骨髓间充质干细胞通过上调CD8+CD28-T细胞抑制T细胞的增殖

本研究旨在探讨CD8^ CD28^-T细胞在间充质干细胞(MSC)抑制T细胞增殖中的作用。应用尼龙毛柱分离T淋巴细胞。再经CD8磁珠分选出CD8^ T淋巴细胞；用植物血凝素(PHA)刺激与或未与MSC共培养3天的CD8^ T细胞，应用MTT法测定T细胞的增殖；应用流式细胞术分别检测与或未与MSC共培养8天的CD8^ T细胞亚群的变化及用PHA刺激与或未与MSC共培养3天的CD8^ T细胞亚群的变化。结果表明，MSC抑制PHA刺激引起的CD8^ T细胞的增殖，且这种抑制作用是剂量依赖性的；流式细胞术结果显示，与未经MSC处理的CD8^ T细胞相比，MSC显著上调共培养8天的CD8^ T细胞中的CD8^ CD28^-亚群。及经PHA作用72小时后的CD8^ T细胞中的CD8^ CD28^-亚群。结论：MSC通过上调CD8^ CD28^-T细胞发挥抑制作用。     

人骨髓间充质干细胞与脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应及PHA诱导转化的抑制

为研究和比较人骨髓间充质干细胞 (MSC)和脐血单个核细胞在体外的免疫调控能力 ,从人骨髓分离培养间充质干细胞 ,用Ficoll分离得到脐血单个核细胞 ,分别以不同剂量加入到外周血混合淋巴细胞培养体系和植物血凝素 (PHA)刺激的外周血淋巴细胞转化体系中 ,用MTT还原法测定细胞增殖 ,分别观察MSC和脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化的影响。结果显示 ,5× 10 4 ,1× 10 4 MSC以及 2× 10 5脐血单个核细胞均抑制混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞增殖 ,而 <1× 10 4 MSC和 <2× 10 5脐血单个核细胞对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用均不明显 ;5× 10 4 MSC对淋巴细胞增殖的抑制能力明显强于 2× 10 5脐血单个核细胞。结论 :大剂量的骨髓间充质干细胞和脐血单个核细胞在体外对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞转化均具有抑制作用 ,而且间充质干细胞的抑制能力强于脐血单个核细胞。     

骨髓间充质干细胞对T细胞亚群的影响

本研究探讨人骨髓间充质干细胞对植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激引起的T细胞增殖的影响和可能机制。应用CD3^＋磁珠分选T淋巴细胞，从骨髓分离出的间充质干细胞经照射后与T细胞共培养过夜，经PHA（5μg/ml）作用72小时后，应用BrdU检测T细胞的增殖情况，应用流式细胞术检测T细胞的Annexinv／PI的水平。对未经照射的骨髓间充质干细胞处理的T细胞，用PHA处理72小时后收集T细胞，应用流式细胞术检测CD4，CD8以及CD4和CD25的表达，同时设立未经PHA处理的T细胞与照射的骨髓间充质干细胞共培养组，及未经骨髓间充质干细胞处理的T细胞组。结果表明：骨髓间充质干细胞抑制PHA引起的T细胞的增殖，但不诱导T细胞凋亡。与未处理组相比，骨髓间充质干细胞处理组中T细胞的CD4^＋CD8^＋细胞比例无显著变化；但在PHA作用下，骨髓间充质干细胞处理组中T细胞的CD4^＋亚群显著增加，且呈剂量依赖性，但CD4^＋CD25^＋细胞亚群显著减少。结论：骨髓间充质干细胞抑制PHA刺激所引起的T细胞增殖，对CD8^＋T细胞的抑制作用更强．推测其可能的机制与CD4^＋调节性T细胞的参与有关．但与CD25^＋T调节细胞无明显关系。     

