卵巢移植的研究进展

卵巢是女性重要的生殖内分泌器官,除激素替代疗法,卵巢移植技术为失去卵巢功能的患者提供了新的恢复生殖功能和内分泌功能的方法.卵巢移植研究可分为3个部分:卵巢异种移植,卵巢异体移植和卵巢自体移植.目前自体卵巢移植技术已较为成熟,但应用有限;异体卵巢移植适应性较广,却面临很多问题.总结卵巢移植临床应用受限的主要原因,展望其发展前景,提出卵巢移植成功的关键因素.     

卵巢组织冻存与移植的发展现状

卵巢组织冻存(OTC)与移植目前主要用于青春期前或需尽快接受抗癌治疗的年轻肿瘤患者生育力保存,至今已有二十余年的历史,通过冻存卵巢组织再移植获得的活产已有超过200例的报道,近年来OTC与移植得到了快速发展,但仍存在许多亟待解决的问题。有效性方面,大部分患者自体冻存卵巢组织再移植后,卵巢内分泌功能可恢复至正常,活产率高达40%,然而冻存卵巢组织的回输利用率仍处于较低水平。安全性方面,通过卵母细胞体外成熟、人工卵巢等新兴技术减少肿瘤细胞在卵巢组织移植中转移、复发的风险是近年来众多研究者关注的方向。如何最大限度地保证OTC与移植过程中卵泡的存活也一直是研究的重点,目前有添加生长因子、激素、抗凋亡药物、干细胞等多种方法防治卵泡的凋亡和丢失。然而这些新兴技术大多尚处于实验室阶段,未来期待更多基础和临床研究来为OTC与移植这项生育力保存技术提供更多的有效性和安全性保障。     

卵巢组织冻存移植保护女性生育力的临床应用

近年来,随着癌症诊断、治疗技术的进步和患者生存率的提高,以及国家三孩政策的放开,女性生育力保护和保存已成为国际和国内的热点。卵巢组织冻存移植技术是儿童及抗癌治疗无法延迟的育龄女性生育力保护的惟一方法。文章主要聚焦于卵巢组织冻存移植生育力保护技术的临床应用。     

构建卵巢上皮性癌原位移植瘤动物模型的新方法

构建卵巢上皮性癌（卵巢癌）的动物模型方法包括：裸鼠皮下移植瘤模型，腹腔移植瘤模型，裸鼠网膜移植瘤模型，原位移植-转移瘤模型等。原位移植因为可以提供给被移植物类似于人体的微环境所以有广阔的应用前景。目前的原位移植技术主要是用细胞株构建裸鼠皮下移植瘤作为供瘤体，切成小块后在解剖显微镜下打开卵巢的包膜，将组织块植入卵巢实质。该技术只能间接反应卵巢癌细胞株的特点；此外难度高，需要解剖显微镜等特殊仪器。本研究在实验过程中巧妙地使用了一种新方法，将细胞悬液直接注射到小鼠的卵巢实质内，成功地建立了糖尿病合并重症联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠卵巢癌模型，现报道如下。     

冻融后移植的小鼠卵巢组织对促性腺激素的反应

目的 探讨冻融后移植的小鼠卵巢组织对促性腺激素的反应.方法 将36只性成熟雌性小白鼠随机分为新鲜移植组、冻融移植组和对照组,每组12只.新鲜移植组小鼠切除双侧卵巢,将卵巢切成小组织块,立即移植人双侧肾被膜下;冻融移植组小鼠切除双侧卵巢,将卵巢切成小组织块,采用玻璃化冷冻方法冷冻保存,2周后将冷冻卵巢组织复苏,移植入小鼠双侧肾被膜下.卵巢组织移植2周后,新鲜移植组和冻融移植组每组随机取6只小鼠应用7.5 IU人绝经期促性腺激素及10 IU绒毛膜促性腺激素,观察移植后的卵巢组织对促性腺激素的反应.同时应用免疫组化染色方法观察各组卵泡中卵泡刺激素受体的表达情况.结果 新鲜移植组、冻融移植组和对照组未应用促性腺激素小鼠卵巢组织内近成熟卵泡百分率分别为2.3%、2.3%和2.6%,应用促性腺激素小鼠卵巢组织内近成熟卵泡百分率分别为4.2%、4.0%和5.8%,各组内分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);新鲜移植组和冻融移植组与对照组比较,差异均元统计学意义(P＞0.05).新鲜移植组、冻融移植组和对照组卵泡刺激素受体表达积分吸光度值在窦状卵泡中分别为9408±2777、9175±3093和8838±2064,在窦前卵泡中分别为4531±1903、4808±1386和5516±1136,各组间分别比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 卵巢组织冷冻保存、复苏及移植过程未影响卵巢卵泡刺激素受体的表达,冻融后移植的小鼠卵巢组织对外源性促性腺激素的反应未受冷冻、复苏及移植等过程影响.     

