hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

癌基因c-myc、Ha-ras在人肺鳞状细胞癌中的增强表达

本文初步研究了人肺鳞癌中c-myc及Ha-ras癌基因的表达。斑点杂交自显影密度分析的结果表明,人肺鳞癌总RNA中Ha-ras及c-myc基因的mRNA分别是正常人肺组织的32倍及10倍。这两种基因表达的增加在人肺恶性变中的作用,尚有待深入研究。     

CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达

[目的]构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达.[方法]分离人外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区(含绞链区-CH2-CH3)基因片段.将PCR产物克隆入pCDNA3,阳性重组子以双酶切和测序鉴定.将目的基因CTLA4-Ig亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183,经细菌内同源重组构建重组腺病毒载体.采用脂质体法转染293细胞包装产生重组腺病毒,进一步感染HepG2细胞,采用RT-PCR及ELISA测定CTLA4Ig表达情况.[结果]构建了表达人CTLA4Ig基因的重组腺病毒,病毒滴度可达6×109 pfu/mL,并能在HepG2和骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig.[结论]成功构建表达CTLA4Ig的重组腺病毒载体,为进一步研究肝细胞移植排异及自身免疫性疾病的免疫调节治疗提供有力的手段与工具.     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

反向MDR1及TNF-α重组表达载体的构建及其在乳腺癌耐药细胞中的表达

目的 克隆MDR1及TNF-α基因cDNA，构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体，并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达。方法 应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体，经脂质体分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7／ADR中进行表达，应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况，G418筛选阳性克隆。结果 转染了反向pEGFP-MDR1载体的MCF-7／ADR细胞在胞浆和胞核均可见到绿色荧光。而转染了pDsRed2-TNF-α载体的MCF-7／ADR细胞在胞浆和胞核均可见到红色荧光。而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞胞浆和胞核均可见到红色及绿色荧光。结论 反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7／ADR中分别及同时获得表达，为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础。     

反向MDR1及TNF-α重组表达载体的构建及其在乳腺癌耐药细胞中的表达

目的克隆MDR1及TNF-α基因cDNA,构建反向pEGFP-MDR1重组表达载体和pDsRed2-TNF-α重组表达载体,并在乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达.方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建反向绿色荧光蛋白pEGFP-MDR1融合蛋白表达载体和红色荧光蛋白pDsRed2-TNF-α融合蛋白表达载体,经脂质体分别和同时导入乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中进行表达,应用荧光显微镜直接观察融合蛋白的表达情况,G418筛选阳性克隆.结果转染了反向pEGFP-MDR1载体的MCF-7/ADR细胞在胞浆和胞核均可见到绿色荧光.而转染了pDsRed2-TNF-α载体的MCF-7/ADR细胞在胞浆和胞核均可见到红色荧光.而同时转染了反向pEGFP-MDR1载体和pDsRed2-TNF-α载体的细胞胞浆和胞核均可见到红色及绿色荧光.结论反向pEGFP-MDR1融合蛋白和pDsRed2-TNF-α融合蛋白能在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR中分别及同时获得表达,为进一步研究基因治疗联同免疫治疗逆转乳腺癌耐药建立了很好的基础.     

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究

目的 构建钙网织蛋白/黑素瘤抗原基因-A3(CRT/MAGE-A3)双基因重组腺病毒载体,并进行体外表达研究.方法 从表达质粒pcDNA3/CRT中切取目的片段CRT,定向克隆至穿梭载体pShuttle-GFP-CMV.根据Genbank中提供的黑素瘤基因序列,设计并合成引物,以人肺癌组织cDNA文库为模板采用RT-PCR技术扩增人黑素瘤抗原基因-A3基因片段,测序后将黑素瘤抗原基因-A3基因片段定向克隆至穿梭载体,进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi.结果 目的 片段CRT转入穿梭载体后,酶切鉴定pShuttle-(△GFP)-CRT正确.人肺癌组织经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,测序证实为MAGE-A3 DNA后,克隆至穿梭载体pShutde-(△GFP)-CRT构建穿梭载体pShuttle-CRT-MAGE-A3,酶切鉴定证实构建正确.酶切穿梭载体将双基因片段克隆至腺病毒载体pAdxsi得到Ad-CRT/MAGE-A3病毒载体,酶切鉴定证实构建成功.转染293LP细胞并用Western blot检测到其体外表达.结论 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体并证实其能在体外有效表达CRT蛋白及MAGE-A3蛋白.     

Chemerin重组腺病毒表达载体的构建

目的:应用基因重组技术,构建表达chemerin基因的重组腺病毒载体.方法:经PCR方法扩增得到chemerin基因,将其插入到带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1中,得到重组质粒pShuttle-chemerin-IRE...     

