,观察其体外寻靶能力。方法 采用生物素-链霉亲和素法制备促黄体生成素释放激素类似物(LHRHa)靶向脂质微泡,以免疫荧光染色验证LHRHa与脂质微泡的结合情况,并以普通脂质微泡作为对照,在倒置显微镜下观察LHRHa靶向脂质微泡对人卵巢癌A2780/DDP的体外寻靶能力。结果 LHRHa靶向脂质微泡免疫荧光阳性;体外寻靶实验显示LHRHa靶向脂质微泡能够与表面存在LHRH受体的A2780/DDP细胞特异性结合,而普通脂质微泡则不能结合。结论 利用生物素-链霉亲和素方法可成功制备LHRHa靶向脂质微泡造影剂,该靶向造影剂具有体外寻靶能力。     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

低频超声联合SonoVue微泡促进裸鼠基因体内转染的可行性

目的 探讨利用低频超声联合SonoVue微泡造影剂促进基因转染人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤的可行性。方法 采用人前列腺癌PC-3细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后随机分为空白组（仅注射生理盐水）、单纯质粒组（注射生理盐水和质粒混悬液）、低频超声组（注射生理盐水和质粒混悬液后超声辐照）和低频超声+微泡组（注射超声微泡造影剂和质粒混悬液后超声辐照）。超声辐照条件：功率3 W/cm²,占空比5：5,频率80 kHz,辐照10 min。基因转染3天后在激光共聚焦显微镜下观察各组绿色荧光蛋白表达情况,并分析其平均荧光强度;同时行常规病理检查,观察低频超声联合微泡辐照对组织的损伤程度。结果 4组中,仅低频超声+微泡组可见明显绿色荧光,与其他各组差异均有统计学意义（P均<0.05）;空白组、单纯质粒组和低频超声组均未见明显绿色荧光。各组均未见明显组织损伤。结论 SonoVue微泡造影剂在低频超声辐照下能够安全有效地促进pEGFP基因转染进入人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤组织内。     

双靶向超声微泡造影剂评价小鼠缺血再灌注心肌

目的 制备同时携载P选择素和ICAM-1抗体的靶向超声微泡造影剂,以评估小鼠缺血再灌注损伤心肌声学造影显像效果.方法 采用生物素-亲和素方法制备靶向微泡,于激光共聚焦显微镜下观察微泡形态,流式细胞仪检测连接效率.将24只健康昆明小鼠随机分成3组:结合双抗体选择素微泡组(MBd组)10只、结合P选择素单抗组(MBp组)10只,空白微泡组(MBc组)4只.结扎冠状动脉左前降支近左主干分支,制作心肌缺血再灌注模型,60 min后经尾静脉分别注射MBd、MBp及MBc,采集心肌对比造影图像.所有图像均采用Sonomath超声影像分析仪处理.结果 MBd组和MBp组对缺氧内皮细胞的黏附力以及对缺血再灌注区心肌显像增强程度显著高于MBc组(P均＜0.05),MBd组对缺血再灌注区心肌显像延迟时间高于MBp组(P＜0.05).结论 双靶向微泡联合超声造影是检测和评估小鼠缺血再灌注心肌的无创性手段.     

超声微泡连接特异性抗体的制备方法及靶向化处理因素对超声微泡物理性质的影响

目的 探讨超声微泡连接特异性抗体的制备方法及靶向化处理因素对超声微泡物理性质的影响.方法 应用生物素-链霉亲和素连接系统,使注射用六氟化硫微泡(SonoVue)与特异性抗血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)抗体相连接,用间接免疫荧光法检测抗体与微泡的连接,用马尔文激光粒径分析仪分别测定生物素化处理前后微泡的粒径,采用超声诊断仪评价微泡靶向化构建前后的显像效果.结果 SonoVue与特异性抗体成功连接,间接免疫荧光检测呈阳性.生物素修饰后的微泡粒径分布变窄,与普通微泡的超声显像效果略有差异.结论 通过生物素-链霉亲和素系统可以成功靶向化构建超声微泡,靶向化处理因素对微泡的粒径有一定影响,对微泡的超声显影效果略有影响.     

