IL-12和IL-18基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠(H-2d)特异性免疫应答的影响

目的：观察IL-12和IL-18基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠（H-2d）特异性体液免疫和细胞免疫应答的影响.方法：用肌肉注射法将HBV核心区DNA疫苗、IL-12质粒和IL-18 质粒接种BALB/c小鼠;ELISA法检测小鼠血清抗-HBc（IgG）及IgG亚类（IgG1、IgG2a）;LDH释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性.结果：免疫6周后,HBcAg DNA疫苗联合IL-12质粒、IL-18质粒和IL-12＋IL-18质粒组小鼠的血清抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0.05）,抗HBc IgG亚类以IgG2a占优.DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤率均高于对照组（P组）,其中C＋IL-18组和C＋IL-12＋IL-18组中CTL值明显高于C组,尤以C＋IL-12＋IL-18组中的CTL杀伤率最高.结论：IL-12和IL-18基因与HBcAg DNA疫苗联合免疫,不仅能增强HBcAg特异性体液免疫应答,而且能增强HBcAg特异性CTL的杀伤活性.     

IL-12体外促进慢性乙型肝炎患者PBMC IFN-γ的产生

目的：探讨体外IL-12对慢性乙型病毒性肝炎患者细胞免疫功能的影响，为临床治疗慢性乙型病毒性肝炎提供理论依据。方法：慢性乙型肝炎患者PBMCs与HBsAg、HBsAg＋IL-12、HBcAg或HBcAg＋IL-12孵育后，利用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清中IFN-γ的含量；用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）在单个细胞水平上检测PBMCs中IFN-γ产生细胞的频率；用流式细胞记数仪（FACS）检测PBMCs中IFN-γ^＋的细胞亚群。结果：当乙肝患者PBMCs与HBsAg或HBcAg孵育后，只有少数病例发生反应，产生低水平的IFN-γ。当IL-12加入细胞培养后，能显著地增加HBsAg或HBcAg诱导IFN-γ的产生；分泌IFN-γ的细胞频率显著增加；IFN-γ^＋的细胞主要包括CD8^＋T细胞和非T细胞。结论：IL-12体外能增强慢性乙型肝炎患者的细胞免疫应答。     

共表达不同水平的IL-12对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响

目的 在HBsAg DNA疫苗质粒中共表达IL-12佐剂分子,研究IL-12的表达水平对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响.方法 构建携带来源于中国地区C型HBV参照序列CHN-HBV07-C经密码子优化的preS2-S基因的DNA疫苗质粒pHBV,并将3个不同IL-12表达水平的佐剂分子表达盒序列分别克隆入该疫苗质粒中,通过瞬时转染293T细胞以检测重组质粒IL-12分子及乙肝表面抗原的表达情况.将不同IL-12表达水平的疫苗质粒免疫BALB/c雌性小鼠,IFN-γ的ELISPOT方法检测HBsAg抗原特异性的细胞免疫应答,化学发光定量ELISA法检测HBsAg特异的抗体水平.结果 成功构建3个不同IL-12表达水平的HBV DNA疫苗质粒,293T细胞转染结果显示:不携带IL-12分子表达盒的对照疫苗质粒pHBV的HBsAg表达水平可达70 ng/ml;低表达IL-12的疫苗质粒pHBV-12l的HBsAg表达水平为18 ng/ml;而高表达IL-12的重组疫苗质粒pHBV-12h的HBsAg表达水平仅为6 ng/ml.BALB/c小鼠的免疫结果表明:高表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12h所诱导的细胞免疫及体液免疫水平相对于对照疫苗质粒pHBV均显著降低了.低表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12l所诱导的抗体水平也显著降低了,但其细胞免疫应答水平却显著提高了.结论 在同一疫苗质粒中,高表达IL-12分子的质粒可能会影响到抗原蛋白的表达,而低表达IL-12分子的疫苗质粒却能增强细胞免疫应答.因此,平衡好佐剂分子及抗原蛋白的表达水平对于诱导高水平的免疫应答是个重要的因素.     