人卵巢组织冻融移植的临床应用

卵巢是女性重要的生殖内分泌器官，一旦受损或丧失功能将严重影响女性的生活质量。随着癌症治疗学的进步，细胞毒性抗癌药物和放射治疗在临床上普遍应用，而大剂量化疗和放疗极易对细胞分裂活动频繁的卵巢组织造成严重的不可逆性损伤，导致提前绝经和不孕。激素替代治疗虽然可以缓解症状，但激素副反应及一些禁忌证使其临床应用受到限制；胚胎冷冻虽然效果较好，但所需时间长，有耽误治疗的可能，且只适用于有配偶的女性；卵子冷冻亦有其明显的缺陷，卵母细胞因体积大和spindle（纺锤体）对温度和渗透压十分敏感而易于冻伤，且多个成熟卵的获取需要激素刺激，由此引发的高雌激素水平可能导致某些肿瘤的恶化。比较之下，卵巢皮质冷冻在保存妇女生育能力及内分泌功能方面显示了其独特的优势：对于不可能冻存胚胎或卵母细胞的儿童患者，冷冻保存卵巢皮质是她们唯一的选择。本文对人卵巢组织冻融移植的适应证及在临床方面的应用进行了综述。     

TRAIL蛋白与顺铂联合应用对卵巢上皮性癌裸鼠腹腔移植瘤生长的抑制作用

卵巢上皮性癌（卵巢癌）被发现时多为晚期，且治疗效果较差，寻找新的、有效杀灭肿瘤细胞的治疗方法迫在眉睫。肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是导致细胞凋亡的重要的细胞因子，TRAIL能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常组织和细胞没有明显的毒性。本研究建立了人卵巢癌细胞系SKOV3的裸鼠腹腔移植瘤模型，探讨TRAIL蛋白与顺铂（DDP）联合应用对肿瘤生长的抑制作用，以及DDP对TRAIL受体的影响，为TRAIL应用于卵巢癌的生物治疗提供实验依据。     

人卵巢组织异种移植模型研究进展

近年来,肿瘤治疗的进展明显提高了年轻女性患者的生存率。但抗肿瘤治疗的长期不良反应会使女性患者产生卵巢早衰和不育。对尚未生育的女性患者来说,保留生育功能至关重要。卵巢组织异种移植技术可以避免将肿瘤细胞重新带回体内的风险,也可以降低体内促排卵带来的危害,而近年来多种异种移植模型的建立为保留人类生殖功能提供了可能。从移植物的来源、培养温度及处理时间、移植部位、受体的选择与处理、促性腺激素的应用等方面对当前人卵巢组织异种移植的研究进展作一综述。     

卵巢组织移植的影响因素

卵巢是女性重要的生殖利内分泌器官，能够产生性激素、维持内分泌及生成卵子。女性的恶性肿瘤治疗，如放化疗及手术切除均会导致卵巢早衰，影响卵巢功能甚至使其丧失生育能力。     

冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取

目的:探求冻存复苏人卵巢皮质在裸鼠体内的发育及卵细胞的提取。方法:取手术切除的5例患者卵巢皮质,放入1.5 mol/L的二甲基亚砜+10％血清中,应用可控程序冷冻仪逐渐降温,移入液氮中冻存。三个月后,将融解的卵巢皮质移植入89只裸鼠皮下,注射hFSH 12周,刺激卵泡生长。注射hCG 36 h后,用18号针头穿刺提取卵细胞。结果:卵泡直径为3～9 mm,穿刺获19个卵细胞,放入TC-199培养基,加20％胎牛血清,25 mmol/L丙酮酸,75 mIU/mL FSH和LH培养,获15个分裂中期的次级卵母细胞。结论:人卵巢组织冻融后可异体移植生长,且其卵细胞可在体外发育成熟。     

卵巢癌淋巴结定向转移裸鼠动物模型的建立

目的:在裸鼠体内建立人卵巢癌定向淋巴道转移动物模型。方法:将卵巢癌细胞株SKOV3移植于裸鼠爪垫下,待裸鼠卵巢癌发生转移时,取其淋巴结转移灶癌细胞再次移植裸鼠爪垫下传代,反复传3代。结果:SKOV3卵巢癌细胞在裸鼠体内传3代后,各代裸鼠的淋巴结转移率一直稳定,且转移途径较为单一;各代癌细胞的体内外增殖能力不断增强。结论:成功建立了人卵巢癌定向高淋巴道转移模型。     

The future of human ovarian cryopreservation and transplantation: fertility and beyond

Objective: To review the current progress in ovarian cryopreservation and transplantation and to discuss the obstacles with the clinical application of this technique.

