人T细胞受体ζ链基因在昆虫细胞中的表达

目的：克隆人T细胞受体 (TCR) ζ链基因，运用昆虫杆状病毒系统表达该蛋白。方法：用RTPCR从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆TCR ζ链cDNA，构建到昆虫杆状病毒系统专用的Transfer载体中，并与杆状病毒共转染昆虫sf 9细胞。用SDSPAGE电泳和用小鼠抗人ζ链蛋白的单抗在流式细胞仪中鉴定重组蛋白的表达。结果：克隆的人TCR ζ链cDNA插入昆虫杆状病毒载体，并在昆虫sf 9细胞中特异地表达了蛋白。表达量约为细胞裂解上清液总蛋白的11%。经SDSPAGE分析，其分子量大小与预期的重组ζ链蛋白一致。用胞内标记流式细胞仪检测证实，转染重组杆状病毒的昆虫细胞含有人的ζ链蛋白。结论： 从人PBMC中成功克隆了T细胞受体ζ链的基因，并在昆虫细胞中获得高效表达。用生物工程技术获得TCR ζ链蛋白有利于深入研究其生物学功能     

人乳头状瘤病毒18型阳性肿瘤疫苗的构建及体外活性鉴定

目的: 制备人乳头状瘤病毒（human papilloma virus, HPV）18型阳性的肿瘤疫苗，并观察其体外活性。方法:利用昆虫杆状病毒(简称Bac to Bac)表达系统，将HPV18L1基因重组入穿梭质粒pFastBacHtb，构建HPV18 L1Htb，通过转座反应,将目的基因片段重组入杆状病毒基因     

Her2/ECD-sf162/TM融合杆状病毒表达及鉴定

目的:获得融合表达的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒,为后续基于SIV Gag蛋白的Her2病毒样颗粒疫苗的制备奠定实验基础。方法:将Her2胞外段基因与猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus,SIV）包膜蛋白sf162跨膜区基因融合的Her2/ECD-sf162/TM pFastBac重组表达载体,转座大肠杆菌E.coli DH10Bac菌株,获得重组杆粒,在昆虫细胞中表达获得重组杆状病毒,Western blot方法对该病毒进行鉴定。结果:构建的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒表达载体经PCR鉴定正确,转染昆虫细胞后获得了重组杆状病毒,该融合杆状病毒蛋白可与抗Her2抗体发生免疫反应。结论:成功构建的Her2/ECD-sf162/TM杆状病毒可用于Her2病毒样颗粒疫苗的制备。     

人IER5基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的：利用昆虫杆状病毒表达系统表达早期快速反应基因5（IER5）蛋白,为后续蛋白质结晶及探索蛋白质三级结构提供线索。方法：以HeLa细胞cDNA为模板扩增出IER5基因片段,构建重组转移质粒pFastBac1-IER5;重组转移质粒经双酶切及测序鉴定后转化至感受态细胞DH10Bac,以获得重组的穿梭质粒rBacmid-IER5;将重组穿梭质粒感染Sf9细胞,待细胞出现明显病变时收集重组杆状病毒;用间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blot以及对表达产物进行分析鉴定。结果：重组转移质粒pFastBac1-IER5经双酶切后得到与预期相同的2条条带;重组穿梭质粒rBacmid-IER5经PCR鉴定在3 300 bp左右出现一条特异性条带;间接免疫荧光结果提示IER5蛋白在Sf9细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示,表达产物的相对分子质量约为48 k,Western blot结果表明表达产物能与IER5抗体特异性结合。结论：利用昆虫-杆状病毒表达系统成功表达了人IER5蛋白,获得了体外表达重组IER5蛋白的相对分子质量、溶解性等物理化学特性。     

血管生长抑制因子angiostatin在昆虫细胞中的表达及活性研究

背景与目的:抑制新生血管的形成,有助于抑制肿瘤的生长,减少和预防肿瘤转移的发生。血管抑素(angiostatin)是一种重要的内源性新生血管生成抑制剂,对血管内皮细胞增殖有较强的抑制作用。为获得具有高活性的Angiostatin表达,本研究通过杆状病毒表达系统表达重组的angiostatin,分析其在昆虫细胞中表达和生物活性。方法:用带有angiostatin的杆状病毒转移载体pBlueBacHis2B和病毒DNA共同转染Sf9细胞,构建重组病毒,蚀斑实验筛选,PCR分析确定后扩增产生大量高滴度的病毒贮存液;用SDS-PAGE电泳和Westernblot对感染不同时间后分泌的重组蛋白做时间表达分析;用ProBondTM纯化系统对表达的重组angiostatin进行纯化,分光光度计确定蛋白含量,SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度;采用MTT法测定重组蛋白angiostatin对原代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用而后通过鸡胚尿囊膜实验进一步证实其抗血管形成作用。结果:成功构建了滴度为2×108pfu/ml的angiostatin重组杆状病毒,并在昆虫细胞Sf9中高效表达了分子量为53ku的angiostatin重组蛋白,纯度约为90%,重组angiostatin蛋白不仅在体外显著抑制内皮细胞的生长(IC50为2.3μg/ml),而且显著抑制鸡胚尿囊膜血管的生长。结论:此系统可制备高滴度angiostatin重组杆状病毒贮存液,并在Sf9昆虫细胞中高效表达该重组蛋白,经在体和离体细胞学实验验证其对内皮细胞的增殖具有抑制作用。     

