不同剂量rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的表达

将表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的重组真核表达质粒(pCG1),以30μg和60μg的剂量分别直接注射小鼠骨骼肌,观察不同剂量的质粒(pCG1)在小鼠体内分泌表达rhGM-CSF的情况。ELISA检测表明,注射60μg质粒DNA的小鼠血液中测得的rhGM-CSF含量与对照组相比有显著差别,而注射30μg质粒DNA的小鼠血液中rhGM-CSF含量与对照组相比无显著差别。以60μg质粒DNA直接注射骨骼肌后第15～20天左右表达量最高,平均约91ng/ml。生物学活性检测结果显示,注射60μg质粒DNA的小鼠血液能维持GM-CSF依赖的TF-1细胞的生长。这提示用质粒DNA直接注射小鼠骨骼肌时,质粒DNA必须达到足够的量。     

直接注射含人Ⅸ因子cDNA质粒在小鼠体内的表达

本文报道了２种分别由人巨细胞病毒（ｈＣＭＶ）启动子和ＳＶ４０早期启动子控制的人Ⅸ因子ｃＤＮＡ质粒ｐＣＭＶ─Ⅸ，ｐＫＧ５─Ⅸ直接注射小鼠骨骼肌内，在肌细胞中可产生Ⅸ因子蛋白，并分泌至血液中，在注射后约第１０ｄ表达量最高，最高含量可达２５ｎｇ／ｍｌ。为采用直接注射法进行遗传病基因治疗提供１种可能。     

重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究

目的：研究肿瘤化疗后转pCH510质粒是否提高疗效,以及二者衔接是否需要特定的条件。方法：采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型：通过基因转染,观察pCH510对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH510转染的抑瘤效果;采用细胞培养技术,观察小鼠体内注射化疗药物后,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响;采用细胞计数的方法,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH510转染,观察抑瘤效果。结果：转染pCH510对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低,活化受阻,在化疗后第3天免疫细胞数降至最低,约10d左右恢复正常;化疗后立即连续10d转染pCH510质粒,疗效没有增强;化疗5d后,再连续15d转染pCH510质粒,则疗效明显增强。结论：化疗后转染pCH510质粒,对小鼠肿瘤治疗效果更好,但由于化疗既降低免疫细胞数量,又抑制其功能,化疗后立即转染pCH510质粒是不恰当的,并且转染治疗时间不宜过短。pCH510、化疗和化疗 pCH510三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性,既抑瘤又捉瘤。     

人血管内皮生长因子shRNA对小鼠肝癌移植瘤生长的影响

目的:使用VEGF shRNA真核表达载体对裸鼠的负瘤局部注射,观察对其生长影响.方法:使用VEGF shRNA 真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,观察VEGF shRNA 真核表达载体对裸鼠的负瘤局部注射后负瘤的生长变化.结果:VEGF shRNA大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,裸鼠的负瘤生长速度变慢.结论:VEGF shRNA可明显使裸鼠的负瘤生长速度变慢,为将VEGF shRNA 真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据.     

SCF或(和)GM-CSF体内基因转染对"自杀基因"疗法抗肿瘤作用的增强效应及其相关机理的研究

目的通过增强体内抗原提呈功能提高“自杀基因”疗法疗效，探讨其相关免疫学机理。方法采用腺病毒介导的ＳＣＦ、ＧＭＣＳＦ基因体内转染联合ＣＤ／５ＦＣ“自杀基因”疗法治疗小鼠的ＣＴ２６结肠腺癌，观察肿瘤的生长和荷瘤小鼠的存活期、不同方法所诱导的ＣＴＬ杀伤活性及肿瘤局部的细胞因子表达。结果一次性低剂量腺病毒介导的ｍＧＭＣＳＦ或（和）ｍＳＣＦ基因的体内转染，能增强“自杀基因”疗法的疗效。在肿瘤局部出现新的细胞因子表达，包括ｍＩＬ４、ｍＩＬ２、ｍＩＦＮγ和ｍＴＮＦα。脾细胞对ＣＴ２６细胞的杀伤作用增强。结论ｍＧＭＣＳＦ或（和）ｍＳＣＦ基因的联合转染对“自杀基因”系统的疗效具有明显的增强作用，其与机体特异抗肿瘤免疫功能以及肿瘤局部分泌的细胞因子有关。     