我国不同艾滋病候选疫苗小鼠细胞免疫应答评价

目的 比较我国不同艾滋病(AIDS)候选疫苗小鼠细胞免疫应答水平.方法 将我国6种艾滋病候选疫苗按其各自免疫程序,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞,利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)与胞内因子染色法(ICS)检测其对HIV特异多肽的细胞免疫应答水平.结果 6种艾滋病候选疫苗利用潜在T细胞表位(PTE)Gag、Env和Pol肽库和ELISPOT法检测IFN-γ的分泌情况,结果各疫苗的小鼠细胞免疫阳转率为70%～100%,各疫苗引起特异细胞免疫应答的反应肽库不同,强度亦不相同.1#和2#疫苗利用ELISPOT检测分泌Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2的小鼠脾细胞数量,两疫苗的IFN-γ和IL-2检测结果均呈中度相关性(r1=0.62,P1＜0.01;r2=0.79,P2＜0.01).ELISPOT和ICS检测1#疫苗免疫后分泌IFN-γ的小鼠脾细胞数,结果两种方法的小鼠阳转率均为66.7%(10/15),ELISPOT阳性细胞数与ICS阳性细胞比例呈中度相关(r=0.55,P＜0.05).结论 我国不同AIDS候选疫苗引起的小鼠细胞免疫应答在广度和强度上存在差别.ELISPOT或ICS检测IFN-γ等Th1类细胞因子可作为疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的评价指标.     

重组IL-12对乙肝疫苗在小鼠诱导免疫应答的作用

目的:观察重组IL-12对乙肝疫苗在小鼠诱导应答的强度与性质的作用,探讨将重组IL-12用作乙肝治疗性疫苗分子佐剂的可能性.方法:将乙肝疫苗联合重组IL-12肌注免疫小鼠,检测小鼠产生的抗乙肝表面抗原特异性体液和细胞免疫应答.结果:乙肝疫苗联合重组IL-12能明显增强小鼠T淋巴细胞的增殖活性、促进分泌细胞因子IFN-γ和IL-2并提高IgG2a抗体水平.结论:重组IL-12可显著增强乙肝疫苗诱导的细胞免疫应答,并使免疫应答转向Th1型.     

PIKA佐剂在体内外诱导小鼠免疫应答的探讨

目的：探讨PIKA佐剂在体内外诱导小鼠的免疫应答。方法：体外将小鼠脾淋巴细胞与不同浓度PIKA佐剂培养后，ELISA检测细胞因子IFN-γ、IL-12p40的产生，FACS检测细胞的增殖及活化。体内将PIKA佐剂经小鼠腹腔注射后，检测不同时间点血清中IFN-γ、IL-12pao、IL-6、TNF-α等细胞因子的产生。结果：PIKA佐剂体外呈剂量依赖性诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-12p40。细胞亚群分析的结果表明，PIKA可显著刺激B细胞和NK细胞活化、增殖。体内注射PIKA佐剂后可诱导细胞因子IFN-γ、IL-12pao、IL-6、TNF-α的产生，但产生的时间点不同。结论：PIKA佐剂体内外直接通过诱导细胞因子的产生，B细胞和NK细胞的活化和增殖，而促进免疫应答反应。     

IL-12、IL-18基因对HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导的免疫应答的影响

目的 研究IL-12、IL-18基因对HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导免疫应答的影响，以探求HIV-1核酸疫苗的新策略。方法 pVAX1GP120联合IL-12、IL-18基因或者pVAX1GP120单独免疫BALB／c小鼠，采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ水平，以NIT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细脯增殖，用乳酸脱氢酶（LDH）试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞（CIL）的应答。结果 与pVAX1GP120免疫组比较，pVAX1GP120联合IL-12、IL-18基因免疫组小鼠血清的抗HIV-1 gp120抗体滴度升高，IFN-γ升高，小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数（SI）以及特异性CTL活性均高，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 IL-12、IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠，有可能增强特异性TH1细胞和CTL反应，IL-12、IL-18基因对体液免疫可能有抑制作用。因此，IL-12、IL-18基因对于治疗性HIV-1核酸疫苗可能是具有较好应用前景的免疫佐剂。     

