姜黄素阻断NF-κB信号通路促进食管鳞癌细胞凋亡的体外研究

背景与目的:活化的核转录因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。但在食管鳞癌中的作用尚不清楚。姜黄素具有抗感染、抗氧化等多种药理作用。本研究将探讨姜黄素是否能够通过阻断NF-κB信号通路对食管鳞癌细胞增殖、抗凋亡产生影响。方法:Western blot法检测EC9706和Eca109细胞中加入姜黄素(50μmol/L)培养不同时间后,pIκBα和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。在EC9706和Eca109细胞中加入姜黄素培养72h,流式细胞仪检测凋亡细胞情况。MTT法检测姜黄素单独或与5-FU联合对细胞增殖的影响。结果:Western blot的结果显示,在姜黄素作用下EC9706和Eca109细胞中pIκBα和Bcl-2蛋白的表达水平随着时间的延长逐渐下降。在单独使用姜黄素后,就可促进EC9706和Eca109细胞的凋亡(P<0.05);当与5-FU联合使用时,可明显提高EC9706和Eca109细胞对化疗药物的敏感性,凋亡细胞显著增加(P<0.05)。姜黄素与5-FU联合应用48h和72h,可明显抑制EC9706和Eca109细胞的增殖,与单独使用姜黄素或5-FU组相比,细胞存活率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:姜黄素可以通过抑制IκBα的磷酸化阻断NF-κB信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加细胞对5-FU的敏感性。     

Notch1信号途径在食管鳞癌细胞中的激活及对细胞周期的影响

目的 观察Notch1信号途径在食管鳞癌EC9706细胞中的激活状态及 其对细胞周期的影响。方法 通过免疫细胞化学检测Notch1基因在 食管鳞癌细胞株EC9706细胞中的表达,并通过免疫荧光方法研究 Notch1基因在EC9706细胞中的激活状态。并且利用CCK-8试剂检测食管癌细胞的增殖状态。此外,采用RT-PCR和Western blot技术检 测与细胞周期相关基因的表达,最后通过流式细胞仪进一步探索激 活的Notch1信号途径对细胞周期的影响。结果 转染pcNICD后的食 管鳞癌细胞株中发现Notch1基因的表达。免疫荧光结果显示,转染 pcNICD后的食管鳞癌细胞株中Notch1信号途径处于激活状态。与未处理和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,稳定表达NICD的EC9706细 胞的生长速率明显受到抑制（P<0.01）。此外,与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,稳定表达NICD的EC9706细胞的CDK2, cyclin D1和E基因的mRNA和蛋白的表达明显下调（P<0.05）。转染pcNICD的EC9706细胞在G0/G1期的比率高达74.5%,而未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞在G0/G1期的比率分别为59.1%和59.0%。细胞周期分析显示瞬时表达NICD的EC9706细胞在G0/G1期比率的增加,提示激活的Notch1信号途径能够诱导细胞静止在G₀/G₁ 期。结论 Notch1信号途径的激活引起食管鳞癌细胞的细胞周期 静止,提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞癌的新靶点。     

辣椒素联合5-Fu抑制食管鳞癌细胞的增殖及侵袭

目的 探讨辣椒素联合5-Fu对食管鳞癌Eca109和EC9706细胞增殖、耐药的影响.方法 将EC9706和Eca109细胞分为对照组、辣椒素组、5-Fu组和联合用药组,MTT法检测72 h后细胞的增殖情况及辣椒素联合应用不同浓度5-Fu对食管鳞癌细胞增殖的影响.结果 MTT实验表明,辣椒素与5-Fu联合应用可明显抑制Eca109和EC9706细胞的增殖,与单独使用辣椒素或5-Fu组相比,细胞存活率显著降低;对照组和辣椒素组细胞的存活率均随着5-Fu浓度的增加而下降,但在同一浓度,辣椒素与5-Fu联合应用可明显提高食管鳞癌细胞对化疗药的敏感性.结论 辣椒素与5-Fu联合应用,可以增强食管鳞癌细胞对化疗药的敏感性,因此辣椒素有望成为食管癌治疗中的辅助用药.     

