3T3-L1前脂肪细胞中烟碱样乙酰胆碱受体α7对脂肪因子肾上腺髓质素mRNA表达的影响

目的研究3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中是否有胆碱能系统物质mRNA的表达,及烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)α7功能状态对脂肪因子肾上腺髓质素(AM)mRNA表达的影响,初步阐明脂肪细胞中非神经胆碱能系统与肥胖、胰岛素抵抗及其他脂代谢性疾病的关系。方法以3T3-L1前脂肪细胞和诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中是否有乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和nAChR α7三种胆碱能系统主要组分的mRNA表达;对前脂肪细胞及成熟脂肪细胞分别予不同水平的广谱nAChR激动剂尼古丁、特异性nAChR α7激动剂氯化胆碱及特异性nAChRα7拮抗剂甲基牛扁亭碱处理12、24、36h,并设立相应处理时间的空白对照组,应用RT-PCR方法检测前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA的表达。结果1.RT-PCR方法证实在3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中均有AChE、ChAT、AChR α7的mRNA表达。2.给予不同剂量的尼古丁和氯化胆碱,干预作用不同时间,3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA表达水平与相应的空白对照组比较均呈剂量依赖性升高(P<0.05或P<0.01),但随干预作用时间延长,这种剂量依赖性上调效应减弱。二种激动剂以氯化胆碱的剂量依赖性上调效应更明显。而相同剂量下不同作用时间的处理组间无统计学差异(Pa>0.05)。3.拮抗剂甲基牛扁亭碱对3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA表达则呈明显的剂量依赖性抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中存在非神经元型胆碱能系统,其中nAChR α7调节脂肪因子AM mRNA的表达,脂肪组织中非神经元型胆碱能系统的重要组分nAChR α7可能在肥胖、胰岛素抵抗及其他脂代谢相关疾病的病理生理过程中发挥重要作用。     

迷走神经电刺激对实验性关节炎大鼠T细胞活化的调节机制

目的探讨迷走神经刺激对实验性关节炎（EA）大鼠T细胞活化的调节作用及其机制。方法建立大鼠EA模型,将模型大鼠分为迷走神经刺激（VNS）组和假手术组。VNS组在完全清醒状态下予迷走神经电刺激,刺激参数：波宽1.0ms、电流强度3.0mA、频率16Hz、串长10s、串隔1.5min,每日30min,共4周。用流式细胞及免疫荧光技术检测大鼠外周血CD4^＋ T淋巴细胞活化（表达CD71）及表达烟碱样乙酰胆碱受体α7亚单位（nAChRα7）和胆碱乙酰转移酶（ChAT）的状态。结果治疗1周后VNS组大鼠外周血CD4^＋T细胞表达nAChRα7、ChAT明显高于假手术组（Pa〈0.01）;2周后VNS组大鼠外周血活化的CD4^＋ T淋巴细胞明显低于假手术组（P〈0.01）;治疗3周后VNS组大鼠关节炎指数明显低于假手术组（P〈0.01）。结论电刺激迷走神经可以上调nAChRα7在CD4^＋ T淋巴细胞中的表达,激活免疫系统的固有胆碱能系统,通过抑制免疫细胞异常活化,减少炎性细胞因子合成及分泌,减轻关节炎症,从而实现对EA的治疗作用。     

转化生长因子β1对高体积分数氧暴露早产新生大鼠肺纤维化的调控作用

目的 探讨转化生长因子(TGF-β1)对高体积分数氧(高氧)暴露早产新生大鼠肺纤维化的调控作用.方法 将80只早产新生SD大鼠随机分为空气组和高氧组,每组40只;每组又随机分为3、7、14、21 d4个亚组.采用原位杂交法检测各亚组早产大鼠肺组织TGF-β1 mRNA表达与分布;采用免疫组织化学法检测各亚组早产大鼠肺组织TGF-β1蛋白、Ⅰ型与Ⅲ型胶原表达与分布;并用图像分析方法 检测各亚组早产大鼠肺组织TGF-β1 mRNA及其蛋白与Ⅰ型、Ⅲ型胶原阳性表达的PU值.结果 高氧第3天,肺组织TGF-β1mRNA及其蛋白呈现弱阳性表达,第7、14、21天呈强阳性表达,其表达量于第7天开始增高,第14天达高峰;肺组织TGF-β1 mRNA及其蛋白阳性表达的Pu值在第7、14、21天均高于空气组(Pa<0.01).Ⅰ型胶原在第3、7天时呈弱阳性表达,第14、21天时呈强阳性表达,其表达量从第14天开始增加,第21天时达高峰;Ⅲ型胶原表达强度在第3天时呈弱阳性,第7天时开始增强呈中等阳性表达,第14、21天时呈强阳性表达,其表达量在第7天时开始增加,第14天时达高峰,表达量高于Ⅰ型胶原;肺组织Ⅰ型、Ⅲ型胶原阳性表达的PU值在第14、21天时均明显高于空气组(Pa<0.01).高氧组肺组织TGF-β1 mRNA及其蛋白与Ⅰ型、Ⅲ型胶原阳性表达均分布于支气管和血管周围结缔组织及肺间质中;在第14、21天高氧组肺组织TGF-β1蛋白表达与Ⅰ型胶原呈显著正相关(r=0.881,0.793 P.<0.01),与Ⅲ型胶原亦呈显著正相关(r=0.866,0.891 Pa<0.01).结论 TGF-β1过度表达而介导的细胞外基质(ECM)过度合成是肺纤维化发生的重要机制,在肺纤维化形成过程中TGF-β1对Ⅰ型、Ⅲ型胶原等ECM的沉积发挥重要的调控作用.     