Design: The literature on ovarian cryopreservation and transplantation was reviewed to facilitate understanding and predict future directions. The studies related to this topic were identified through MEDLINE and other bibliographic databases, focusing on the most recent developments.

Conclusion(s): The experimental evidence for low-temperature storage of ovarian tissue is encouraging. Although restoration of fertility with cryopreserved ovarian grafts has been successful in various animals, there are uncertainties about the optimum use of stored ovarian tissue in humans. Autotransplantation appears to be promising, but the potential risk of transmitting malignant cells in women with cancer is of great concern. The maturation of primordial follicles with xenotransplantation is encouraging, but the efficacy and the safety of this method need further investigation. Furthermore, the quality of oocytes that have been matured in a host animal is unknown. The development of in vitro culture systems for oocyte maturation is still in its infancy. There are many issues to be resolved in ovarian transplantation before the full clinical use of this emerging technique. Most of all, there is an urgent need to optimize the freeze/thaw procedure and to find the means to protect grafts from ischemia-reperfusion injury. Nevertheless, ovarian transplantation should prove to be clinically useful for women at risk for premature ovarian failure.     

卡培他滨对高表达HER-2/neu卵巢癌裸鼠的治疗作用

目的:探讨卡培他滨对高表达HER-2/neu卵巢癌裸鼠的治疗作用。方法:66只雌性健康裸鼠皮下接种人卵巢癌SKOV3细胞,建立试验模型。根据用药情况将裸鼠分成两组:对照组(塞来昔布灌胃治疗,33只)和观察组(塞来昔布联合卡培他滨灌胃治疗,33只)。比较两组SKOV3细胞的生长抑制率、肿瘤体积及肿瘤抑制率,同时观察两组裸鼠的p53标记指数、HER-2/neu标记指数。结果:观察组的细胞生长抑制率为(65.11±0.86)%,高于对照组(40.38±0.58)%,差异有统计学意义(P0.01)。观察组的肿瘤抑制率高于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。观察组裸鼠的p53标记指数、HER-2/neu标记指数均低于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。结论:卡培他滨在高表达HER-2/neu卵巢癌裸鼠的治疗中作用显著,能有效抑制肿瘤细胞的生长,作用机制可能是卡培他滨能调控p53、HER-2/neu基因表达。     

Production of various marker substances in human ovarian cancer cell lines of epithelial origin

Summary Some characteristics of cell biology and the production of various tumor markers were examined using 8 human ovarian cancer cell lines of epithelial origin. Structural abnormalities of chromosomes 1, 3, and 6 were relatively common karyotypic changes among the cell lines. Cytoplasmic estradiol or progesterone receptor was not detected in any of the cell lines. A significant heterogeneity of the production of various tumor markers (ferritin, tissue peptide antigen, carcinoembryonic antigen, carbohydrate antigens 125, and 19-9) was noted among the cell lines grown in culture medium supplemented with serum. Three of the 8 cell lines were adapted to proliferate in completely synthetic serum-free culture medium. In addition to marker substances described above, small amounts of progesterone or human chorionic gonadotropin were produced in 2 of the 3 cell lines grown in serum-free culture medium. These results indicate that various marker substances including tumor markers are not produced consistently by human ovarian cancer cells of epithelial origin.     