NF-κBp65对食管鳞癌细胞上皮间质转化的影响*

目的:探讨NF-κ Bp65对食管鳞癌细胞EC9706上皮间质转化的影响。方法:NF-κ Bp65反义寡核苷酸（NF-κBp65-ASODN ）转染食管鳞癌细胞EC9706,采用RT-PCR、免疫细胞化学及流式细胞术检测NF-κ Bp65-ASODN 转染前后EC9706细胞中NF-κ Bp65、上皮性标志物E-cadherin 及间质性标志物Vimentin mRNA 及蛋白表达的变化,观察转染前后细胞形态学的改变,细胞划痕实验检测转染前后细胞运动能力的变化。结果:转染NF-κ Bp65-ASODN 的EC9706细胞,其NF-κ Bp65mRNA（0.14±0.06）及蛋白（免疫细胞化学:11.33± 1.40% ,流式细胞术:11.78%）的表达低于转染前（mRNA :0.45± 0.05;蛋白:免疫细胞化学:17.17± 1.66% ,流式细胞术:15.76%）（P<0.05）,上皮性标志物E-cadherin mRNA（0.36± 0.08）及蛋白（免疫细胞化学:17.58± 1.86% ,流式细胞术:14.98%）的表达高于转染前（mRNA :0.22± 0.06;蛋白:免疫细胞化学:14.42± 1.63% ,流式细胞术:12.22%）（P<0.05）,间质性标志物Vimentin mRNA（0.75± 0.07）及蛋白（免疫细胞化学:16.00± 1.41% ,流式细胞术:12.90%）的表达低于转染前（mRNA :0.89± 0.09;蛋白:免疫细胞化学:19.50± 0.89% ,流式细胞术:17.76%）（P<0.05）。 转染NF-κ Bp65-ASODN 后,EC9706细胞形态发生改变,细胞迁移距离（0.45± 0.08）较转染前（0.81± 0.11）明显缩短（P<0.05）。 结论:NF-κ Bp65可能参与食管鳞状细胞癌的上皮转化。NF-κ Bp65-ASODN 转染可抑制食管鳞癌细胞上皮间质转化,上皮性标志物E-Cadherin 表达上调、间质性标志物Vimentin 表达下调,且细胞形态发生改变、细胞运动能力降低。      

转染NF-κB抑制物基因对食管癌细胞系生物活性的影响

目的:将NF-κB抑制物基因pcDNA3/mI κBα S32A/S36A转染食管癌细胞株EC1,观察对NF-κB因子活性及对细胞生长的影响.方法:采用脂质体转染法将pcDNA3/mI κBα S32A/S36A质粒转染入EC1细胞进行瞬时表达,检测其对EC1细胞的影响,用Western blot和RT-PCR方法检测转染前后NF-κB p65、NF-κB p50蛋白和mRNA表达水平的变化.结果:与转染pcDNA3.0质粒和未转染质粒组比较,转染pcDNA3.0/mI κBα S32A/S36A质粒EC1细胞的生长速度受到明显抑制,P＜0.05.转染pcDNA3/mI κBα S32A/S36A质粒的EC1细胞,在0、24、48、96小时未见NF-κB p65、NF-κB p50蛋白和mRNA表达,而转染pcDNA3.0质粒EC1细胞可见核内NF-κB p65和NF-κB p50蛋白表达.结论:转染NF-κB抑制物基因IκBα后可抑制EC1细胞的生长,并抑制细胞NF-κB p65、NF-κBp50基因的表达,该结果提示调节NF-κB的表达可能是食管癌基因治疗的靶点.     

NF-κB信号通路在食管鳞癌细胞系中的激活

目的核转录因子NF-kappaB(NF-κB)是一种重要的转录因子,参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。本研究拟通过检测NF-κB信号通路在食管鳞癌细胞系中是否存在,分析NF-κB在食管鳞癌细胞中的激活状态及其对食管鳞癌细胞的生存及转化作用。方法采用免疫细胞化学法和Western blotting法检测两株食管鳞癌细胞系中NF-κB亚单位p50和p65,阻遏物IκBα及其上游激酶IKKβ的蛋白表达。并采用EMSA法检测两株食管鳞癌细胞核中NF-κB与DNA的结合活性。结果食管鳞癌细胞中存在激活的NF-κB信号通路,p50、p65、IκBα及其上游激酶IKKβ的蛋白在细胞质中均表达,并且p50/p65在细胞核中具有较高的DNA结合活性。结论本研究发现NF-κB信号通路在两种食管鳞癌细胞系被激活,提示激活的NF-κB信号通路可能在食管鳞癌发生中起重要作用。     

