慢病毒介导沉默NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的 探讨慢病毒介导沉默NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响.方法 将第三代c57小鼠骨髓间充质干细胞分为实验组、阴性对照组、空白对照组.将慢病毒载体转染至小鼠骨髓间充质干细胞,倒置荧光显微镜观察慢病毒转染结果,Real-time PCR检测NIPBL基因表达情况.成骨诱导培养,检测碱性磷酸酶活性,应...     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养大鼠骨髓MSC的成骨潜能。方法:体外培养SD大鼠骨髓MSC,取第3代细胞提取总核糖核酸(RNA),制备杂交探针,并运用SuperArray公司提供的大鼠Oligo GEArray骨再生基因芯片(每张芯片可测113种基因)进行杂交,化学发光检测,通过X线胶片或台式扫描获得化学发光的芯片图像,使用网上提供的综合型GEArry表达分析配套软件(GEArryExpression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。结果:检测体外培养大鼠骨髓MSC的113种成骨相关的基因,其中有31种基因表达强度较低,45种基因呈中等强度表达,37种基因表达强度较高。结论:体外培养大鼠骨髓MSC具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示大鼠MSC是具有较强成骨细胞分化潜能的成纤维样细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导培养成骨的实验研究

目的 观察人骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 抽取人骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用含地塞米松、β—甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色等方法进行观测。结果 原代人骨髓间充质干细胞10～12d左右即可长满，并可稳定传代，传代细胞5～6d即可传代，在诱导培养液中2周形成多层结构，并聚集成细胞钙化结节。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色，骨钙素免疫组化染色阳性。结论 人骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields, PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖、成骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将培养的第3代大鼠BMSCs分为3组。3个组均以LG-DMEM完全培养基培养1 d,待细胞贴壁后更换新鲜培养基,对照组不做干预处理; PEMFs组进行8 Hz、3.8 mT的PEMFs干预,每天40 min,持续21 d;成骨诱导基(OM)组加入成骨诱导剂,不予磁场干预。采用MTT法测定增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S染色进行成骨分化鉴定;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关基因的表达。结果 相较对照组,成骨诱导剂在干预第7、14、21 d可提高BMSCs的增殖活性（P<0.05）;PEMFs促增殖作用不明显。在BMSCs分化方面,PEMFs组及OM组ALP、茜素红S染色阳性强度均高于对照组（P<0.05）。定量RT-PCR结果显示,PEMFs组及OM组Wnt1、Wnt3a、LRP5、β-catenin、BMP-2、Runx2、ALP、OC mRNA的表达相较于对照组在相应时间点均有所上调（P<0.05）。PEMFs组各检测结果较OM组低,但趋势基本一致。结论 PEMFs在8 Hz、3.8 mT条件下可促进BMSCs的成骨分化,这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

大鼠颅骨骨缝间充质干细胞与骨髓间充质干细胞成骨及成脂能力比较研究

目的 分离培养大鼠颅骨骨缝间充质干细胞(CSSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs),比较两种间充质干细胞体外成骨、成脂诱导的差异.方法 采用出生后5天的SD大鼠,分离培养CSSCs和BMSCs,并进行鉴定.体外对CSSCs和BMSCs进行成骨成脂诱导,采用免疫荧光检测,碱性磷酸酶(ALP)染色,茜素红染色,油红O染色...     

异基因大鼠骨髓间充质干细胞成骨效应的初步观察

目的观察异基因大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的成骨效应。方法将BN品系大鼠来源的MSCs（A组）和经成骨诱导的MSCs（B组）分别与其松质骨制备的脱钙骨基质（DBM）构建组织工程骨,然后分别移植到F344品系大鼠肌袋内,以空白DBM作为对照（C组）。术后6、12、18周通过X线、HE染色和血清碱性磷酸酶检测观察移植物的成骨效应。结果术后X线显示：A和B组在12周时才出现云雾状骨块影像,边界模糊,而C组未显像;18周A和B组骨块显影较12周时明显清晰,C组有云雾状骨块影像。HE染色显示：所有动物6周时均有炎症细胞浸润,未见新生骨小梁;12周时炎症细胞减少,A和B组的新生骨小梁较C组明显增多;18周时炎症细胞消失,A和B组骨小梁较C组明显趋于成熟。血清碱性磷酸酶检测显示：各组6周最低;12周数值最高,其中B组高于A组,C组明显偏低;18周较12周降低,B组和A组仍远高于C组。结论由未诱导的和经成骨诱导的异基因MSCs分别构建的组织工程骨均具有异位成骨能力。提示异基因MSCs可作为种子细胞构建异基因组织工程骨。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