含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫的研究

目的 探讨含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒(rAAV)和重组腺病毒(rAdV)疫苗在BALB／c小鼠中联合免疫的效果。方法 将密码子优化的HIV-1 gp120基因分别插入腺相关病毒(AAV)和腺病毒(AdV)载体质粒，构建含该基因的rAVV和rAdV载体疫苗。将两种疫苗以不同的联合方式免疫BALB／c小鼠，ELISA检测小鼠血清中的gp120特异性抗体，细胞内细胞因子染色法检测小鼠的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。结果 两种重组病毒均可表达目的基因gp120；在小鼠体内两种重组病毒联合免疫可诱导特异性的CTL应答和血清1gG抗体反应，但用rAAV初免2次，再用rAdV加强3次所诱发的CTL和血清1gG反应最强。结论 rAAV和rAdV疫苗联合免疫可在小鼠体内诱导特异性的CTL应答和血清1gG抗体反应。     

重组结核病疫苗rBCG-IL-12p70-TB10.4的免疫效应

目的将成功构建的重组卡介苗rBCG-IL-12p70-TB10.4免疫BALB/c小鼠,研究其免疫效应,为结核病新疫苗的研发提供依据。方法将融合基因IL-12p70-TB10.4克隆入pMV361构建重组质粒,以电转化方式将重组质粒导入卡介苗基因组,构建重组结核病疫苗rBCG-12p70-TB10.4(rBCG-IT)。将此重组卡介苗免疫BALB/c小鼠,分别于免疫后3、6、9和12周,用间接ELISA检测特异性抗体滴度水平,XTT检测脾细胞增值反应,流式细胞仪检测脾CD4+T、CD8+T细胞亚型的比例,ELISA试剂盒检测细胞因子的诱生。结果在免疫后3~12周,rBCG-IT组脾细胞增殖反应均明显强于其他各组(P0.01),该组IFN-γ诱生量及CD4+T细胞比例均显著高于rBCG-I组、rBCG-T组及BCG组(P0.01)。IgG2a/IgG1比值在免疫后各时间点的变化趋势提示rBCG-IT可诱导Th1型细胞免疫应答。结论重组疫苗rBCG-IT可诱导产生较BCG更强、持续时间更长的特异性细胞免疫应答,可对其免疫保护作用进行深入研究。     

结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性.方法:用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类.分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应.毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数.结果:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖明显,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显,对MTB H37Rv攻击后有一定的保护作用.结论:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗候选.     

HCV核心-包膜E2抗原融合基因DNA疫苗的构建及对小鼠的免疫应答试验

目的：观察一种结构新颖的HCV融合抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠的免疫效果，探讨其用于防治丙型肝炎的可行性。方法：用重叠延伸PCR拼接编码小鼠IgG kappa链信号肽和通用型辅助性T细胞表位PADRE的DNA片段，PCR分别扩增HCV核心抗原基因和包膜E2抗原基因，将3段基因插入真核表达载体pcDNA3.1，构成重组表达质粒pST-CE2t，转染COS7细胞，免疫组化检测HCV抗原的表达。将pST-CE2t和HCV核心抗DNA疫苗pcDNA3.1core分别肌肉注射接种BALB/c小鼠，检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果：pST-CE2t可在COS7细胞内表达HCV核心抗原和E2抗原，接种于BALB/c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答，其中抗HCV核心抗原免疫应答的强度明显超过pcDNA3.1core，且更趋向于TH1型免疫应答。结论：pST-CE2t对于丙型肝炎的防治有潜在的应用价值。     

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据     

HBcAg‐Specific IL‐21‐Producing CD4+ T Cells are Associated with Relative Viral Control in Patients with Chronic Hepatitis B