高迁移率族蛋白B1对人T淋巴细胞免疫功能影响的体外研究

目的观察高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对健康人T淋巴细胞增殖的影响，并对其机制进行初步探讨。方法分离健康人外周血单个核细胞（PBMCs），调整细胞浓度后接种于细胞培养板并加入重组人高迁移率族蛋白B1（rhHMGB1）进行刺激。以四甲基偶氮唑盐微量Ⅱ酶反应比色法（MTT）检测细胞数量和细胞活性，观察HMGB1对T淋巴细胞增殖活性的影响。采用四色流式细胞术（FCM）分析CD3^＋淋巴细胞CD4表达。细胞中自细胞介素-2（IL-2）、IL-2α受体（IL-2Rα）基因表达水平采用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）分析。结果①500～1000μg／L rhHMGB1作用48h后T淋巴细胞增殖反应显著抑制，低于这一剂量对其增殖活性影响不显著。②不同rhHMGB刺激时间和作用剂量对CD4^＋T淋巴细胞未造成明显改变，但rhHMGB1能时间-剂量依赖性增加Th2亚群比例，并因此降低Th1／Th2比值，刺激后T淋巴细胞免疫功能出现Th1优势向Th2优势偏移。③经植物血凝素激活后12hT淋巴细胞IL-2和IL-2Ra基因表达达到峰值；rhHMGB1与T淋巴细胞共同培养12h后，10～100μg／L剂量可明显上调IL-2和IL-2Ra基因表达；而较高剂量rhHMGB1（100～1000μg／L）刺激持续48h上述效应衰竭，并表现出相反的变化趋势。结论HMGB1对T淋巴细胞包括增殖、分化和细胞因子分泌等免疫功能具有直接调节效应。剂量蓄积和持续刺激可诱导T淋巴细胞功能亚群从促炎优势向抗炎优势转化。     

骨髓增生异常综合征患者Th1/Th2细胞平衡改变的临床意义

目的：探讨骨髓增生异常综合征（MDS）患者外周血CD4^＋、CD8^＋细胞亚群平衡的改变，以及与活化T细胞之间关系的临床意义。方法：选择14例难治性贫血患者（RA）和1例难治性贫血伴原始细胞增多患者（RAEB）的外周血，在PMA、Ionomycin、Monensin存在的条件下体外培养，进行细胞膜表面抗原和细胞内因子染色，并用流式细胞仪计数外周血表达CD3^＋ CD8^-IFN-γ^＋细胞（Th1）、CD3^＋CD8^-IL-4^＋细胞（Th2）、CD3^＋CD8^＋IF-γ^＋细胞（Tcl）、CD3^＋CD8^＋IL-4^＋细胞（Tc2）的百分率。结果与活化T细胞之间关系做相关性分析。结果：MDS组患者Th1细胞高于正常对照组（P〈0．05），体内的Th细胞向Th1细胞漂移，产生过多的造血抑制因子如IFN-γ，TNF-β等。Th2，Tc1，Tc2细胞与正常对照组相比无显著差异（P〉0．05）；CD4^＋CD45RO^＋细胞的百分率和Th1细胞的百分率呈正相关，相关系数为r=0．573（P〈0．05），CD4^＋CIN5RA^＋细胞的百分率和Th1细胞的百分率呈负相关，相关系数为r=-0．509（P=0．05），而和Th2，Tc1，Tc2的百分率无明显的相关性（P〉0．05）。结论：MDS患者存在有Th1／Th2细胞因子网络的失衡以及过多的造血抑制因子，且这些因子主要来源于T淋巴细胞。     

