新型人工miRNA表达框架的构建及其有效性验证

目的构建针对EGFP基因的人工miRNA表达框架并验证其有效性。方法用融合PCR技术在体外构建针对EGFP基因的人工miRNA表达框架。经测序比对后,以该表达框架与报告基因质粒p EGFP-N2分别共转染人肝癌细胞系Hep G2、人宫颈癌细胞系He La和人肺腺癌细胞系A549,48 h后用倒置荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况并用流式细胞仪定量检测其抑制效率。结果构建的人工miRNA表达框架经测序比对正确;共转染该表达框架和报告基因质粒p EGFP-N2后,倒置荧光显微镜观察结果显示,3种细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低。流式细胞术检测结果显示,Hep G2细胞、He La细胞和A549细胞中共转染组和单独转染组的细胞荧光表达率差异均有统计学意义(t分别为20.80、30.35和20.34,P均0.01)。结论成功构建靶向EGFP的人工miRNA表达框架,且此表达框架能有效而特异地抑制EGFP蛋白在Hep G2细胞、He La细胞和肺癌A549细胞中的表达。     

小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达

本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4（CXCR4）基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）以C57BL／6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移载体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒;同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒;通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术（FCM）检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度可达到10^8TU／ml。以重组慢病毒颗粒感染293Fr细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293Fr细胞表达CXCR4蛋白。结论：成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达。     

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。     

含CXCL12基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含小鼠CXCL12基因和EGFP基因的重组腺病毒载体,并观察其表达。方法:利用腺病毒载体系统Adeno-X,通过质粒抽提、电泳、酶切、连接、转化等基因工程技术,构建重组腺病毒质粒pAdeno-CXCL12-EGFP;酶切、PCR鉴定;利用293细胞包装pAdeno-CXCL12-EGFP,荧光倒置显微镜观察EGFP的表达。结果:成功构建重组腺病毒质粒pAdeno-CXCL12-EGFP,转染pAdeno-CXCL12-EGFP的293细胞内可见EGFP表达。结论:利用腺病毒载体系统Adeno-X成功构建含CMV启动子的CXCL12和EGFP基因的腺病毒载体。     

人Shh基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Shh基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞,建立稳定转染人Shh基因的293T的细胞系。方法设计引物引入AgeI酶切位点,使用PCR方法从质粒中扩增Shh基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。将AgeI内切酶消化后目的片段交换连接人pGC-FU载体,构建Shh慢病毒表达载体pGC-FU-Shh。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-Fu-Shh与携带GFP的慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,荧光显微镜检测慢病毒载体转染细胞的结果,重组质粒pGC-Fu-Shh的测序,Westernblotting验证Shh在转染293T细胞中表达。结果转染293T细胞后荧光显微镜,24h后观察到绿色荧光蛋白的表达,基本判断Shh表达,说明转染成功。重组质粒pGC-FU-Shh的测序Shh基因片段大小1386bp。通过Westernblotting检测转染293T的样品,可以观察到72～95KDa处条特征带与Sbh融合蛋白相吻合,判断Shh表达。通过PCR扩增获得了Shh基因,将Shh克隆到慢病毒转移质粒pC-C-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论成功构建了pGC-FU-Shh-GFP慢病毒过表达载体,获得了稳定转染的细胞株。     

含人p27基因的重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有人p27基因和EGFP基因的重组腺病毒载体,并观察其表达.方法 利用腺病毒载体系统Adeno-X,通过质粒抽提、电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP;酶切、PCR鉴定重组腺病毒质粒;利用293细胞包装重组腺病毒载体PAd-p27-EGFP,通过荧光倒置显微镜观察EGFP的表达.结果:经酶切和PCR鉴定,成功构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP,利用脂质体转染人293细胞后,转染腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应(CPE).结论:利用腺病毒载体系统Adeno-X成功构建含CMV启动子的Flag-p27和EGFP基因的腺病毒载体,为进一步研究细胞周期调控与慢性移植物失功之间的关系,并为寻找慢性移植物失功的基因治疗的途径奠定基础.     