福辛普利对肾小球系膜细胞 TGF-β1/Smad 信号通路的干预作用

目的观察新型血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)--福辛普利(fosinopril,FOS)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMC)Ⅰ型胶原(ColⅠ)蛋白分泌和Smad2、Smad7mRNA表达量的影响。方法建立体外培养的大鼠GMC,鉴定后3～10代用于实验。实验分为正常对照组、TGF-β1刺激组(加5ng/L TGF-β1和5%的胎牛血清)和FOS组(加5ng/L TGF-β1、10μmol/L FOS和5%的胎牛血清)3组,分别于6、24和48h后ELISA法测定细胞培养上清液中ColⅠ蛋白表达量,荧光定量PCR法检测Smad2、Smad7 mRNA表达量的变化。结果①正常培养的大鼠GMC均有一定量的ColⅠ蛋白表达;TGF-β1刺激组在各时间点ColⅠ蛋白分泌均高于对照组(P<0.01),FOS各组ColⅠ蛋白分泌均低于TGF-β1刺激组(P<0.05)。②正常培养的大鼠GMC可表达一定量Smad2、Smad7 mRNA,TGF-β1刺激组在各时间点Smad2、Smad7 mRNA表达量均高于对照组,FOS治疗组Smad2 mRNA表达量均低于TGF-β1刺激组;Smad7 ...     

烟碱样乙酰胆碱受体α7在支气管哮喘患儿CD4+T淋巴细胞上的表达

目的探讨哮喘患儿血CD4＋T淋巴细胞表达烟碱样乙酰胆碱受体α7（nAChRα7）与相应的细胞培养液IL-4、干扰素-γ（IFN-γ）水平的关系,分析nAChRα7在哮喘发病过程中的临床意义。方法哮喘患儿30例（哮喘组）与健康儿童20例（健康对照组）,分别抽取静脉血8mL,分离外周血淋巴细胞,并分别加入100μmol/L烟碱、1.0mg/Lα-银环蛇毒（α-BTX）,另设空白对照,恒温孵育24h后提取其淋巴细胞,并收取培养液置-20℃冰箱保存。用三色流式细胞仪检测各组淋巴细胞CD3^＋/CD4^＋/nAChRα7表达。ELISA法检测其淋巴细胞培养液中IFN-γ、IL-4水平。结果哮喘组患儿血CD3^＋/CD4^＋/nAChRα7表达较健康对照组儿童明显增高（P〈0.05）。烟碱刺激24h后哮喘组、健康对照组外周血CD3^＋/CD4^＋/nAChRα7的表达均较空白对照明显增加（Pa〈0.01）;且烟碱刺激24h后哮喘组较健康对照组表达显著增加（P〈0.05）。α-BTX刺激24h后外周血CD3^＋/CD4^＋/nAChRα7表达降低,但无统计学意义（Pa〉0.05）。哮喘组培养液中IL-4水平较健康对照组增加,IFN-γ水平较健康对照组减低。烟碱刺激24h后IL-4水平较空白对照增高（P〈0.01）,IFN-γ水平较空白对照明显减低（P〈0.05）。α-BTX刺激24h后IL-4、IFN-γ水平均无明显变化（Pa〉0.05）。外周血CD4＋T淋巴细胞nAChRα7表达与淋巴细胞培养液IL-4水平呈正相关（r=0.517P〈0.05）,与IFN-γ水平呈负相关（r=-0.288P〈0.05）。结论哮喘患儿血CD4＋T淋巴细胞表面的nAChRα7表达增加,nAChRα7表达影响培养液IL-4、IFN-γ水平和Th1/Th2平衡,是影响哮喘的发病的重要因子。     