Function exhaustion of specific cytotoxic CD8+ T cell in chronic virus infection partly results from the low levels of CD4 help, but the mechanisms by which CD4 help T cell required to control hepatitis B virus infection are not well understood. In this study, we investigated the role of interleukin‐21‐producing CD4+ T cell response in viral control of hepatitis B virus infection. HBcAg‐specific interleukin‐21‐producing CD4+ T cells in blood were detected in patients with hepatitis B virus infection. Patients with acute hepatitis B had greater HBcAg‐specific interleukin‐21‐producing CD4+ T cells in blood compared with chronic hepatitis B patients, and there was no statistical significance between immune active chronic hepatitis B patients and inactive healthy carrier patients for these cells, whereas frequencies of these cells negatively correlated with HBV DNA levels but positively correlated with HBc18‐27‐specific IFN‐γ‐producing CD8+ T cells. Moreover, interleukin‐21 sustained HBc18‐27‐specific CD8+ T cells in vitro, and interleukin‐21 production by HBcAg‐specific IL‐21‐producing CD4+ T cells of acute hepatitis B patients enhanced IFN‐γ and perforin expression by CD8+ T cells from chronic hepatitis B patients. Our results demonstrate that HBcAg‐specific interleukin‐21‐producing CD4+ T cell responses might contribute to viral control by sustaining CD8+ T cell antiviral function.     

大剂量HBsAg疫苗对小鼠细胞免疫应答的调节作用

目的:探讨大剂量HBsAg疫苗对机体细胞免疫应答的影响。方法:不同剂量HBsAg疫苗两次免疫小鼠后, 用氚-胸腺嘧啶核苷(-[H³]TdR)掺入法, ELISA方法分别测定免疫鼠T淋巴细胞增殖能力, 细胞培养上清中白细胞介素-2(IL-2), γ干扰素(IFN-γ)含量及血清中抗HBsIgG2a阳转率。结果:大剂量HBsAg疫苗单次免疫后, 小鼠T淋巴细胞增殖能力显著强于对照组(P＜0.05);Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ显著多于对照组(P<0.05);抗HBsIgG2a阳转率显著高于小剂量组(P＜0.01)。加强免疫后, 各项指标增高更显著, 小剂量组才呈现显著性增高。结论:大剂量HBsAg疫苗可诱生特异性细胞免疫应答, 并使细胞免疫趋向Th1型。     

免疫复合物型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法的建立

目的 建立免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并与常规乙型肝炎疫苗进行比较。方法增效乙型肝炎疫苗肌内免疫BALB/c小鼠,Elispot方法检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数（SFC）,优化实验条件：免疫剂量、检测时间和特异性刺激物及刺激浓度。同时将增效乙型肝炎疫苗与常规乙型肝炎疫苗进行比较。结果5μg免疫组IFN-γ SFC明显高于2μg免疫组,初次免疫后3周IFN-γ SFC开始下降,多肽刺激IFN-γ SFC高于蛋白刺激,多肽浓度为2μg即可充分刺激斑点形成;增效乙肝疫苗免疫组IFN-γ SFC高于常规乙型肝炎疫苗组。结论 初步建立了免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并证明其重复性良好,其细胞免疫水平高于常规乙型肝炎疫苗。     

不同类型乙肝病毒感染者HBV抗原特异性T细胞免疫应答

目的 了解不同类型HBV感染人群T细胞对HBV抗原蛋白免疫应答的差别及特征.方法 76例研究对象分为四组,乙肝携带者组和既往乙肝感染患者组、急乙组、慢乙组,酶联免疫斑点法检测其外周血T细胞对HBV特异性抗原蛋白HBsAg、HBcAg和HBeAg免疫应答.结果 (1)携带者组对HBeAg的反应频率较高,而既往感染者对HBcAg和HBeAg的反应频率较高.急乙组和慢乙组对三种蛋白的反应频率无差别.(2)急乙组和慢乙组对HBsAg的反应频率明显高于既往感染组.急乙组、慢乙组和既往感染组对HBcAg的反应频率明显高于携带者组.对HBeAg的反应频率各组间无差别.(3)慢乙组对HBcAg的反应强度明显高于HBsAg.既往感染组患者对三种蛋白的反应强度依次为HBcAg＞ HBeAg＞ HBsAg.急乙组和携带者组对三种蛋白的反应强度无差别.(4)对HBsAg的反应强度从高到低依次为急乙组＞慢乙组＞携带者组和既往感染组.对HBcAg的反应强度是急乙组和慢乙组和既往感染组明显强于携带者组.对HBeAg的反应强度,急乙组高于慢乙组,其余各组间无差别.结论 急乙、慢乙和既往感染者对HBcAg的T细胞免疫反应为主,而携带者以HBeAg的T细胞免疫反应为主.     