人G-CSF基因的克隆及其重组逆转录病毒载体的构建与初步应用

活化骨髓是指在体外经IL-2激活后具有抗瘤活性和造血功能的一类骨髓细胞;与LAK细胞相比具有广谱,高效的杀伤活性及低IL-2依赖性等特征。文献报道活化骨髓移植能产生移植物抗白血病(GVL)效应。我们从1993年6月开始应用活化骨髓和LAK细胞体外双重净化自体骨髓移植(ABMT)和移植后应用低剂量IL-2和LAK细胞治疗白血病,10例白血病接受该方案治疗,其中急性非淋巴性白血病6例、淋巴瘤性白血病和慢性粒细胞性白血病经化疗和干扰素治疗未达CR者分别为3例和1例。结果表明:①3例对化疗和干扰素治疗无效的病人移植后CR;②10例病人除1例淋巴瘤性白血病病人移植CR10个月复发外,其余病人移植后持续CR为25-1个月,中位数为14个月;③活化骨髓和LAK细胞体外双重净化不影响CFU-GM的回收率,移植净化骨髓不影响造血功能重建;④活性骨髓和LAK细胞净化ABMT后机体细胞免疫功能恢复明显快于未净化移植病     

B7-1基因转染对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

目的:研究B7-1真核表达载体pcDNA3-B7-1转染对骨肉瘤细胞株LM8的生物学行为的影响。方法:用脂质体(lipofectamine)介导B7-1基因和空载体pcDNA3转染LM8细胞,G418筛选得到抗性克隆,分别命名为LM8/B7-1和LM8/pcDNA3,用聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞仪(FCM)鉴定转染基因的表达,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)和FCM检测细胞体外增殖活性,并观察转染细胞在C3h小鼠体内致瘤能力。结果:RT-PCR和FCM显示B7-1基因在骨肉瘤细胞株LM8中呈高表达,LM8/B7-1体外增殖活性与LM8/pcDNA3和LM8细胞差异并无显著性(P>0.05),但LM8/B7-1的致瘤能力显著下降(P<0.01)。结论:B7-1基因对骨肉瘤细胞的体内增殖能力产生明显抑制作用,可以作为骨肉瘤基因治疗的理想目的基因之一。     

Serotype chimeric oncolytic adenovirus coding for GM‐CSF for treatment of sarcoma in rodents and humans

Sarcomas are a relatively rare cancer, but often incurable at the late metastatic stage. Oncolytic immunotherapy has gained attention over the past years, and a wide range of oncolytic viruses have been delivered via intratumoral injection with positive safety and promising efficacy data. Here, we report preclinical and clinical results from treatment of sarcoma with oncolytic adenovirus Ad5/3‐D24‐GMCSF (CGTG‐102). Ad5/3‐D24‐GMCSF is a serotype chimeric oncolytic adenovirus coding for human granulocyte‐macrophage colony‐stimulating factor (GM‐CSF). The efficacy of Ad5/3‐D24‐GMCSF was evaluated on a panel of soft‐tissue sarcoma (STS) cell lines and in two animal models. Sarcoma specific human data were also collected from the Advanced Therapy Access Program (ATAP), in preparation for further clinical development. Efficacy was seen in both in vitro and in vivo STS models. Fifteen patients with treatment‐refractory STS (13/15) or primary bone sarcoma (2/15) were treated in ATAP, and treatments appeared safe and well‐tolerated. A total of 12 radiological RECIST response evaluations were performed, and two cases of minor response, six cases of stable disease and four cases of progressive disease were detected in patients progressing prior to virus treatment. Overall, the median survival time post treatment was 170 days. One patient is still alive at 1,459 days post virus treatment. In summary, Ad5/3‐D24‐GMCSF appears promising for the treatment of advanced STS; a clinical trial for treatment of refractory injectable solid tumors including STS is ongoing.© 2013 UICC     

脂质体介导的体内外细胞因子基因转移效果的初步研究

本研究用反相蒸发技术制备出包裹IL-2 DNA或IL-6 DNA的脂质体，将其与体外培养的靶细胞共育，或将其直接注射至小鼠腹腔内及荷瘤小鼠的瘤体内．研究其介导体内外基因转移的效果，结果表明我们研制的脂质体不但能将目的基因转移至体外培养的靶细胞中，并可通过腹腔内注射及瘤体内注射后，在腹腔内及肿瘤原位直接将IL-2和IL-6基因转移至腹腔细胞及肿瘤细胞中，稳定表达IL-2和IL-6。     