重组人白细胞介素21真核表达载体的构建及体外药效学研究

目的构建人的真核表达载体pVAX/IL-21,并进行体外细胞转染实验的鉴定研究。方法采用PCR扩增技术扩增含有白细胞介素21（interleukin21,IL-21）的基因,亚克隆于真核表达载体pVAX1,并进行酶切和测序分析;将所构建的质粒转染COS-7细胞检测其表达情况。结果酶谱和测序分析表明,构建的质粒pVAX/IL-21（pIL-21）基因片段的方向、序列完全正确;ELISA法定量检测双质粒转染COS-7细胞后24h、48h、72h、96h均检测到目的基因的蛋白表达,其中转染48h的表达水平较高,达到45ng/ml。结论成功构建了人IL-21的整合表达质粒pIL-21,并具有较强的体外细胞转染活性,为进一步研究IL-21的生物学功能如抗肿瘤活性等提供了实验基础。     

hTEFT重组绿色荧光表达载体的构建与表达

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒。方法用RT-PCR方法从肝癌组织中提取总RNA扩增出hTERT基因片段,将其连接pGEM-TEasy质粒上,将重组质粒pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,再将重组的pEGFP-C3-hTERT基因片段转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞系,荧光倒置显微镜观察并检测转染细胞的hTERTmRNA表达水平。结果DNA序列分析证实了重组载体pGEM-T-hTERT和pEGFP-C3-hTERT内插入片段的碱基组成与公开发表的hTERT序列一致。转染pEGFP-C3-hTERT的NIH3T3细胞可见绿色荧光,并检出高水平表达的hTERT。结论成功构建高效表达hTERT的真核表达载体,为以hTERT为靶点的肿瘤治疗打下实验基础。     

反义表达癌基因c-Ha-ras的逆转录病毒穿梭质粒的体外构建

Richard Mann等于1983年把逆转录病毒M-MuLV的cDNA上与病毒包装蛋白质识别、包装有关的一段即cis位点造成缺失,并与pBR322的部分顺序连接后构成重组穿梭质粒pMOV-ψ~-。通过磷酸钙沉淀法将pMOV-ψ~-导入NIH3T 3细胞并整合到NIH3T3基因组上,形成转化细胞株ψ2。由于cis位点的缺失,ψ2细胞株虽然不能释放病毒颗粒M-MuLV,但却能表达出所有逆转录病毒成熟、释放所必需的蛋白质。当在ψ2细胞株中再导入含有cis位点的逆转     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

谷氨酸脱羧酶重组杆状病毒表达载体的构建

谷氨酸脱羧酶 (ＧＡＤ)是胰岛β细胞的一种主要的自身抗原 ,与１型糖尿病细胞免疫和体液免疫均有密切关系。由于抗ＧＡＤ抗体是最重要的免疫学标志之一和可靠的早期诊断指标 ［１］,所以ＧＡＤ抗原的制备对１型糖尿病的早期诊断及其病因和机制的研究都具有重要意义。本实验将ＧＡＤ６５基因在真核细胞中的表达打下基础。１材料和方法１．１菌株Ｅ．ｃｏｉｌＤＨ５α和质粒 ｐＵＣ１８ -ＧＡＤ６５ 均为本室保存 ;ＲＮＡａｓｅ购自华美生物工程公司 ;限制性内切酶ＸｂａⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ和Ｔ４-ＤＮＡ连接酶、ＤＬ -２０００Ｍａｒｋ…     

应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.     

表达翻转重组酶的真核载体的构建

目的 构建表达翻转重组酶(FLP)重组表达的真核载体.方法 以质粒pFRT为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出两端包含了Xba Ⅰ和BamH Ⅰ内切酶识别位点的全长FLP基因片段,将该片段插入用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后的载体质粒pBK-CMV上,构建出重组质粒pBK-CMV-FLP.经过转化、挑选菌落,PCR鉴定且测序均正确.结果 成功构建重组质粒pBK-CMV-FLP.结论 构建好的pBK-CMV-FLP质粒为生物工程上删除筛选标记物提供了良好的条件.     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点.方法应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MO1的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系.通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度.结果发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2 d最高,至少可持续9 d.Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异.结论重组杆状病毒可以用于体外基因转导.     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的 探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点。方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MOI的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系。通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度。结果 发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2d最高,至少可持续9d。Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异。结论 重组杆状病毒可以用于体外基因转导。     

VEGF—C真核表达载体的构建和体外表达

目的：构建血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的真核表达栽体，检测其在真核细胞CHO中的表达。方法：根据人VEGF—C cDNA的序列，设计合成一对特异性引物，用RT—PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF—C基因的cDNA，回收PCR产物连接于克隆载体。扩增，质粒提取，酶切鉴定并进行基因序列鉴定。酶切回收VEGF—C cDNA全长的基因片段，与真核表达栽体pcDNA3．1(-)连接重组质粒进行酶切鉴定。采用脂质体转染法将构建的pcDNA3．1(-)，VEGF-C转染至CHO细胞中，G418加压筛选培养。最后用Westerm—blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF-C蛋白。结果：基因测序证实RT-PCR产物包含VEGF-C cDNA全长。重组peDNA3．1(-)中含 有VEGF—C cDNA全长序列，Westem—blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。     

反义Smad3腺病毒表达载体的构建及体外表达

目的构建在体外细胞中高效表达的反义Smad3腺病毒载体,探讨应用于基因治疗病理性瘢痕的可行性.方法用DNA直接克隆连接的方法,构建反义Smad3腺病毒重组质粒,再用293细胞包装.重组腺病毒经扩增、纯化后,感染体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞, RT-PCR检测细胞中反义Smad3 mRNA的转录.结果经酶切和PCR鉴定证实反义Smad3重组腺病毒质粒构建成功,RT-PCR证实瘢痕疙瘩细胞中有腺病毒载体介导的反义Smad3 mRNA的表达.结论所构建的反义Smad3腺病毒表达载体可在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达,可进一步应用于瘢痕疙瘩基因治疗的研究.