桥接整合因子1 去甲基化诱导细胞周期阻滞抑制食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖

目的：分析桥接整合因子1（bridging integrator-1, Bin1）去甲基化对Bin1 基因表达和食管鳞状细胞癌EC109 细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：甲基化特异性PCR（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）法检测去甲基化药物5-氮杂-2''脱氧胞苷（5-Aza-2''-deoxycytidine, 5-Aza-dc）处理后EC109 细胞Bin1 启动子区域的甲基化状态,用qPCR、Western blotting 和MTT法分别检测单独5-Aza-dc 和5-Aza-dc 加转染Bin1 基因干扰片段（Bin1 siRNA）处理对EC109 细胞Bin1 mRNA及其蛋白表达和细胞增殖能力的影响,流式细胞术和Western blotting 检测5-Aza-dc 处理后EC109 细胞周期和细胞周期相关蛋白（Cyclin D1 与CDK4）表达的变化。结果：去甲基化药物5-Aza-dc 处理后,EC109 细胞Bin1 基因启动子区域发生去甲基化。5-Aza-dc 处理的Bin1 去甲基化EC109 细胞Bin1 mRNA和蛋白表达明显上调（均P<0.05）,细胞增殖能力明显下降（P<0.05）,细胞阻滞在G0/G1 期,表现为S 期细胞比例显著减少,细胞周期相关蛋白Cyclin D、CDK4 表达均明显下调（均P<0.05）。Bin1 去甲基化EC109 细胞转染Bin1 siRNA后,Bin1 mRNA和蛋白表达明显下调,细胞增殖能力增强（均P<0.05）。结论：Bin1 基因启动子区域在EC109 细胞中呈完全甲基化状态,5-Aza-dc 去甲基化可使食管鳞癌细胞EC109 细胞Bin1 表达升高,通过降低细胞周期相关蛋白表达诱导细胞周期阻滞抑制EC109 细胞增殖。证实表观遗传学变化可能与食管癌细胞恶性增殖有关,可为食管癌治疗提供新的思路。     

雷帕霉素靶蛋白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究

[目的]研究雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号传导通路在食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中的激活状态。[方法]采用细胞免疫组化检测mTOR及其下游靶分子（p70S6K）在两细胞系中的表达．并采用RT-PCR和Western blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平测定此通路的活性。[结果]mTOR在两种细胞系中均有表达，且在EC9706中的表达水平明显高于Eca109，mTOR下游靶点（p706S6K）的磷酸化水平也是EC9706明显高。[结论]mTOR信号通路在两种细胞系中都是特异性激活。激活状态与细胞的分化程度有关，细胞分化程度越低，通路的激活水平越高。     

HCV C 蛋白调控肝门部胆管癌细胞中NF-κB活性的研究

目的探讨HCV C蛋白在肝门部胆管癌细胞中对核转录因子κB(NF-κB)调控作用.方法利用稳定表达HCV C蛋白的QBC939细胞株(QBC939 HCV C ),通过NF-κB报道基因分析法、凝胶迁移率分析(EMSA)检测HCV C蛋白增强肝门部胆管癌细胞NF-κB的DNA结合活性和反式激活活性.RT-PCR、Western blot检测HCV C蛋白对核转录因子κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA及p50、p65、IκBα蛋白表达及IκBα蛋白磷酸化的影响.结果①EMSA结果显示QBC939HCV C 细胞系中NF-κB相对信号密度明显比QBC939细胞高.②将pNF-κB-lun表达质粒转染稳定表达HCV C蛋白胆管癌细胞系中,通过单光子检测仪检测荧光素酶活性,结果显示QBC939HCV C 细胞中活化NF-κB为12.8倍,而QBC939细胞中NF-κB为2.6倍.③RT-PCR显示IκBα mRNA在QBC939 HCV C 细胞和QBC939细胞中的表达无明显差异;Western blot结果显示稳定表达HCV C蛋白的QBC939 HCV C 细胞株的胞核中的p50、p65蛋白高水平表达,而未转染HCV C蛋白的QBC939细胞仅检测出极低水平的p50、p65蛋白.在QBC939HCV C 细胞胞浆中IκBα蛋白低水平表达,QBC939细胞高水平表达,但IκBα蛋白磷酸化水平则相反.结论HCV C蛋白通过增加IκBα降解激活的NF-κB在肝门部胆管癌的发生中起重要作用.     