整合素连接激酶反义寡核苷酸对卵巢上皮性癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨整合素连接激酶(ILK)反义寡核苷酸(ASODN)对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生长的抑制作用.方法 将ILK-ASODN转染入卵巢癌细胞株H08910细胞,阻断其表达ILK.实验分为6组,分别为空白对照组(A组)、脂质体对照组(B组)、ILK-正义寡核苷酸(SODN)100 nmol/L组(C组)和ILK-ASODN 60 nmol/L组(D组)、ILK-ASODN 80 nmol/L组(E组)、ILK-ASODN 100 nmol/L组(F组).采用RT-PCR技术和蛋白印迹法检测各组H08910细胞ILK mRNA和蛋白表达量的变化;水溶性四氮唑1(WST-1)法及流式细胞术评价H08910细胞转染ILK-ASODN后对该细胞体外增殖的抑制作用及对该细胞周期和凋亡的影响.结果 ILK-ASODN转染后H08910细胞ILK mRNA表达量明显下降,D、E、F 3个实验组分别为0.307±0.011、0.198±0.008、0,与A、B两对照组(分别为0.343±0.006、0.342±0.009)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).ILK-ASODN转染后H08910细胞ILK蛋白表达量也明显下降,D、E、F 3个实验组分别为26.3±0.8、20.6±0.4、0;细胞生长受到明显抑制,细胞凋亡率明显增高,3个实验组分别为7.31%、8.84%、11.27%;G0/G1期细胞增多,3个实验组分别为49.25%、56.28%、67.61%.以上指标分别与A、B组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 ILK-ASODN转染卵巢癌H08910细胞后可以明显抑制其生长.     

脂质体-C-erbB_2反义寡核苷酸对人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤的作用

目的：探讨经脂质体—硫代磷酸化修饰的Ｃ－ｅｒｂＢ２反义脱氧寡核苷酸（Ｃ－ｅｒｂＢ２ｓｕｌｆｉｄｅ－ＯＤＮｓ）作用后的卵巢上皮癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力及形态学变化。方法：利用离体途径将Ｃ－ｅｒｂＢ２ｓｕｌｆｉｄｅ－ＯＤＮｓ导入卵巢上皮癌细胞，然后接种于裸鼠皮下，观察肿瘤体积的变化，并计算抑瘤率。用透射电镜观察肿瘤形态变化。结果：经脂质体－Ｃ－ｅｒｂＢ２ｓｕｌｆｉｄｅ－ＯＤＮｓ作用后的卵巢上皮癌细胞在裸鼠皮下成瘤能力降低，最大抑瘤率可达４１．７％。超微结构显示实验组肿瘤细胞异染色质增多，分化增高。结论：Ｃ－ｅｒｂＢ２癌基因的反义调控能降低卵巢上皮癌的成瘤能力，抑制肿瘤生长，在卵巢上皮癌的基因治疗中有一定作用     

Smac基因转染对卵巢癌SKOV3/DDP裸鼠移植瘤顺铂敏感性及微血管生成的影响

目的:探讨转染Smac基因对卵巢癌SKOV3/DDP裸鼠移植瘤顺铂敏感性及微血管生成的影响。方法:建立卵巢癌SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,随机分为5组,分别给予不同药物干预:(1)对照组:移植瘤内注射生理盐水;(2)DDP组:腹腔内注射顺铂;(3)空质粒+DDP组:移植瘤内注射空质粒,24h后腹腔内注射顺铂;(4)Smac组:移植瘤内注射Smac重组质粒;(5)Smac+DDP组:移植瘤内注射Smac重组质粒,24h后腹腔内注射顺铂。顺铂浓度为0.5mg/m1,给药剂量按3mg/kg计算。观察各组裸鼠移植瘤体积变化,计算抑瘤率。TUNEL法检测移植瘤组织标本的凋亡指数,免疫组化法检测CD34并计算微血管密度(MVD)。结果:Smac+DDP组的移植瘤体积最小,平均抑瘤率72.94%,与其他组比较差异有统计学意义(P0.05)。对照组、DDP组、空质粒+DDP组、Smac组、Smac+DDP组的凋亡指数分别为(19.90±3.18)%,(21.82±4.40)%,(22.64±3.81)%,(30.23±4.06)%,(48.59±4.47)%,MVD计数分别为(24.8±5.36),(21.2±3.11),(19.8±3.70),(14.4±3.85),(11.6±2.70)。其中,Smac+DDP组的凋亡指数最高,MVD最低,与其他组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:Smac基因转染可增强卵巢癌耐药移植瘤对顺铂的敏感性,同时减少微血管生成。     