间充质干细胞对活化T淋巴细胞的免疫调节作用

本研究的目的是探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对活化T淋巴细胞的免疫调节作用及其在allo—HSCT相关GVHD防治中的作用。用终浓度为10μg/ml的PHA于不同时间作用T淋巴细胞，以^3H—TdR掺入法检测T细胞增殖功能；以不同数量的MSC分别与活化T淋巴细胞作用，根据MSC数量不同实验分为A组（对照组，不加MSC）、B组（MSC2×10^4）、C组（MSC4×10^4）、D组（MSC8×10^4），用^3H—TdR掺入法检测作用前后T细胞功能，FCM检测细胞免疫表型。结果显示，在终浓度为10μg／ml PHA作用下，T淋巴细胞的增殖能力随培养时间的延长而增强，48小时达高峰。FCM检测MSC细胞表型表明：CD44、CD105、CD29、FIK1表达阳性，不表达CD33、CD34、CD45、HLA—DR。随着MSC数量增加，与共培养前相比，T细胞的SI值逐渐降低（P〈0．05），但C组和D组间比较无差异（P〉0．05）。在低数量MSC作用下，CD3^＋CD4^＋表达低于对照组（P〈0．05），CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋高于对照组（P〈0．05）；C组和D组与对照组相比，CD3^＋CD4^＋表达明显降低（P〈0．01），CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋明显增高（P〈0．01）。结论：丝裂原PHA可以使T细胞活化；骨髓MSC在体外可以使活化T细胞功能和细胞免疫表型发生改变，下调CD3^＋CD4^＋的表达，上调CD3^＋CD8^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD152^＋的表达。     

TLR-2信号途径对新生儿免疫系统在淋巴细胞增殖和调节性T细胞扩增方面的影响

目的探讨TLR-2（Toll like receptor-2）信号途径对新生儿免疫系统在淋巴细胞增殖和调节性T细胞（Treg）扩增方面的影响及其与成人免疫系统的差别。方法应用TLR-2的配体。肽聚糖（PPG）和有丝分裂原．植物凝血素（PHA）刺激胎儿脐带血单核淋巴细胞（CBMC）和成人外周血单核淋巴细胞（PBMC），然后采用3^H胸腺嘧啶掺入法测淋巴细胞增殖情况及流式细胞技术检测活化T细胞，Treg细胞扩增情况。结果PPG和PHA刺激后，CBMC淋巴细胞总体明显增殖（P〈0．05），但PPC的刺激不能使活化T细胞和Treg细胞比例增加（P〉0．05）。PPG和PHA刺激后，PBMC淋巴细胞总体明显增殖（P〈0．05），且活化T细胞和Treg细胞比例均增加（P〈0．05）。此外，PPG诱导的CBMC淋巴细胞增殖强度弱于PBMC（P〈0．05）。结论TLR-2信号途径可以诱导新生儿淋巴细胞增殖但活化T细胞和Treg细胞比例不增加，与成人免疫系统的TLR-2信号途径存在差别。     

淋巴细胞亚群功能状态的影响

目的：探讨黄芪注射液对银屑病患者辅助性T淋巴细胞（Th细胞）亚群功能状态的影响。方法：对20例银屑病患者的外周血淋巴细胞体外分别经植物血凝素（PHA）和PHA＋黄芪诱导：即病例对照组和病例黄芪组,同时对10例健康志愿者外周血淋巴细胞体外经PHA诱导（即正常对照组）,各组培养48h,用ELISA法检测培养上清液中Th类细胞因子IFN-γ和IL-4含量。结果：病例对照组IFN-γ水平高于正常对照组（P〈0.05）,而IL-4水平低于正常对照组（P〈0．05）。病例黄芪组IFN-γ水平低于病例对照组（P〈0．05）,而IL-4水平高于病例对照组（P〈0．05）。结论：黄芪注射液可显著下调银屑病患者Th1亚群优势状态。促进向Th2亚群转换,改善患者Th1／Th2失衡状态,对银屑病的治疗具有重要意义。     