组蛋白去乙酰化酶在食管鳞癌中的表达及其表达下调对EC9706细胞生物特性的影响

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase2,HDAC2)在食管鳞癌组织中的表达,并研究其表达下调对食管鳞癌EC9706细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,以及分析其相关的分子机制。方法:采用免疫组织化学法检测食管鳞癌组织中HDAC2蛋白的表达。将特异性针对HDAC2基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和对照siRNA分别转染食管鳞癌EC9706细胞,实验分3组:未处理组、对照siRNA组和HDAC2siRNA组。蛋白质印迹法检测各组EC9706细胞中HDAC2蛋白的表达。CCK-8计数法检测转染前后细胞的增殖情况。FCM法检测细胞周期和细胞凋亡的变化。蛋白质印迹法检测与细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡相关蛋白的表达变化。结果:HDAC2蛋白在食管鳞癌组织中表达的阳性率为79.71%,显著高于癌旁不典型增生组织的51.11%和正常食管黏膜组织的23.19%,3者之间差异具有统计学意义(χ2=44.121,P=0.000);此外,HDAC2蛋白表达与患者的年龄和性别无关(P均>0.05),但是与组织学分级、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移均显著相关(P均<0.05)。HDAC2siRNA能有效下调食管鳞癌EC9706细胞中HDAC2蛋白的表达,明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖,促使细胞周期静止在G0/G1期,并诱导细胞凋亡。蛋白质印迹法检测结果显示,HDAC2表达下调能明显提高p21和凋亡相关蛋白bax的表达量,同时降低细胞周期蛋白cyclin D1和bcl-2的表达量。结论:HDAC2可能在食管鳞癌的发生、发展中具有重要作用,其表达下调介导的食管鳞癌细胞增殖抑制、细胞周期静止以及细胞凋亡可能与p21、bax的表达升高和cyclin D1、bcl-2表达降低密切相关。     

食管鳞癌细胞中NF-κB与IκBα的mRNA、蛋白表达

目的：核转录因子NF—kappaB（NF—κB）是一种重要的转录因子，参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。本研究通过检测食管鳞癌细胞中NF—κB与IκBαmRNA、蛋白的表达及NF—κB的DNA结合活性．分析NF—κB在食管鳞癌细胞中的激活状态及其在食管鳞癌细胞的生存及转化中的作用。方法：采用Western blotting法检测两株食管鳞癌细胞胞质中NF—κB亚单位p50和p65、阻遏物IKBα及其磷酸化IKBα的蛋白表达．检测细胞核中p50和p65的蛋白表达并采用EMSA法检测其与DNA的结合活性。使用RT-PCR法检测p50、p65、IκBαmRNA的表达：结果：NF—κB的亚单位p50、p65、IκBα及磷酸化IκBα在食管鳞癌细胞质中均表达．p50、p65蛋白在细胞核中也表达并具有较高的DNA结合活性.RT-PCR结果表明．p50、p65、IκBα的mRNA在细胞中也存在过表达。结论：本研究发现NF—κ在两株食管鳞癌细胞系中被激活，基因的过表达及IκBα的磷酸化在维持NF—κB的活化中起着重要的作用．     

RACK1对食管鳞癌细胞侵袭转移能力的抑制作用

目的:探讨RACK1表达水平与食管鳞状细胞癌不同转移潜能细胞侵袭转移能力的关系.方法:Transwell实验检测食管鳞癌EC9706-H、EC9706-L和EC109-H、EC109-L细胞的转移潜能;利用RT-PCR和Western blot方法,检测食管鳞癌高低转移细胞系EC9706-H、EC9706-L和EC109-H、EC109-L中RACK1的mRNA和蛋白表达水平.利用慢病毒转染技术上调RACK1低表达细胞中RACK1的表达后,采用Transwell实验检测其侵袭和迁移能力的变化.结果:EC9706-H细胞和EC109-H细胞的体外侵袭和迁移能力显著高于EC9706-L和EC109-L细胞系.RT-PCR和Western blot实验结果显示,RACK1在EC9706-H细胞和EC109-H细胞中呈低表达;而在EC9706-L细胞和EC109-L细胞中呈高表达.通过慢病毒转染技术上调EC9706-H和EC109-H细胞系中RACK1的表达,二者的侵袭转移能力明显降低.结论:RACK1表达水平与食管鳞癌细胞的侵袭转移能力负相关,过表达RACK1能够抑制食管鳞癌细胞的侵袭转移能力.这提示,RACK1在食管鳞癌的侵袭转移中发挥重要作用,有可能成为其诊断、治疗及预后评估的新靶点.     