骨髓间充质干细胞复合仿生骨支架成骨效应的研究

目的 构建骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合生物支架材料组织工程骨,探讨低温3D打印联合冷冻干燥法制备的三维仿生复合支架材料内BMSCs增殖、分化、成骨特异性基因表达情况.方法 利用低温3D打印结合真空冷冻干燥法制备三维支架,提取新西兰大白兔的BMSCs,用倒置显微镜及免疫组化鉴定BMSCs的形态及特征.将第3代BMS...     

微RNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

目前,对于大面积骨坏死及骨代谢疾病临床仍没有合适的治疗方法。治疗这些疾病的关键在于如何促进成骨分化,而微RNA(miRNA)作为真核细胞内的特异性调节因子,参与了大量基因的编码,在转录、翻译过程中发挥重要作用,其通过对多种信号通路的调节,促进间充质干细胞的成骨分化和骨再生。同时,miRNA的异常表达也是导致骨质疏松、骨性关节炎等骨代谢疾病的重要因素。由于miRNA数量较多,故其在调节骨代谢过程的作用机制仍不明确,未来需进一步研究,以为骨代谢疾病的特定治疗提供理论依据。     

骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞,具备向成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞等多种细胞分化的能力,其来源较为丰富,异体移植也不会引发明显的排斥反应,因此被广泛应用于组织工程、干细胞移植、骨质疏松症以及骨折不愈合等多种疾病的治疗,成为骨科研究重点.了解骨髓间充质干细胞的分离培养方法及鉴定、成骨向分化诱导方式...     

补肾强督方对骨髓间充质干细胞成骨过程Wnt通路中因子表达的影响

目的:研究补肾强督方含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨过程Wnt/β-catenin通路中因子表达的影响。方法:BMSCs细胞分为空白对照组、西药对照组、补肾强督方低中高剂量组,分别进行成骨诱导分化,茜素红染色法检测各组成骨程度,实时荧光定量PCR检测GSK3β、wnt5a和SOST基因mRNA表达,Western blot检测Wnt/β-catenin通路关键因子GSK3β、wnt5a和SOST蛋白表达。结果:空白组BMSCs成骨分化培养后可见明显矿化结节形成,补肾强督方干预组未见明显矿化结节。与空白对照组比较,补肾强督方含药血清组BMSCs中SOST、GSK3β蛋白表达显著升高,Wnt5a蛋白的表达显著降低(P<0.05)。与空白对照组比较,补肾强督方含药血清组BMSCs中SOST、GSK3βmRNA的表达显著升高,Wnt5a mRNA的表达显著降低(P<0.05)。结论:补肾强督方含药血清具有抑制强直性脊柱炎骨化的作用,其机制可能与抑制BMSCs成骨过程中的Wnt/β-catenin信号通路相关。     

姜黄素促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中活性氧表达变化研究

目的研究姜黄素对成年大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的成骨性分化中活性氧（ROS）表达变化的影响。方法贴壁筛选法体外培养健康SPF级SD大鼠rBMSCs,分为四组,姜黄素组（15μmol/L姜黄素干预）,N-乙酰半胱氨酸（NAC）组（含40 mmol/L NAC）,姜黄素＋NAC组（含15μmol/L姜黄素＋40 mmol/L NAC）,对照组（只含等体积溶剂）。比较各组间碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,骨钙素（bone glaprotein,BGP）含量和ROS相关蛋白表达变化。结果①姜黄素组第4、8、12天ALP表达OD值[（35.72±0.295）、（60.44±0.347）、（51.51±0.487）]均高于对照组[（19.96±0.874）、（53.55±0.978）、（41.32±0.755）],差异均有统计学意义（P〈0.05）;NAC组和姜黄素＋NAC组第4、8、12天ALP活性表达的OD值低于姜黄素组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。②姜黄素组培养12 d时BGP活性[（6.900±0.026）μg/L]高于对照组[（5.690±0.099）μg/L],差异有统计学意义（P〈0.05）,说明姜黄素可明显增强rBMSCs的BGP活性。NAC组和姜黄素＋NAC组的BGP活性[（5.360±0.254）、（5.500±0.232）μg/L]低于姜黄素组[（6.900±0.026）μg/L],差异有统计学意义（P〈0.05）。③rBMSCs诱导成骨化培养8 d后,姜黄素组ERK1/2,p38蛋白的表达量高于对照组,差异有统计学差异（P〈0.05）;NAC组ERK1/2,p38蛋白表达量低于姜黄素组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论姜黄素促进rBMSCs成骨分化过程中ROS表达量的增加。     