构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体及其转染对星形胶质细胞增殖的影响

目的：构建携带人GFAP启动子和p27基因的重组腺病毒载体并进行鉴定，研究其转染星形胶质细胞后对细胞生长增殖的影响。方法：对实验室原有的pGFAP-IRES2-EGFP-p27质粒进行转化、扩增、抽提、酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和测序；通过设计引物，进行PCR扩增后分别获取GFAP启动子和p27基因片段，依次交换入线性化表达载体GV269和p DC315-GFAP-EGFP载体，最终构建pDC315-GFAP-p27-EGFP；将其转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，经在HEK293细胞反复扩增数代后，进行纯化及滴度检测；转染星形胶质细胞后观察细胞生长和荧光表达情况；检测转染后星形胶质细胞细胞周期和凋亡比例、p27的表达情况。结果：经酶切鉴定和测序，成功鉴定真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27；经PCR鉴定和测序，成功构建重组腺病毒过表达载体pDC315-GFAP-p27-EGFP；经包装后，Ad-GFAP-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应，而且能够特异性地在星形胶质细胞中表达绿色荧光蛋白；经流式细胞仪分析，转染星形胶质细胞72 h后，与对照组相比，...     

人miR-152基因的慢病毒载体的构建及稳定株筛选

目的构建人miR-152基因重组慢病毒载体并筛选稳定表达株。方法 PCR扩增包括miR-152前体所在区域的基因组DNA,克隆到慢病毒载体表达质粒pGIPZ中,得到重组的pGIPZ-miR-152表达载体,通过与包装质粒共转染HEK-293T细胞,获得携带miR-152 minigene的重组慢病毒。用病毒感染HepG2细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选。用real-time PCR法检测miR-152基因的表达。结果构建的重组质粒经双酶切验证和测序比对鉴定正确;该质粒转染293T细胞获取的慢病毒滴度达7.5×107TU/mL;用病毒感染HepG2细胞,感染效率达70%以上。药物筛选10 d后,获得的过表达株miR-152表达量比正常细胞高近10倍。结论成功构建人miR-152基因慢病毒载体质粒pGIPZ-miR-152,并筛选出miR-152过表达细胞株,为后续实验奠定基础。     

Id3-EGFP融合基因表达载体的构建及其在人肺癌细胞A549中的表达

目的构建人分化抑制因子3（Id3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因表达载体pEGFP／Id3，使Id3-EGFP融合蛋白在人肺癌细胞A549中得到表达。方法扩增并克隆人Id3 cDNA，构建Id3和EGFP的融合基因表达载体pEGFP／Id3。用脂质体转染技术将pEGFP／Id3导入A549细胞，使Id3-EGFP融合蛋白在A549细胞得到表达。结果经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实，Id3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游，获得融合基因表达载体pEGFP／Id3。利用脂质体转染技术将pEGFP和pEGFP／Id3转入A549细胞，24h后，在激光共聚焦荧光显微镜下可观察到表达EGFP的细胞发出绿色荧光，流式细胞术分析表明，转染48h时EGFP阳性表达细胞率最高，分别可达65．40％和60．50％。pEGFP／Id3转染的A549细胞S期细胞和G2期细胞比例均明显高于pEGFP转染细胞组和未转染细胞组，表明Id3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展，从而促进细胞增殖。结论真核表达载体pEGFP／Id3的成功构建及其在A549细胞中的表达，为研究Id3的细胞定位表达及Id3在细胞生长调控中的作用奠定了实验基础。     

人脐带血间充质干细胞体外分离培养研究

目的:探讨人脐带血来源间充质干细胞体外分离及培养方法.方法:采用Ficoll-paque(1.077 g/ml)分离液密度梯度离心法结合直接贴壁分离人脐带血单个核细胞中间充质干细胞(MSCs),20?S/DMEM培养,培养至48 h换液并将其上清加入另一培养皿继续培养.观察2个时期细胞贴壁情况;应用流式细胞仪检测各时期细胞.结果:密度梯度法分离来脐血单个核细胞进行培养,可观察12 h即可见少量细胞贴壁生长,绝大部分MSCs在96 h内完成贴壁,经传代纯化第1、2个48 h贴壁细胞均可培养出形态呈较均一长梭形细胞.流式细胞仪检测:单个核细胞中CD44 细胞比例占7.1%、CD34 占28.9%,而在第1个48 h贴壁细胞CD44 、CD34 比例分别占47.2%、6.7%;而第2个48 h贴壁细胞CD44 、CD34 分别占53.3%、4.6%.结论:人脐血间充质干细胞能在体外分离培养,贴壁细胞稳定表达MSCs相关抗原.     