siRNA阻断Stat3信号促进食管鳞癌细胞株凋亡

目的：研究RNA干扰技术沉默Stat3基因对食管鳞癌细胞（EC9706）中持续性激活Stat3信号的阻断作用及对细胞凋亡的影响。方法：将化学合成的100nM的Stat3 siRNA转染EC9706细胞,RT-PCR检测转染前后Stat3 mRNA的表达,Western blot检测转染前后细胞中Bcl-2、Stat3及磷酸化Stat3（p-Stat3）蛋白的表达,凝胶电泳迁移率（EMSA）检测转染前后活化Stat3蛋白的DNA结合活性,流式细胞术检测转染前后细胞凋亡的改变情况。结果：Stat3 siRNA转染细胞48h后细胞形态发生明显的改变,RT-PCR及Western blot结果显示Stat3 siRNA干扰后Stat3mRNA及蛋白表达均受到明显抑制, Stat3信号的激活被阻断,活化Stat3蛋白的核结合活性显著下降。转染后细胞中Bcl-2蛋白的表达明显减少。流式细胞术结果证明Stat3 siRNA可明显促进细胞凋亡。结论：Stat3 siRNA能够特异地阻断食管鳞癌细胞中Stat3 信号的持续性激活并促进肿瘤细胞凋亡。     

曲古抑菌素A对食管鳞癌细胞迁移影响机制探讨

目的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)是一类新型的抗肿瘤药物,抑制食管鳞癌细胞增殖并促进其凋亡,但对食管鳞癌细胞迁移的影响及机制尚不清楚。本研究旨在探讨HDACIs曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对食管鳞癌细胞迁移能力的影响及其可能的机制。方法培养食管鳞癌细胞KYSE-150和EC9706。单独TSA以及联合NF-κB抑制剂BAY 11-7082、PI3K/Akt信号通路阻断剂LY 294002对食管鳞癌细胞进行处理,Transwell法检测食管鳞癌细胞迁移能力,分为NC组(对照组)、TSA组(200nmol/L TSA组)、BAY组(10μmol/L BAY 11-7082组)、TSA+BAY组(200nmol/L TSA+10μmol/L BAY 11-7082组)、LY组(10μmol/L LY 294002组)和TSA+LY组(200nmol/L TSA+10μmol/L LY 294002组)。蛋白质印迹法检测TSA处理后Vimentin、p-p65和p-Akt等蛋白的表达水平,以及TSA联合BAY、LY后Vimentin、p-p65、p-Akt等蛋白的表达情况。多组间均值差异比较采用两因素析因方差分析,两独立组比较采用t检验。结果 Transwell实验结果表明,TSA处理食管鳞癌细胞24h后细胞迁移能力增加,与对照组比较,KYSE-150细胞中,差异有统计学意义,t=13.687,P<0.01;EC9706细胞中,差异有统计学意义,t=11.917,P<0.01。TSA+BAY组与TSA组比较,迁移能力减弱,KYSE-150细胞中,F=169.896,P<0.01;EC9706细胞中,F=248.813,P<0.01。TSA+LY组与TSA组比较,迁移能力减弱,KYSE-150细胞中,F=56.019,P<0.01;EC9706细胞中,F=93.108,P<0.01。蛋白质印迹实验结果表明,TSA使KYSE-150细胞中Vimentin(t=13.156,P<0.01)、Slug(t=43.866,P<0.01)、p-p65/p65(t=28.866,P<0.01)以及EC9706细胞中Vimentin(t=43.565,P<0.01)、Slug(t=20.810,P<0.01)、p-p65/p65(t=73.525,P<0.01)蛋白表达水平升高,TSA+BAY组与TSA组比较,使KYSE-150细胞中Vimentin(F=49.376,P<0.05)、Slug(F=19.636,P<0.05)、p-p65/p65(F=19.636,P<0.05)以及EC9706细胞中Vimentin(F=14.297,P<0.05)、Slug(F=77.817,P<0.05)、p-p65/p65(F=14.137,P<0.05)蛋白表达水平降低;TSA+LY组与TSA组比较,使KYSE-150细胞中Vimentin(F=110.413,P<0.05)、Slug(F=19.636,P<0.05)、p-p65/p65(F=59.929,P<0.05)、p-pAkt/Akt(F=184.615,P<0.05)以及EC9706细胞中Vimentin(F=94.270,P<0.05)、Slug(F=77.817,P<0.05)、p-p65/p65(F=54.267,P<0.05)、p-pAkt/Akt(F=100.043,P<0.05)蛋白表达水平降低。结论 TSA通过激活PI3K/Akt信号通路,进而调节下游信号分子NF-κB亚基p65,促进食管鳞癌细胞迁移。     