乙肝疫苗增强细胞因子诱导的杀伤细胞对于转乙型肝炎病毒基因小鼠的治疗作用

目的 观察乙肝疫苗是否增强细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)对于乙型肝炎病毒转基因小鼠(hepatitis B virus transgenic mice,HBV-Tg)的抗病毒作用.方法 给予HBV-Tg腹腔注射CIK细胞,皮下注射乙肝疫苗,用荧光定量PCR检测外周血中HBV DNA水平变化,流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群,并用HE染色观察肝脏的组织病理改变.结果 CIK细胞降低了HBV-Tg鼠外周血中病毒载量,血中CD3~+、CD4~+及CD8~+细胞增多,乙肝疫苗和CIK细胞联合应用后,这种作用增强.结论 乙肝疫苗增强了CIK对于HBV-Tg小鼠的治疗作用,这种增强作用是否通过增加体内CD3~+、CD4~+及CD8~+细胞,尤其是CD8~+细胞而实现,有待进一步研究.     

抗原活化慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的对比研究

目的 探讨不同抗原在体外活化慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(DC)及诱导特异性T细胞应答的能力.方法 用无血清培养基从慢性乙型肝炎患者外周血中分离培养DC,在DC成熟前,分别加入HBsAg多肽、HBcAg多肽刺激,用流式细胞仪检测DC表型,用液闪计数仪观察DC对T细胞的增殖作用,用ELISA法检测混合淋巴细胞反应(MLR)中IL-12的分泌水平.结果 经HBcAg多肽刺激DC的CD86表达率为(92.20±5.18)%,明显高于HBsAg多肽刺激组(76.19±3.90)%和未加抗原组(62.37±4.24)%,P＜0.01;经HBcAg多肽刺激组DC诱导同种异体静止T细胞增殖的能力每分钟液闪计数值cpm为34 326±3088,明显高于HBsAg多肽刺激组20 306±2897和单个核细胞组3454±409,P＜0.01;经HBcAg多肽刺激组DC MLR中IL-12(348±42.8)ng/L,分别高于HBsAg多肽刺激组(226±30.6)ng/L和未加抗原组(116±15.6)ng/L,P＜0.01.结论 使用HBcAg多肽刺激DC可比HBsAg多肽更有效地提呈病毒抗原,提高诱导特异性T细胞应答的能力.     

Antigen-Antibody Complex as Therapeutic Vaccine for Viral Hepatitis B

In a previous study, hepatitis B surface antigen (HBsAg) complexed to human anti-HBs immunoglobulins (HBIG) in excess of HBsAg was used as therapeutic vaccine to treat chronic hepatitis B patients and promising results were obtained. To study the mechanisms of this approach, mice were immunized with HBsAg or IC (immunogenic complex, i.e. HBsAg complexed with mouse polyclonal anti-HBs). Studies indicate that IC induced enhanced immune responses by increasing uptake of HBsAg through Fc receptors on antigen presenting cells and modulated HBsAg processing and presentation. This modulation led to stimulation of T cell responses, and increased production of IL-2 and IFN-γ. Assay for antibody subclasses showed that higher ratio of IgG 2a was observed in the IC immunized group, which correlated with the production of lymphokine pattern. When alum was used as the adjuvant, though antibody response was enhanced, production of cytokines decreased. When DNA from a recombinant plasmid was added to IC as an adjuvant, the liter of anti-HBs was significantly higher than those in mice immunized only with the DNA or the IC. Since DNA immunization can induce both cellular and humoral immune responses, combined immunization using IC and DNA might serve as another type of therapeutic vaccine for viral hepatitis B.