在生理血流条件下靶向超声微泡对P-选择素的靶向黏附效能

目的平行板流动腔评价在生理血流条件下携抗小鼠P-选择素单抗靶向超声微泡（MBp）的靶向黏附效能。方法采用＂亲和素-生物素＂桥接法构建MBp;在3种浓度（10、100和1000ng/ml）小鼠P-选择素Fc段（PSFc）包被的平行板流动腔和固定剪切应力下,以及最大包被浓度和不同剪切应力（0.2-1.7dyn/cm^2）下分别检测MBp的每分钟结合数量（结合率）,以抗小鼠P-选择素单抗封闭组和空白组为对照。在3种包被浓度下检测MBp达半数解离的剪切应力。所有分组样本数均为3。结果两对照组均未见有明显的MBp结合。实验组MBp结合率随包被浓度的增高而增加（P〈0.05）,然而与剪切应力呈现双向性（P〈0.05）。MBp达半数解离的剪切应力随包被浓度的增加而增大（P〈0.05）。结论MBp在生理条件下可与PSFc特异有效地结合,体外对靶向超声微泡的靶向黏附效能评价将有助于判定超声分子成像的效果和靶向微泡的在体应用环境条件。     

Optimization of Phase-Change Contrast Agents for Targeting MDA-MB-231 Breast Cancer Cells

Breast cancer remains a leading cause of death for women throughout the world. Recent advances in medical imaging technologies and tumor targeting agents signify vast potential for progress toward improved management of this global problem. Phase-change contrast agents (PCCAs) are dynamic imaging agents with practical applications in both the research and clinical settings. PCCAs possess characteristics that allow for cellular uptake where they can be converted from liquid-phase PCCAs to gaseous microbubbles via ultrasound energy. Previously, we reported successful internalization of folate-targeted PCCAs in MDA-MB-231 breast cancer cells followed by ultrasound-mediated activation to produce internalized microbubbles. This study examines the binding, internalization and activation of folate-receptor targeted PCCAs in MDA-MB-231 breast cancer cells as a function of gaseous core compositions, incubation time and ultrasound exposure period. In vitro results indicate that internalization and ultrasound-mediated activation of PCCAs were significantly greater using a 50:50 mixture of decafluorobutane:dodecafluoropentane compared with other core compositions: 50:50 octafluoropropane:decafluorobutane (p < 0.0001), decafluorobutane (p < 0.04) and dodecafluoropentane (p < 0.0001). Furthermore, it was found that PCCAs composed of perfluorocarbons with higher boiling points responded with greater activation efficiency when exposed to 12 s of ultrasound exposure as opposed to 4 s of ultrasound exposure. When evaluating different incubation times, it was found that incubating the PCCAs with breast cancer cells for 60 min did not produce significantly greater internalization and activation compared with incubation for 10 min; this was concluded after comparing the number of microbubbles present per cell before ultrasound versus post-ultrasound, and finding a ratio of intracellular microbubbles post-ultrasound/pre-ultrasound, 3.46 versus 3.14, respectively. The data collected in this study helps illustrate further optimization of folate-receptor targeted PCCAs for breast cancer targeting and imaging.     

靶向CD147纳米微泡的制备及超声成像能力检测

目的 制备靶向CD147纳米微泡造影剂,并评价其理化性质、对肝细胞肝癌(肝癌)细胞的靶向能力及超声成像能力.方法 将PLGA-PEG、DSPE-PEG2000-COOH、全氟丙烷饱和水溶液混合,通过偶联反应与CD147抗体结合,制备靶向CD147纳米微泡.将靶向CD147及非靶向纳米微泡分别与MHCC-97H(肝癌细胞...     

Dual-Targeted Microbubbles Specific to Integrin αVβ3 and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 for Ultrasonography Evaluation of Tumor Angiogenesis

Aggressive tumors are characterized by angiogenesis that promotes the migration and dissemination of tumor cells. Our aim was to develop a dual-targeted microbubble system for non-invasive evaluation of tumor angiogenesis in ultrasound. Avidinylated microbubbles were conjugated with biotinylated arginylglycylaspartic acid and vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) antibodies. Subcutaneous MHCC-97H liver carcinoma models were established. Non-targeted, αvβ3-targeted, VEGFR2-targeted and dual-targeted microbubbles was intravenously injected in series while acquiring ultrasound images of the tumor. The microbubbles were destroyed by a high-mechanical-index pulse 4?min after the injection. Peak intensity (PI) before and after the destructive pulse was recorded to compare contrast enhancement by different microbubbles. The targeting rates of the integrin-targeted, VEGFR2-targeted and dual-targeted groups were 95.02%, 96.04% and 94.23%, respectively, with no significant differences. Tumors in all groups were significantly enhanced. The time–intensity curve indicated no significant differences in arrival time, PI, area under the curve, amplitude and mean transit time. The difference in ultrasound signal intensity before and after the destructive pulse (⊿PI) for all targeted microbubble groups was significantly greater than that for the non-targeted microbubble group (all p values?<?0.05), and the difference for the dual-targeted microbubble group was significantly greater than those of both mono-targeted groups (p?<0.05).