干细胞研究的近况

目前干细胞研究已成为热门话题。现简要叙述其近年的研究概况和一些有争议的问题。虽然干细胞真正在临床的应用存在不少问题 ,但干细胞的应用前景是乐观的     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势

背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低,体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞,对进一步研究至关重要。目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞标记物表达,分别进行成骨、成脂诱导分化。结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓问充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样;表达CD29、CD90,不表达CD45;成骨、成脂诱导分化后,茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小,可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。     

骨髓贴壁细胞向破骨细胞的分化

背景：一般认为采用贴壁分离法得到的小鼠骨髓中能够贴壁的细胞为间充质干细胞,并能分化成为成骨、成脂肪及成软骨细胞,其中贴壁的细胞是否有分化为破骨细胞的潜能尚不明确。 目的：检测贴壁分离法得到的小鼠骨髓中能贴壁的细胞是否能够分化为破骨细胞。 方法：采用贴壁法得到小鼠原代间充质干细胞,以及通过贴壁1-5d后得到不同时间贴壁的骨髓细胞。原代间充质干细胞及不同时间贴壁的骨髓细胞分别用普通培养基,及含m-csf和RANKL培养基,培养9 d后进行碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色。原代间充质干细胞传代后,第2代间充质干细胞分为4组,分别用普通培养基、含m-csf培养基、含RANKL培养基及含m-csf和RANKL的培养基培养,9 d后进行碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶染色。 结果与结论：贴壁法得到较均一的间充质干细胞,原代及传代贴壁细胞的联合诱导组抗酒石酸酸性磷酸酶染色均为阳性,说明原代和传代的贴壁骨髓细胞中均有可以分化为破骨细胞的细胞。不同时间贴壁的细胞诱导后碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶染色有差异,说明不同时间贴壁的细胞存在分化差异。     

Selective upregulation of MHC class I expression in metastatic colonies derived from tumor clones of a murine fibrosarcoma

Eighteen metastatic nodes derived from the wild-type (GR9) and from 4 different clones (G2, D8, B10, and B9) obtained from a fibrosarcoma were analyzed for H-2 class I and II expression, as well as for adhesion molecules (CD44, CDIIb, CD18, CD49, and CD54). When metastatic nodes were cultured, typed for H-2 antigens, and compared with the H-2 expression of the inducing tumor cell, H-2 Kd and Dd class I expression was greater in most nodes analyzed. In contrast, the Ld molecule remained negative, or showed a minor increase. Class II expression was negative in the wild-type and the tumor clones, and remained so in the metastatic colonies. Analysis of the adhesion molecules revealed no differences between the inducing tumor cells and the metastatic nodes. The only molecule expressed was CD44, which was present in all cells studied and was also inducible by interferon-gamma. The increase in H-2K and H-2D expression was associated with resistance to natural killer cytotoxicity, as observed in the G2 tumor clone and some autologous metastases, such as B9MP2, G2MK2, and G2MLI. In three independent clones of this tumor system (D8, BIOMP6, and B9MP6) we found that tumor cells treated with interferon-gamma had the same altered phenotype, i.e., a selective lack of response of the Ld molecule to induction. These findings add a cautionary note to the well-established idea that tumor cells may lose all class I antigens during tumor progression, and suggest that sometimes this may not be the case. The selective downregulation of Ld and upregulation of Kd and Dd class I expression may give some tumor cells means of escaping both cytotoxic lymphocyte and natural killer immune surveillance.     

Cardiovascular disease: potential impact of stem cell therapy

Atherosclerotic vascular disease becomes a clinical problem when there is sufficient atherosclerotic plaque burden and/or endothelial dysfunction to cause a limitation of nutrient blood flow to tissues. However, once myocardial infarction has occurred, there is little, if any, way to stimulate the growth of new blood vessels or cardiac muscle to replace that which has been lost. The potential use of hematopoietic stem cells (HSCs) to treat cardiovascular disease has recently been suggested from preclinical and clinical studies. HSCs are precursors of all the blood cells, but they may also give rise to cells of the vascular system, endothelial cells in the form of endothelial progenitor cells (EPCs). Clinical trials have been conducted in patients with either acute myocardial infarction or limb ischemia to determine the initial effectiveness and safety of this treatment approach. These studies demonstrated the potential clinical effectiveness of this stem cell approach to the treatment of patients with acute myocardial ischemia and limb ischemia. Today, more preclinical studies are planned to elucidate the mechanism by which transplanted stem cells can home and differentiate into these endothelial cells and cardiac muscle cells. At the same time, new clinical trials are planned to evaluate both chronic, stable as well as acute myocardial ischemia and limb ischemia with CD34⁺ and CD133⁺ stem cells, as well as with further selected EPCs and mesenchymal stem cells.     