人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达

目的：克隆人PDL1(B7H1)基因，并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体，获得稳定表达PDL1基因的L929细胞。方法：从人心脏cDNA文库中扩增出PDL1基因，通过双酶切装入逆转录病毒载体pGEZTerm中，脂质体法共转染包装细胞293T，用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞，72 h后，加入Zeocin进行筛选，挑选出能稳定表达PDL1蛋白的L929细胞株。结果：构建了用于表达的含PDL1基因的重组逆转录病毒载体；经转染包装细胞293T后，包装出具有感染能力的重组PDL1逆转录病毒；经RTPCR、流式细胞仪表型检测表明，筛选出的L929转基因细胞能稳定表达人PDL1蛋白。结论：构建了含人PDL1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PDL1蛋白的细胞株，为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

S100A13 基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

 目的 构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,观察S100A13基因在COS-7细胞中的表达及定位。方法 采用克隆和亚克隆技术构建S100A13基因真核表达载体,脂质体介导转染COS-7细胞,RT-PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果 酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于全胞浆。结论 成功构建了S100A13基因真核表达载体,该基因在COS-7细胞中成功表达,S100A13基因表达定位于全胞浆。     

抗肿瘤和乙肝双交IL18—HBV S基因疫苗的构建

目的：探讨IL－18及乙肝病毒S基因（HBVS）的联合功效。方法：从胎肝组织中抽提总RNA，RT－PCR扩增IL－18cDNA基因。从载体pcDNA3．0／S中限制性酶切获取HBV S基因，然后，将其与IL－18cDNA一半亚克隆到真核表达质粒pIRES-EGFP中。结果：构建了具有抗肿瘤及乙肝双重功效的IL－18－HBV S乙肝基因疫苗。结论：含有IL－18基因的HBV基因疫苗的构建为基因疫苗的功能和应用研究提供了基础。     

SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及检测

目的构建携带融合基因SLC-Her-2/neu-P53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc表达载体。方法提取SLC-HP基因及含Fc段基因的质粒构建携带目的基因的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMVSLC-HP-Fc,经酶切线性化后转入含有pAdEasy-1质粒的E.coli BJ5183中进行同源重组,得到重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc。线性化后的病毒表达载体通过脂质体Lipofectamine 2000转染293细胞,通过包装扩增并经PCR鉴定后得到大量复制病毒并纯化保存。结果得到重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc,成功转染293细胞出现细胞病变反应,经酶切及PCR法确定目的基因的表达。结论成功构建了SLC-Her-2/neu-P53-Fc融合基因重组腺病毒表达载体,并建立了重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc种子病毒库和工作病毒库,为进一步研究该融合基因与肿瘤相关作用奠定了实验基础。     

血管形成抑制因子HIAF-1在昆虫细胞中的高效表达和活性研究

背景与目的：大肠杆菌表达的人抑制血管生成因子－1（human inhibiting angiogenesis factor-1,HIAF-1）可抑制肿瘤血管的形成。本研究在昆虫细胞中表达HIAF－1,并研究其生物活性。方法：用DNA重组技术,构建了重组杆状病毒表达载体pAcuW51-HIAF-1,用Cellfectin将其与线性病毒DNA共转染昆虫细胞sf9,获得重组病毒。用SDS－PAGE电泳和Western blot鉴定重组病毒感染的昆虫细胞中重组HIAF－1重组蛋白的表达。重组蛋白经亲和层析纯化后,在体外用MTT法检测其对内皮细胞的作用,用食管癌移植瘤研究其体内抑瘤活性。结果：在昆虫细胞中高效表达了分子量为26kDa的HIAF－1重组蛋白,其表达量可达昆虫可溶性蛋白的5％－10％。重组HIAF－1蛋白不仅在体外显著抑制内皮细胞的生长,IC50值为3．1μg/ml,而且显著抑制食管癌移植瘤的生长。结论：在昆虫细胞中高效表达了分子量为26kDa的HIAF－1重组蛋白,其表达量可达昆虫可溶性蛋白的5％－10％。重组HIAF－1蛋白不仅在体外显著抑制内皮细胞的生长,IC50值为3．1μg/ml,而且显著抑制食管癌移植瘤的生长。结论：在昆虫细胞中高效表达了HIAF－1重组蛋白;HIAF－1重组蛋白的生物活性优于相应的原核重组蛋白。     