miR-125b对人骨髓间充质干细胞成骨潜能的影响

目的观察抑制miR-125b的表达对人骨髓间充质干细胞（MSC）成骨潜能的影响。方法由健康青年男性髂骨取骨术中抽取骨髓分离培养MSC,将其诱导分化为成骨细胞,通过实时定量PCR检测miR-125b在MSC及其诱导分化细胞中的表达。然后进行miR-125b在MSC中的功能试验,使用miR-125b的抑制物GMR-mi RTM microRNAinhibitors通过RNAi-Mate转染试剂瞬时转染MSC,然后再加入成骨诱导剂进行培养,并同时设立转染microRNAinhibitor NC的阴性对照组。细胞培养7天后,进行细胞形态、碱性磷酸酶（改良钙钴法染色）、钙盐结节（茜素红染色）等项目的检测。结果 miR-125b的表达在MSC向成骨分化过程中呈明显下降。转染miR-125binhibitor后的MSC在培养7天后细胞形态逐渐由梭形变为多角形,与阴性对照组类似;ALP染色显示阴性对照组培养7天后为阳性,而试验组在培养7天就呈现强阳性;茜素红染色显示试验组培养7天后即出现了大小不等的钙盐沉积结节,而阴性对照组则暂未出现钙盐结节。结论 miR-125b inhibitor的转染可以促进MSC的成骨分化潜能,间接证实了miR-125b对人骨髓间充质干细胞成骨潜能的抑制作用。     

全反式视黄酸抑制大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及其机制

目的：探索全反式视黄酸（all-trans retinoic acid,at-RA）对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）成骨分化的影响及其机制。方法：成骨诱导培养基诱导rBMSCs,加入不同浓度（0.1、1.0、5.0 μmol/L）at-RA,诱导第7天用组织化学染色法和检测试剂盒检测各组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,第21天用茜素红染色后倒置显微镜观察并经提取法后检测钙盐沉积。于诱导第7、14、21天采用real-time PCR检测骨钙素（osteocalcin,OCN）、骨桥素（osteo－pontin,OPN）,在上述时间点的基础上,再增加第1、3天2个时间点检测Runx2、Osterix以及视黄酸受体RARs（?琢、?茁）mRNA表达。结果：rBMSCs在成骨培养基诱导下经形态和茜素红染色观察证实能分化为成骨细胞,加入at-RA后培养7 d,ALP活性较对照组增加（F=107.177,P=0.000）,与对照组比较,at-RA为1.0、5.0 μmol/L 2组明显升高（P<0.05）。然而经茜素红染色测定,ALP升高组其钙盐沉积与对照组比较反而减少（F=57.554,P=0.000）。选at-RA浓度5.0 μmol/L做real-time PCR检测,与对照组相比在上述3个时间点OCN（F=211.145,P=0.000）、OPN（F=30.835,P=0.005）表达均降低,Runx2（F=106.536,P=0.000）、Osterix（F=452.546,P=0.000）、RAR?琢（F=253.159,P=0.000）的表达在第21天均下降,除Osterix表现为全程下调外,其他2个基因也在多个时间点有统计学差异;而RAR?茁表达则全程明显上升（F=2 294.377,P=0.000）。结论：at-RA抑制rBMSCs成骨分化,其机制可能与RAR?琢的下调和RAR?茁的上调,进而影响Runx2、Osterix的表达有关。     