GM-CSF及B7-1基因修饰的肿瘤细胞疫苗抗肿瘤的研究

目的：研究ＧＭ－ＣＳＦ及Ｂ７－１基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗的有效性。方法：我们将小鼠ＧＭ－ＣＳＦ及ＣＤ８０基因通过逆转录病毒载体分别导入ＥＬ－４淋巴瘤细胞中,进而研究了ＥＬ－４／ＧＭ－ＣＳＦ及ＥＬ－４／Ｂ７－１在同系Ｃ５７Ｂ习中的成瘤性及其诱导抗肿瘤免疫的效果。结果：转Ｂ７－１基因的肿瘤细胞诱发了ＣＤ８０的高表达。转基因的肿瘤细胞在同源小鼠中的成瘤性下降,免疫原笥增强。在肿瘤生长的早期对实验性荷瘤     

成纤维细胞介导的G-CSF基因疗法促进化疗后造血功能恢复的实验研究

利用RT-PCR方法克隆到包括有全部编码序列和部分5′、3′端非编码序列的人G-CSF cDNA,并通过核苷酸测序得到证实。将其定向克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建成人G-CSF的重组逆转录病毒表达载体pLGSN。体外经CRE和CRIP细胞的两次包装,病毒滴度达到了临床应用的水平(1.1×10~6CFU/ml)。hG-CSF逆转录病毒感染NIH3T3小鼠成纤维细胞后,分泌G-CSF达168U/ml,Southern分析表明hG-CSF基因已整合至NIH3T3-G-CSF细胞的基因组中,Northern和Western分析分别从mRNA和蛋白质水平证实了人G-CSF在NIH3T3-G-CSF细胞的表达。将NIH3T3-G-CSF细胞植入同系小鼠体内,能从血清中检测到持续表达的G-CSF活性。本研究为开展人G-CSF基因治疗奠定了基础。     

HA 纳米载体转 hGM - CSF 基因的 HepG2 疫苗联合多柔比星抗肝癌作用

目的：评价HA纳米载体转hGM—CSF基因的HepG2疫苗联合多柔比星治疗肝癌的效果。方法：建立Hu—PBL—SCIDHepG2荷瘤小鼠模型,待皮下种植瘤长至100—150mm3时,随机分为5组,每组5只：对照组（PBS）;化疗组（多柔比星DOX）;疫苗组（60Co照射的转染GM—CSF基因的HepG2细胞）;先疫苗后化疗组;先化疗后疫苗组。末次治疗后第5天处死各组小鼠,用MTT法测定脾脏CTL活性及肿瘤组织浸润淋巴细胞（TIL）杀伤活性;取肿瘤组织行HE染色及CD8＋T细胞免疫组化检查。结果：化疗组的CTL活性与对照组相比无显著变化（P〉0．05）。疫苗组和先疫苗后化疗组及先化疗后疫苗组的CTL活性显著强于上述两组（P〈0．05）,该3组两两之间也存在显著差异（P〈0．05）,而先化疗后疫苗组的CTL活性增强最为明显,明显高于其他两组（P〈0．05）。该组的TIL活性同样强于其他各组。同其它组相比,先化疗后疫苗组的瘤体内可见大量肿瘤细胞坏死,CD8＋T细胞浸润显著增加。结论：HA纳米载体转染hGM—CSF基因的HepG2疫苗的主动免疫联合多柔比星化疗具有协同抗肝癌作用,为肿瘤免疫联合化疗治疗肿瘤提供了实验依据。     

Immune enhancement of nitroreductase-induced cytotoxicity: studies using a bicistronic adenovirus vector

The nitroreductase (NR)/CB1954 enzyme prodrug system has given promising results in preclinical studies and is currently being assessed in phase I clinical trials. It is well established that there is an immune component to the bystander effect observed with other systems such as thymidine kinase and cytosine deaminase; however, such an effect has not previously been described using NR. We have preliminary data suggesting an immune bystander effect with NR to further examine these effects and their potential enhancement by cytokines, an adenoviral vector containing CMV-NR, an internal ribosome entry site (IRES) and the gene for murine GM-CSF (mGM-CSF) was constructed. The NR-GM-CSF virus was validated in 2 experimental models and demonstrated increased therapeutic efficacy in the MC26 murine colorectal tumour model. These data illustrate that the combination of suicide gene therapy using NR and CB1954 with immune stimulation via GM-CSF gives an improved response compared to either modality alone and suggests that the immune component of this response may be beneficial in combating unresectable, metastatic disease and preventing tumour recurrence.