Optimization of expression conditions for production of anti-colorectal cancer monoclonal antibody CO17-1A in baculovirus-insect cell system

The baculovirus-insect cell system is considered a feasible expression system for recombinant glycoprotein production due to its several advantages, including high capacity, flexibility, and glycosylation capability. However, accurate titering of the recombinant baculovirus is required to ensure high expression in insect cells using a commercial and expensive immunoassay titer kit in which the envelope glycoprotein of the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)-type baculovirus is detected by anti-envelope glycoprotein antibody and a secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP). In this study, conditions for the expression of the CO17-1A immunotherapeutic monoclonal antibody (MAb) against colorectal cancer cells in a baculovirus system were optimized without using a commercial titering kit. Several variables were investigated to optimize antibody expression in a baculovirus-insect cell system, including baculovirus passage, volume of the infecting baculovirus inoculum (100, 200, 400, and 800?μL), and the harvest time of insect cells or cell supernatants after virus infection (24, 48, and 72?h). Two different pFastBac vectors carrying the CO17-1A MAb genes with or without the KDEL endoplasmic reticulum (ER) retention motif (Lys-Asp-Glu-Leu) fused to the HC (MAb CO17-1A K and MAb CO17-1A, respectively) were constructed and used to generate baculoviruses. Immunoblot analysis was conducted to confirm expression of MAb CO17-1A K and MAb CO17-1A in baculovirus-infected insect cells. Densitometry analysis of the protein bands was used to quantify the relative expression under different conditions. The highest expression was observed in lysed cells infected with 400?μL of passage 3 baculovirus (P(3) BV) carrying the gene encoding the CO17-1A MAb without KDEL at 72?h after virus infection. These results suggest that the infection conditions, the number of virus passages, baculovirus inoculum volume, and the harvest time can be modified to optimize MAb expression without using a BaculoELISA titer kit in a baculovirus-insect cell system.     

抗肿瘤和乙肝双效IL18-HBV S基因疫苗的构建

[目的]探讨IL-18及乙肝病毒s基因(HBV s)的联合功效。[方法]从胎肝组织中抽提总RNA，RT-PCR扩增IL-18cDNA基因。从载体pcDNA3.0/S中限制性酶切获取HBV S基因，然后，将其与IL—18 cDNA一并亚克隆到真核表达质粒pIRES—EGFP中。[结果]构建了具有抗肿瘤及乙肝双重功效的IL18-HBV S乙肝基因疫苗。[结论]含有IL-18基因的HBv基因疫苗的构建为基因疫苗的功能和应用研究提供了基础。     

一种转导人原代肝细胞的LV-HBx诱导调控表达系统

目的：建立一种在人原代肝细胞中可诱导调控表达HBx的慢病毒表达系统,以便研究HBx生物学特性及其对人肝细胞功能的影响。方法：采用Tet-on系统构建四环素诱导调控的慢病毒-HBx表达系统,并用流式细胞术对其进行优化以达到较高的表达效率。应用该系统制备LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒共同转导肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,再加入强力霉素（Dox）诱导调控HBx表达,并采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测人原代肝细胞中肿瘤转移相关基因1（MTA1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、转化生长因子β1（TGFB1）、上皮型钙黏附素1（CDH1）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）mRNA的表达水平。结果：重组慢病毒-HBx表达系统构建成功,LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒用量配比经过优化,采用1：1或2：1转导后可达到较高的表达效率,Dox诱导产生的表达HBx的阳性细胞率分别为67.3%和66.7%。应用该系统将HBx基因转导入肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,可用Dox进行诱导调控HBx的高效表达。其中人原代肝细胞中Dox诱导组的HBx表达水平约为对照组（不加Dox诱导）的45倍,经qPCR检测高表达HBx的人原代肝细胞中MTA1、VEGFA、TGFB1 mRNA的表达水平较对照组均显著升高（P均 < 0.05）,而CDH1、IGFBP3 mRNA表达水平显著降低（P均 < 0.05）。结论：成功建立了转导人原代肝细胞的LV-HBx四环素诱导调控表达系统,该系统的建立为研究HBx等乙肝病毒基因对人原代肝细胞的影响打下了基础。     

PNP 表达质粒的构建及鉴定

 目的 构建并鉴定一种新型的PNP自杀基因表达载体。方法 将PNP基因插入到pcDNA3．0中，构建PNP基因表达载体pcDNA3．0／PNP；通过酶切、PCR及测序鉴定重组体。采用脂质体介导法将pcDNA3．0／PNP转染三种肿瘤细胞株，RT—PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达。结果 目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的PNP基因在不同的肿瘤细胞株中实现了表达。结论 CMV启动子调控的PNP基因表达载体是肿瘤基因治疗中一种新型、高效的治疗栽体。