沉默锌指蛋白217基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨锌指蛋白217基因(ZNF217)在食管鳞癌侵袭转移中的作用.方法 合成ZENF217基因的siRNA序列并转染对数生长期食管鳞癌EC9706细胞.设置转染无义序列siRNA和未转染EC9706细胞为阴性对照和空白对照.半定量RT-PCR和Western blot方法分别检测转染48 h后3组细胞ZNF217 mRNA和蛋白的表达变化;侵袭小室检测3组细胞穿膜细胞数变化;MTT法分析3组细胞增殖能力的变化.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞ZNF217 mRNA和蛋白表达均显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05);转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞穿膜细胞数显著下降,差异有统计学意义(P ＜0.05);ZNF217 siRNA能明显抑制EC9706细胞体外增殖能力(P＜0.05).结论 ZNF217基因表达下降能显著抑制EC9706细胞体外侵袭力和增殖能力,ZNF217基因有望成为食管癌基因治疗的有效靶点.     

siRNA 沉默HIF-1α在缺氧状态下对食管鳞癌细胞VEGF表达的影响

 目的 观察体外乏氧培养条件下食管鳞癌细胞系EC9706中HIF-1α和VEGF的表达，探讨HIF-1α在低氧条件下对食管鳞癌血管生成的调控作用。方法 CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境，RT-PCR、免疫组化法和免疫印迹法分别检测缺氧状态下HIF-1α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达。采用化学合成小干扰RNA（siRNA）介导的RNA干扰技术（RNAi）用siRNA转染EC9706细胞。观察转染后HIF-1α沉默效果。结果 低氧条件下，EC9706细胞HIF-1amRNA水平稳定，蛋白表达显著升高，而VEGFmRNA和蛋白的表达均显著升高。SiRNA转染EC9706后能够显著下调HIF-1α的基因表达，同时VEGF基因的表达也受到明显抑制。结论 缺氧促使EC9706细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高，并通过转录激活VEGF的机制调控食管鳞癌血管生成。     

长链非编码RNA RP11-1212A22.4通过靶向miRNA-483-5p对食管癌细胞株细胞活力和侵袭能力的影响

目的探讨长链非编码RNA RP11-1212A22.4通过靶向miRNA-483-5p(miR-483-5p)对食管癌细胞株细胞活力和侵袭能力的影响。方法采用GEPIA在线数据库分析RP11-1212A22.4在食管癌组织中的表达情况。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测RP11-1212A22.4在人食管癌细胞株EC9706、KYSE30、TE-13、Eca109和正常食管黏膜上皮细胞株HET-1A中的表达情况。将RP11-1212A22.4相对表达量最低的细胞株EC9706分为RP11-1212A22.4组(转染pcDNA-RP11-1212A22.4质粒)和对照组(转染pcDNA-NC质粒)。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析EC9706细胞活力, 采用Transwell法检测EC9706细胞侵袭能力。StarBase数据库预测和双荧光素酶报告基因实验验证RP11-1212A22.4和miR-483-5p的靶向关系。qRT-PCR检测两组EC9706细胞中miR-483-5p的相对表达量。蛋白质印迹法检测两组EC9706细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)、基...     