MicroRNA-16逆转上皮性卵巢癌耐药的动物实验研究

目的:研究微小RNA-16(miR-16)对人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤耐药性的逆转作用,并初步探讨其逆转作用机制。方法:24只BALB/c裸鼠,随机分为四组,每组6只:Ⅰ组给予皮下接种卵巢癌SKOV3细胞株,成瘤后应用顺铂治疗;Ⅱ组皮下接种卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂治疗;Ⅲ组皮下接种卵巢癌SK-OV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂与miR-16阴性对照试剂(miR-16 Negative)协同治疗;Ⅳ组接种卵巢癌SKOV3/DDP顺铂耐药细胞株,成瘤后给予顺铂与miR-16化学修饰模拟物(miR-16 Agomir)协同治疗。观察比较四组皮下肿瘤生长情况,种瘤后第35天处死裸鼠,称取肿瘤组织质量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肿瘤组织中bcl-2 mRNA表达,免疫组化方法检测各组肿瘤组织中bcl-2蛋白表达。结果:顺铂与miR-16 Agomir协同治疗组裸鼠皮下肿瘤生长受到明显抑制,其肿瘤组织中bcl-2 mRNA表达水平较其余各组降低,差异具有显著性(P<0.05),其bcl-2蛋白表达亦明显低于其余各组(P<0.05)。结论:miRNA-16可能通过对其靶基因bcl-2的反向调控作用,逆转裸鼠卵巢癌皮下移植瘤顺铂耐药性。     

溶血磷脂酸受体在卵巢癌细胞系3AO、OVCAR3、SKOV3及卵巢癌组织中的表达

目的:研究溶血磷脂酸受体在人卵巢癌细胞系和人卵巢癌组织中蛋白的表达。方法:用免疫细胞化学和免疫组织化学法检测LPA1,LPA2和LPA3蛋白在人卵巢癌细胞系3AO、OVCAR3、SKOV3和人卵巢癌组织中的表达水平。结果:免疫细胞化学显示LPA1,LPA2和LPA3蛋白在人卵巢癌细胞系中均有表达;免疫组织化学显示LPA1蛋白在正常卵巢上皮和卵巢良性肿瘤中高表达,LPA2和LPA3蛋白在人卵巢癌组织中高表达。结论:LPA1,LPA2和LPA3在人卵巢癌细胞系和人卵巢癌组织中均有广泛表达;LPA2,LPA可能与卵巢癌的发生发展密切相关。     

卵巢上皮性癌淋巴道定向高转移细胞系的建立及其生物学特性的鉴定

目的筛选卵巢上皮性癌（卵巢癌）淋巴道定向高转移恶性肿瘤细胞亚群,并对其生物学特性进行鉴定。方法将卵巢癌细胞株SKOV3细胞接种于裸鼠爪垫皮下,待植入细胞在裸鼠体内成瘤并发生转移时,取其淋巴结转移灶中癌细胞再次接种于裸鼠爪垫皮下传代,每代均取出淋巴结转移灶中癌细胞进行培养,通过单细胞分离（克隆）培养或局部淋巴结转移灶筛选的方法建立连续传代细胞系,重复传3代后,通过裸鼠接种实验观察各代裸鼠的淋巴结转移率。利用细胞生长曲线、HE染色、染色体分析、流式细胞分析、裸鼠接种、免疫组化等方法鉴定各代细胞的生物学特性。结果所建立的连续传代1～3代的细胞系,分别命名为SKOV3-PM1、SKOV3-PM2和SKOV3-PM3细胞,癌细胞在裸鼠体内传3代后,裸鼠的淋巴结转移率为100％（10／10）,原代SKOV3细胞的淋巴结转移率为10％（1／10）,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;SKOV3-PM3细胞形成的淋巴结转移灶的数目（26／10）较SKOV3细胞多（1／10,P〈0．01）;且转移灶多位于淋巴结。细胞染色体分析显示,SKOV3细胞染色体数目大多数分布在83～89条,SKOV3-PM3细胞染色体数目大多数分布在91～105条。SKOV3与SKOV3-PM3细胞染色体数目比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;转移灶中上皮膜抗原（EMA）表达呈阳性,证实转移细胞株保持着卵巢癌细胞的生物学特性;SKOV3-PM3细胞倍增时间为22．7h,SKOV3细胞为49．6h,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。流式细胞分析显示,SKOV3-PMl、SKOV3-PM2、SKOV3-PM3细胞的淋巴结转移灶中癌细胞的DNA合成期和分裂期细胞的比例分别为24．2％、29,4％和36．7％,明显高于SKOV3细胞的21．5％（P〈0．05）。结论本研究成功建立了卵巢癌淋巴道定向高转移细胞系,为研究卵巢癌的淋巴结浸润转移的发病机制提供了良好的实验材料。