rhG-CSF对健康供者外周血和骨髓免疫特性影响的比较

本研究探讨rhG—CSF对健康供者外周血采集物（G—PB）和骨髓采集物（G—BM）免疫学特性影响的异同。用MTT法和夹心酶联免疫复合物（ELISA）法检测G—PB和G—BM中T淋巴细胞增殖能力和IL-4、IFN-7的分泌，并用流式细胞术测定两种移植物的T细胞亚群、树突状细胞（DC）亚群、单核细胞及共刺激分子CD28的表达。结果表明：G—PB中淋巴细胞，CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞，DC1、DC2以及单核细胞的含量，CD4／CD8的比值高于G—BM（P〈0，001）。G—PB的T淋巴细胞增殖能力高于G—BM（P〈0．05）；每微升G—PB移植物中T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ,IL-4的量均明显高于G—BM，且G—PB中IL-4／IFN-γ比值小于G-BM（P〈0．001），DC2与T淋巴细胞的比值也低于G—BM（P〈0．01）；而G-PB中CD4^＋、CD8^＋细胞上CD28表达的百分比和总体表达均高于G—BM（P〈0．001）。结论：rhG—CSF体内应用诱导G—PB和G—BM产生的T细胞免疫低反应性是有差异的，而两者之间的差异是G—PB和G—BM移植后移植物抗宿主病（GVHD）发生率和程度不同的免疫学基础。     

特发性血小板减少性紫癜患儿外周血T细胞亚型的分析

T细胞亚型分化漂移可能与一些自身免疫病的发病机制有关。本研究旨在通过分析特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thromboeytopenic purpura，ITP）患儿外周血Th／Tc、Th1／Th2、Tc1／Tc2细胞的平衡状态，探讨T细胞亚群失衡在ITP发病机制中的作用。收集30例ITP患儿外周抗凝静脉血，分离纯化得T细胞．以PE标记的抗CRTH2单克隆抗体和Cy5标记的抗CD4、CD8单克隆抗体作双色流式细胞术检测，分析ITP患儿Th／Tc、Th1／Th2、Tc1／Tc2比例的变化。结果显示：ITP患儿外周血T细胞与健康儿童相比，Th细胞百分率及Th／Tc比例明显下降（P〈0.05），Tc细胞百分率无明显变化（P〉0．05）；Th1及Th2细胞百分率明显下降（P〈0．05），Tc1及Tc2细胞百分率无明显变化（P〉0．05），Th1／Th2及Tc1／Tc2比例明显升高（P〈0.05）。结论：ITP患儿外周血可能存在细胞免疫功能低下及T细胞亚群漂移，Th1及Tc1细胞比例升高，呈明显Th1类细胞优势，此结果说明T细亚群分化异常在ITP发病过程中起着重要作用。     

人骨髓间充质干细胞对脐血T淋巴细胞转化的影响

为研究间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的免疫调节作用，从人骨髓中分离培养间充质干细胞，并通过其形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。将分离培养的间充质干细胞接种于96孔板中（分别为2000个/孔组与1000个/孔组），与经分离的脐血T淋巴细胞共培养3天，以单独培养的脐血T淋巴细胞为对照组，加入植物血凝素（PHA）刺激60小时，H^3-TdR标记后用液体闪烁计数仪检测，以观察MSC对脐血T淋巴细胞转化的影响。结果显示，当接种2000个MSC时，其对T细胞的增殖起抑制作用（抑制率为33.4％）；而接种1000个MSC时，其对T细胞的增殖起促进作用（促进率为22.5％）。由此得出结论，MSC免疫调控作用与其加入细胞数量相关，当MSC数量多时表现为负调控，而当MSC数量少时表现为正调控。     