骨髓间充质干细胞成骨分化调控机制研究进展

骨髓间充质干细胞起源于中胚层,是一种具有多向分化潜能的细胞,其分化成骨的功能对于骨代谢具有重要作用。因此,机体对其有一套严密而精确的信号通路传导来调控其向成骨细胞分化,就目前研究情况来看,主要有Notch信号通路、Wnt信号通路、转化生长因子-β/骨形态发生蛋白(TGF-β/BMPs)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、Hedgehog信号通路等。研究以上通路,对于明确干细胞分化成骨机制有着重要理论指导意义,现就以上信号通路的相关研究进行综述。     

生长因子相关的骨髓间充质干细胞成骨诱导研究进展

骨髓间充质干细胞（bone marrowmesenchymal stem cells,BMSC）是具有多方向性分化潜能的干细胞,它可以向骨、软骨、脂肪、血管内皮、神经、肌腱、肌肉等多种组织分化,因此BMSC是最有应用前景的骨组织工程的种子细胞。     

蛋白激酶CβⅡ负调控小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

目的观察蛋白激酶C(PKC)各亚型在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化中的作用。方法Western blot检测小鼠BMSCs成骨分化中PKC各亚型的活化情况;利用PKC阻断剂GFX分析PKC在BMSCs体外成骨分化中的作用;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测成骨早期分化指标ALP的活性;茜素红染色检测BMSCs体外矿化能力;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨分化相关基因Runx2、Ⅰ型骨胶原a1(ColⅠa1)和ALP的表达情况。结果小鼠BMSCs成骨分化过程中,仅检测到PKCβⅡ亚型活化,其他亚型均无明显活化。利用PKC阻断剂GFX抑制PKCβⅡ活化后,茜素红染色结果显示BMSCs的成骨分化过程受到促进;PCR结果显示成骨分化相关基因Runx2、ColⅠa1和ALP的mRNA水平均有不同程度增加;ALP活性检测结果也显示BMSCs的成骨分化过程受到促进。结论PKCβⅡ可负调控小鼠BMSCs的成骨分化。     

猪骨髓间充质干细胞成骨分化后白细胞表面抗原的表达及意义

目的：研究猪骨髓间充质干细胞（MSC）成骨分化（DOC）后在干扰素-γ（IFN-γ）刺激下对猪白细胞表面抗原（SEA）的变化及外周血单个核细胞（PBMC）增殖的影响，了解其免疫原性。方法：以未分化的MSC为对照，采用流式细胞术分别检测未诱导、成骨诱导的MSC、MSC＋IFN-γ、DOC＋IFN-γ的SLA分子的表达，采用单向混合淋巴反应观察各组细胞对外源凝集素（PHA）刺激PBMC的每分钟脉冲值（CPM）变化。结果：MSC＋IFN-1组和DOC＋IFN-1组SLA—Ⅰ表达上调（P〈0．05），SLA—Ⅱ表达明显上调（P〈0．01）。MSC成骨分化后能抑制PHA刺激的PBMC增殖反应。结论：在体外实验中，DOC后的MSC在IFN-γ刺激下仍具有低免疫原性，且具有免疫调节作用。     

不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞（orofacial bonemesenchymal stem cells, OFMSCs）增殖和成骨分化的影响。方法 体外分离、培养OFMSCs,成骨、成脂、成软骨分化诱导及鉴定,并使用不同含糖量培养基（5.5、11、16.5、25、44 mmol/L）培养OFMSCs,以5.5 mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组。采用CCK-8及流式细胞仪检测各组OFMSCs的增殖活性及增殖指数,OFMSCs成骨诱导后4、7 d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,21 d进行茜素红染色及矿化定量分析,同时用RT-PCR检测3、7、14及21 d相关成骨基因Runx2、Osterix的表达。结果 培养的OFMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节,成脂诱导14 d 后油红O染色可见红色脂滴,成软骨诱导14 d 后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆;糖浓度在5.5～25 mmol/L促进OFMSCs的增殖,但随着糖浓度的继续增加（25～44 mmol/L）,OFMSCs的增殖活性受抑制;成骨诱导时,随着培养液糖浓度升高,ALP活性呈剂量依赖性降低（P Runx2、Osterix mRNA 表达量高于实验组（P Runx2、Osterix mRNA 表达量均出现先上调再下调的趋势。结论 在一定范围的糖浓度内,糖浓度升高可促进OFMSCs的增殖;而糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应。