靶向 siRNA 沉默 NF -κB/p65对肺腺癌细胞株 A549增殖与凋亡的影响

目的：研究运用 RNA 干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制 NF -κB/ p65基因的表达对人肺腺癌细胞株 A5492细胞增殖、周期及凋亡的影响,探讨 NF -κB/ p65基因在肺腺癌发生发展中的作用。方法：利用阳离子脂质体 LipofectamineTM2000将人 NF -κB/ p65的小干扰 RNA 转染入肺腺癌细胞株 A549中。运用 real time - PCR 和 Western blot 技术检测 A549细胞内 NF -κB/ p65、增殖相关基因 Cyclin D1和凋亡相关基因 Bcl-2、Bax 的 mRNA 的转录水平和蛋白的表达情况,MTT 法检测细胞的增殖活力,显微镜下观察细胞的生长情况。结果：NF -κB/ p65 siRNA 能有效地抑制 A549细胞中 NF -κB / p65基因在 mRNA 水平上的表达（P﹤0.001）,同时下调 Cyclin D1和 Bcl -2的表达（均 P ﹤0.01）。上调 Bax 表达（P ﹤0.001）;蛋白表达也具同样趋势。MTT 实验证明 p65 siRNA 转染组中细胞增殖减慢;显微镜镜下观察显示,细胞生长减慢,凋亡形态改变明显。结论：体外实验初步证明 NF -κB/ p65基因在肺腺癌细胞株 A549增殖分化与凋亡方面扮演重要角色,通过沉默其表达可抑制肺腺癌细胞株 A549增殖并诱导其凋亡。进一步证实 NF -κB/ p65对 Cyclin D1、Bcl -2、Bax 具有调控作用,他们共同参与了肺腺癌的发生发展过程。     

siRNA干扰VRK1表达对食管癌细胞BANF1蛋白表达及增殖迁移能力的抑制作用

 目的 探讨小干扰RNA干扰VRK1表达对食管癌细胞株BANF1蛋白的表达及其增殖迁移能力的影响。方法 将VRK1 siRNA转染EC109和EC1细胞系干扰VRK1的表达， Western blot法检测VRK1siRNA干扰效率及siRNA干扰后食管癌细胞BANF1的表达。CCK-8实验和流式细胞术检测干扰VRK1表达后对细胞增殖能力的影响，Transwell细胞体外侵袭实验观察干扰前后细胞迁移能力的改变。结果 两株食管癌细胞VRK1 siRNA转染后，转染实验组VRK1蛋白表达分别下调62.40%和52.14%，同时BANF1蛋白表达分别下调24.51%和52.87%。转染12 h后，细胞增殖开始受到抑制，36 h抑制率最高，分别达19.41%、20.10%。VRK1和BANF1表达下调后，G1、G2期细胞比例下降，S期细胞比例上升。实验组细胞迁移个数下降，细胞迁移数和对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论 siRNA干扰VRK1表达后可降低食管鳞癌细胞BANF1蛋白的表达，使食管鳞癌细胞增殖周期阻滞在DNA合成期，分裂期细胞比例下降，抑制其增殖及迁移能力。     

HDAC6表达下调对食管鳞癌细胞周期影响的研究

目的:研究HDAC6siRNA对食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6的干扰效果,以及HDAC6表达下调对食管鳞癌细胞增殖能力、细胞周期的影响。方法:将食管鳞癌EC9706细胞分为未处理组、对照siRNA组和HDAC6siRNA组3组,后2组分别转染对照siRNA和HDAC6siRNA。采用半定量反转录-聚合酶链反应、蛋白质印迹及免疫细胞化学检测各组食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6siRNA对HDAC6的干扰效果;采用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖能力的变化;运用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期的变化。结果:HDAC6siRNA组的HDAC6mRNA表达的相对水平为0.044,HDAC6蛋白表达相对水平为0.114,与未处理组(0.951、0.924)和对照组(0.947、0.905)相比,HDAC6mR-NA和蛋白的表达均显著下调,t值分别为2.24和2.52,P<0.05;细胞增殖明显受抑制,且G0/G1期的比率为(68.55±2.01)%,显著高于未处理组(45.64±1.26)%和对照siRNA组(46.23±1.39)%,S期的比率(25.93±0.73)%显著低于未处理组(33.13±1.02)%和对照siRNA组(32.98±0.91)%,差异均有统计学意义,P<0.05。结论:HDAC6siRNA能有效下调食管鳞癌EC9706细胞中HDAC6mRNA和蛋白的表达;HDAC6表达下调能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖并能诱导细胞周期静止在G0/G1期。