人骨髓间充质干细胞体外对异基因T淋巴细胞表型的影响

为了研究间充质干细胞 (mesenchymalstemcell,MSC)的免疫调节作用 ,探讨防治异基因骨髓移植中移植物抗宿主病 (GVHD)和移植排斥反应 (HVGR)的可能途径 ,从人骨髓中分离培养间充质干细胞 ,并通过其形态的均一性及流式细胞术检测表面标志以鉴定其纯度 ,将MSC分别以 8× 10 4 (A组 )、4× 10 4 (B组 )和 2× 10 4 (C组 )个细胞 孔分别接种于 6孔板 ,并与经分离的外周血T淋巴细胞共培养 7天 ,以单独培养的外周血T淋巴细胞为对照组 ,用流式细胞仪分别在培养 0、2 4、72小时和 7天测定各组T细胞上CD3、CD4、CD8、CD2 5表达的变化。结果表明 :T细胞和MSC共培养组与T细胞单独培养组相比 ,A组和B组CD4 CD2 5 免疫调节性T细胞和CD8 T细胞明显增多 ,A组和B组之间无明显差别。实验组和对照组相比CD3、CD4、CD2 5表达无明显差别。结论 :骨髓MSCs在体外可使外周血T细胞表型发生改变 ,CD4 CD2 5 免疫调节性T细胞和CD8 T细胞明显增多 ,本研究结果为临床异基因造血干细胞移植预防GVHD时MSCs的输注数量提供了参考。     

间充质干细胞分泌TGF-β1抑制异体T细胞反应性

为探讨骨髓间充质干细胞（MSC）诱导异体T细胞反应性下降的机制。应用流式细胞术检测了异体T细胞与骨髓间充质干细胞共培养前后CD4，CD8，CD25和CD28等的变化，同时应用RT-PCR测定MSC是否表达IL-4，IFN-γ和TGF-β1等细胞因子，并用ELISA的方法验证培养上清中蛋白的存在。结果显示，异体T细胞与MSC共培养后，CD8^ 细胞增多，CD25^ 细胞减少，RT-PCR检测结果证明MSC高表达TGF-β1基因，但不表达IL-4和IFN-γ基因，ELISA证实MSC培养上清存在TGF-β1蛋白，其72小时分泌量约为1ng/ml。结论：骨髓MSC在体外可使异体T细胞对异体抗原的反应性减低，这种作用体现在细胞亚群的改变与MSC分泌TGF-β1有关，这一研究结果为预防HLA不相同合骨髓移植中GVHD的发生提出一条新的思路。     

间充质干细胞影响T淋巴细胞杀伤K562细胞效应的研究

本研究探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）对T淋巴细胞杀伤K562细胞的影响。从骨髓中分离培养MSCs，尼龙棉柱法分离外周血T细胞，将T细胞与MSCs共培养，用流式细胞术检测T细胞亚群的变化．乳酸脱氢酶法检测与MSC共培养及单独培养的T细胞对K562细胞的杀伤效应，用ELISA法检测IFN-γ IL-4的表达。结果表明，与MSC共培养3天后，CD4^＋与CD4^＋ CD25^＋ T细胞与单独培养组相比显著升高（P〈0．05），CD8^＋T细胞则无显著差异（P〉0．05）；与MSC共培养的T细胞对K562细胞的杀伤作用减弱，同时IFN-1表达减少，IL-4表达增加。结论：MSC减弱了T细胞对K562细胞的杀伤效应，与反应体系中CD4^＋ CD25^＋ T细胞比例增多及IFN-γ、IL-4表达水平改变有关。     

脐血CD34＋细胞体外诱导扩增红系细胞的探索

本研究利用脐血CD34＋细胞在体外大量扩增红系细胞为解决血源短缺、杜绝输血传染、克服稀有血型患者疑难配血等问题提供一种有益的途径。利用添加SCF、IL-3、EPO等细胞因子的无血清培养液扩增脐血来源的CD34＋细胞,并通过问充质干细胞的支持培养来诱导其向红系细胞扩增和分化。结果表明,经过23天培养以后,本方法可以使细胞的扩增倍数达到2．52×10^5,其中95％以上都是红系细胞,粒单系细胞和巨核细胞所占比例都在1％以内。无间充质干细胞的培养体系在细胞扩增数量及红系细胞所占比例方面都明显逊于有间充质干细胞支持的培养体系。结论：利用细胞因子和间充质干细胞可以在体外大量扩增红系细胞,其中间充质干细胞对红系细胞增殖和分化起重要的促进作用。     