不同来源内皮细胞生物学性状的比较

目的:比较大鼠胸主动脉来源的成熟内皮细胞和骨髓间充质干细胞(MSCs)来源的内皮细胞生物学性状及各自Akt表达的情况。方法:分离培养大鼠胸主动脉来源内皮细胞,诱导MSCs分化为内皮细胞,对2组细胞的细胞形态、增殖能力、成管能力进行比较,通过Western blotting比较其表面标记表达情况及Akt表达情况。结果:MSCs来源的内皮细胞形态学与成熟内皮细胞不尽相同,增殖能力和成管能力均强于后者。2组细胞均可表达内皮细胞的表面标记,但成熟内皮细胞表达强于分化而来的内皮细胞(P<0.05)。Akt表达在分化而来的内皮细胞明显高于成熟内皮细胞(P<0.05)。结论:MSCs分化而来的内皮细胞和成熟内皮细胞存在生物学性状和Akt表达差异。     

干细胞若干定义的相关探讨

背景：近10年来干细胞研究所取得的巨大进展，不仅影响和促进了生物学及其相关基础科学，而且还在医学、药物开发、农业等许多领域得到广泛的应用，目前已成为研究的热点问题。目的：在干细胞的定义上还存在一些需要探讨的问题，明确定义将有利于干细胞研究的快速发展。方法：回顾干细胞的发展和概念提出，特别是通过中英文权威定义的比较，提出作者的看法。结果与结论：干细胞的定义上还存在一些问题值得探讨，特别是一些中英文表述不同影响了理解。例如，“多能干细胞”对应译成两个单词：PluripotentStemCell和MultipotentStemCell，然而Pluripotent和Multipotent两个单词的英文意义不同。为了学术交流和沟通，作者提出将PluripotentStemCell称为“万能干细胞”，而保留MultipotentStemCell为“多能干细胞”的定义。以上结论供广大同仁探讨，以利于抛砖引玉。     

人多能干细胞的冷冻与保存

背景：人多能干细胞的出现与发展是近年来生物医学研究领域的重大突破。但其在基础，临床研究中的广泛应用还有诸多限制，建立安全有效标准化的冷冻保存方案是人多能干细胞广泛应用面临的重大挑战。目的：回顾人多能干细胞冷冻领域的研究进展，探索造成冷冻损伤的原因和机制及改进方式，致力于促进新的更有效的冷冻方案形成。方法：以“人多能干细胞、人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、玻璃化、程序化冷冻、慢冻法、冷冻保存”为中文检索词，以“humanpluripotentstemcells，humanembryonicstemcell，humanintroducedpluripotentstemcell，vitrification，programmedcryopreservation，slow-freezing，cryopreservation”为英文检索词，应用计算机检索中国知网全文数据库、万方全文数据库、维普（viP）期刊全文数据库、PubMed数据库有关人多能干细胞冷冻保存技术的文献，排除与研究目的无关及重复文献，保留58篇文献进一步总结分析。结果与结论：了解人多能干细胞冷冻过程中造成冷冻损伤的原因和机制，是寻找高效的冻存方案的关键。需要更清晰的了解冷冻过程中损伤的原理，改进和创新低温生物技术来避免各种冷冻损伤的发生并致力于探讨可重复的，高效的，符合GMP要求的，能大规模冻人多能干细胞的方案。     

细胞因子组合对脐血干 /祖细胞的调控作用

INTRODUCTIONIntheclinicalapplication,suchashematopoeticstemcellorpro-genitortransplantation,genetictherapyandtumordefecation,whetherthehematopoieticstemcellorprogenitorcankeeptheam-plificationacquiredmuchattention犤1犦.MATERIALSANDMETHODSSamplecollection23samplesofumbilicalbloodwerefromdepartmentofobstetricsandgynecologyofHuashanHospital.Anti-coagulationwithheparinandmeancollectiveamountwas50～100ml.Collectmonocytes(MNC)regularlywithin24hoursaftercollectionandreservethemafterwash…