血管内皮生长因子在佐剂关节炎大鼠滑膜组织中的表达

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)在佐剂关节炎大鼠滑膜组织中的表达及其与关节病理积分关系。方法　通过右足垫皮内注射完全福氏佐剂建立关节炎大鼠模型 ,常规HE染色 ,计算关节病理积分 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测VEGFmRNA表达 ,免疫组织化学染色检测VEGF蛋白表达 ,观察VEGF蛋白表达与关节病理积分关系。结果　模型组组大鼠滑膜VEGFmRNA及蛋白表达在 3、8周及 2 0周时均明显高于对照组 (P均 <0 .0 1) ,而且与关节病理积分呈正相关 (r =0 .984 ,0 .96 ,0 .92 9　P均 <0 .0 1)。结论　VEGF在关节炎形成及发展过程中起重要作用 ,可直接影响滑膜新生血管形成     

条件免疫反应对小鼠支气管哮喘的作用机制研究

目的 探讨条件免疫反应对小鼠支气管哮喘的机制.方法 选4～6周龄的雌性BALB/C小鼠,用卵清蛋白(OVA)腹膜下注射致敏,OVA雾化吸入激发,建立支气管哮喘模型,健康对照组用磷酸盐缓冲溶液进行相同操作.将模型小鼠随机分为7组,每组15只:(1)条件免疫反应1组(CIRt)组,以声音为条件刺激,布地奈德加沙丁胺醇雾化吸人为非条件刺激,两者结合7次(7 d)后可建立条件免疫反应,此后每日再现条件刺激,每周条件刺激再与非条件刺激结合1次,共20周;(2)CIR2组,以糖精水为条件刺激,其余操作同CIR1组;(3)常规治疗组,给予布地奈德和沙丁胺醇雾化吸入治疗,1次/d,共20周;(4)常规治疗减量组,给予布地奈德和沙丁胺醇雾化吸入,1次/d,共7d,之后1次/周,共20周;(5)单纯声音刺激组,单纯给声音刺激20周;(6)单纯糖精水刺激组,单纯给糖精水刺激20周;(7)空白对照组,PBS雾化吸入20周.以上7组每天给予哮喘激发1次,各治疗组在治疗间隔1 h以后给予激发;(8)健康对照组,用PBS激发20周.治疗20周后,分离小鼠脾脏单个核细胞,加入CIM+磁珠,利用分选器、分离柱分选出CD4+T淋巴细胞,经PMA、离子霉素和莫能霉素刺激培养6 h后,流式细胞技术检测CD4+T细胞胞膜上烟碱型乙酰胆碱受体a7(nAChRa7)与胞浆内IL-4、IFN-γ及IL-17表达量,分析nAChRa7与IL-4、IFN-γ及IL-17的相关性.结果 (1)CIR1组(8.7 ±1.2)、CIR2组(9.1±1.0)、常规治疗组(8.4±1.1)及健康对照组(0.8±0.7)比空白对照组(16.2±1.3)肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞占白细胞的百分数均明显减少(P＜0.01),在CIR1组、CIR2组及常规治疗组之间差异无统计学意义(P＞0.05).(2)CIR1组、CIR2组、常规治疗组及健康对照组与空白对照组相比较,CD4+T淋巴细胞表达nAChRot7、IL-4及IL-17明显降低(P＜0.01),IFN-γ增高(P＜0.01);除nAChRa7外其他各因子在CIR1组、CIR2组及常规治疗组之间差异无统计学意义(P＞0.05).nAChRa7与IL-4表达呈正相关(r=0.76,P＜0.01),与IL-17呈正相关(r=0.46,P＜0.01),与IFN-γ表达呈负相关(r=0.69,P＜0.01).(3)常规治疗减量组、单纯声音刺激组、单纯糖精水刺激组及空白对照组与健康对照组相比,气道上皮增厚,管腔狭窄,管壁周围有大量炎症细胞浸润,胶原纤维显著增多;CIR1组、CIR2组及常规治疗组经治疗后气道上皮及炎性浸润情况明显改善,胶原纤维减少.结论 以声音或糖精水为条件刺激,以布地奈德加沙丁胺醇雾化吸入为非条件刺激建立起的条件免疫反应,可以通过下调CIN+T淋巴细胞上nChRa7的表达,调节CD4+T淋巴细胞的免疫功能.     

丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化的抑制作用

目的 探讨丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化的作用及可能机制.方法 雄性SD大鼠30只随机分为假手术组、模型组和丹参酮ⅡA组.假手术组仅找到输尿管,不行结扎术.模型组结扎大鼠左侧输尿管建立肾间质纤维化动物模型.丹参酮ⅡA组术前24 h经腹腔注射丹参酮ⅡA,剂量为1.5 mg/(kg*d),手术操作同模型组.术后第10天取梗阻侧肾组织行HE、Masson染色,观察其肾间质病理改变.免疫组织化学法检测其肾组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原的蛋白表达与定位.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测3者mRNA水平.结果 输尿管结扎术后第10天梗阻侧出现明显的肾间质纤维化,肾组织TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白及mRNA表达均显著增加(Pa<0.01).经丹参酮ⅡA治疗后,肾间质纤维化程度减轻,肾组织TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型胶原表达均下调(Pa<0.05).结论 丹参酮ⅡA对大鼠肾间质纤维化有明显的抑制作用,其机制可能与下调TGF-β1表达,抑制成纤维细胞增殖和表型转化,减少胶原沉积有关.     

Prohibitin基因转染对肾小管上皮细胞表型转化的影响

目的探讨转染外源性Prohibitin(PHB)基因对体外培养的肾小管上皮细胞株(NRK-52E)表型转化的影响。方法将构建的pcDNA3.1(+)-PHB1、pcDNA3.1(+)-PHB2质粒转染体外培养的NRK-52E细胞作为转染组,以空载体转染NRK-52E细胞为阴性对照组,以正常NRK-52E细胞为空白对照组,分别应用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染24 h、48 h、72 h各组NRK-52E细胞PHB1、PHB2及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达。结果 1.转染24 h、48 h、72 h时转染组NRK-52E细胞的PHB1、PHB2 mRNA及其蛋白表达均较阴性对照组和空白对照组增高(Pa<0.05),且48 h表达量最高,而阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。2.转染24 h、48 h、72 h时转染组NRK-52E细胞α-SMA mRNA和蛋白表达均较阴性对照组和空白对照组降低(Pa<0.05),48 h表达量最低,阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。3.转染组48 h NRK-52E细胞PHB1、PHB2蛋白表达量与α-SMA蛋白表达量均呈负相关(r=-0.942、-0.869,Pa<0.05)。结论转染外源性PHB基因可以抑制体外培养的NRK-52E细胞的表型转化。     

低浓度紫杉醇对大鼠肺动脉平滑肌细胞外胶原沉积的作用及其机制研究

目的 探讨低浓度紫杉醇（PTX）对转化生长因子β1（TGF-β1）促进大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）外胶原沉积的作用及其机制。方法 原代培养大鼠PASMCs并分为空白对照组、模型组和干预组（n=3）。空白对照组不做任何处理,模型组施加终浓度为10 ng/mL的TGF-β1,干预组在模型组基础上施加终浓度为100 nmol/L的PTX。MTT比色法检测细胞增殖能力;实时荧光定量PCR法检测Ⅰ型胶原（COLⅠ）、Ⅲ型胶原（COLⅢ） mRNA相对表达量;ELISA法检测COLⅠ、COLⅢ蛋白的OD值;Western blot法检测COLⅠ、COLⅢ蛋白,以及TGF-β1/Smad3信号通路关键蛋白Smad3、p-Smad3的相对表达水平。结果 与空白对照组比较,模型组细胞增殖能力、COLⅠ、COLⅢ mRNA及其蛋白、p-Smad3蛋白相对表达水平均明显增高（P < 0.05）;干预组上述指标较模型组均有所下降,但仍高于空白对照组（P < 0.05）;各组Smad3蛋白相对表达水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。结论 低浓度PTX对TGF-β1促进PASMCs外胶原合成具有明显抑制作用,该作用可能是通过调控Smad3蛋白的磷酸化来实现。     

早产儿视网膜病的危险因素分析及随访调查

研究早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)的发生率、高危因素、治疗与随访情况。方法对2005年7月-2007年12月温州医学院附属第一医院NICU收治的符合ROP筛查标准的早产儿,于生后2周开始由资深眼科医师开始行间接眼底镜检查眼底,并进行随访。结果434例早产儿中ROP的发生率为5.5%(24/434例),24例ROP中Ⅰ期19例,Ⅱ期3例,Ⅲ期2例。Ⅲ期阈值病变者行激光光凝治疗,全部患儿均恢复正常。对434例早产儿行单因素分析得出,胎龄、出生体重、住院时间、吸氧、吸氧浓度、吸氧时间、呼吸暂停、新生儿肺透明膜病(RDS)、肺表面活性剂(PS)的应用、机械通气、输血、光疗时间、感染与ROP的发生有相关性(P<0.05)。Logistic回归分析显示胎龄、出生体重、胎数、吸氧时间、光疗时间、代谢性酸中毒、母亲妊高症、颅内出血是影响ROP发生的主要因素。结论早产是ROP的根本原因,防治各种并发症、合理的氧疗是预防ROP的关键。建立完善有效的ROP筛查制度,早期发现、早期治疗ROP,可改善ROP的预后。     

Range of Motion of the Joints of the Lower Extremities of Newborns

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