羊水、脐带和骨髓来源间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制效果比较

目的：比较羊水来源间充质干细胞（ AF-MSC）、脐带来源间充质干细胞（ UC-MSC）和骨髓来源间充质干细胞（ BM-MSC）对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用。方法从妊娠中期羊水、新生儿脱落脐带、正常成人骨髓中分离获取原代AF-MSC、 UC-MSC和 BM-MSC。观察形态并采用流式细胞术检测表面分子。取传代培养的第3代的AF-MSC、 UC-MSC和 BM-MSC体外诱导培养后,观察体外诱导成骨成脂多向分化情况。将不同细胞浓度的AF-MSC, UC-MSC和 BM-MSC分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较3种不同来源的MSC对淋巴细胞增殖的调控作用。结果分离培养的AF-MSC, UC-MSC和BM-MSC分别表达MSC特异性表面分子CD29、CD70、 CD90,不表达造血干细胞表面分子CD45。体外传代培养的AF-MSC、 UC-MSC和BM-MSC对淋巴细胞增殖的抑制中,当淋巴细胞∶MSC为1∶1、1∶10、1∶50、1∶100时,对淋巴细胞增殖的抑制率AF-MSC最强, BM-MSC最弱。结论 AF-MSC、 UC-MSC和BM-MSC均具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,其中以AF-MSC抑制效果最强, BM-MSC最弱,其抑制效果与MSC数量有关。     

人骨髓间充质干细胞对异体B淋巴细胞的免疫调节作用

目的 研究人骨髓问充质干细胞（MSC）体外对B淋巴细胞的免疫调节作用。方法 从人骨髓中分离培养MSC，通过观察细胞形态和流式细胞术检测细胞表面标志进行鉴定。用加速器辐射去除MSC增殖分化能力。检测加入骨髓MSC前后B淋巴细胞增殖能力变化，并对其进行凋亡分析；比较Transwell非接触培养与直接接触培养中，MSC对活化B淋巴细胞增殖的作用；观察骨髓MSC作用前后，活化B淋巴细胞分泌免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的能力，以及B淋巴细胞表面免疫分子的表达。结果 ①MSC不能刺激B淋巴细胞增殖；MSC抑制LPS活化的B淋巴细胞增殖，其抑制作用与浓度呈依赖性。②MSC不能诱导B淋巴细胞凋亡；Transwell非直接接触培养组中MSC抑制B淋巴细胞增殖的作用较直接接触培养组的作用弱，提示MSC抑制B淋巴细胞增殖的作用包括物理性接触抑制和非接触抑制。③骨髓MSC抑制活化的B淋巴细胞分泌免疫球蛋白IgG、IgM和IgA；MSC作用下，B淋巴细胞表面HLA-DR、CIMO、CD80和CD86的表达无显著改变。结论 骨髓MSC在体外可抑制B淋巴细胞增殖和分泌功能，具有一定的免疫调节能力。     

骨髓间充质干细胞对K562细胞增殖及凋亡的影响

本研究比较K562细胞与相同数量以及不同数量的人骨髓间充质干细胞（MSC）黏附培养前后K562细胞增殖、细胞周期和凋亡的变化,以探讨MSC对人白血病K562细胞生长的影响。通过建立正常人骨髓MSC的体外培养体系及其与K562细胞共培养的体系测定K562细胞的生长曲线;将不同数量的MSC与K562细胞共培养测定K562细胞的增殖率曲线;应用流式细胞术检测K562细胞周期以及凋亡的变化。结果显示：与单独K562细胞培养相比,K562细胞与相同数量MSC共培养后,生长受抑;K562细胞与不同数量MSC共培养后,MSC对K562细胞的抗增殖作用呈剂量依赖性;细胞周期分析发现,K562细胞与MSC共培养后,G0／G1期以及G2／M期的细胞增加,S期的细胞减少。共培养24、48、72小时后流式细胞仪检测发现,K562细胞的凋亡率下降。结论：正常人骨髓MSC能使导致K562细胞生长抑制,阻止K562细胞周期的运行,凋亡率下降,且在一定范围内,随着MSC数量的增加,对K562细胞的抗增殖作用增强。