核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

PDGFR-α在继发性骨髓纤维化骨髓组织中表达的研究

目的:探讨血小板衍化生长因子受体-ɑ(PDGFR-ɑ)在继发性骨髓纤维化骨髓组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组化染色法,检测继发性骨髓纤维化组、对照组骨髓组织中PDGFR-α的表达情况。结果:继发性骨髓纤维化组骨髓组织中PDGFR-α的表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PDGFR-α可能与继发性骨髓纤维化的发生、发展存在一定关联。     

KDR siRNA表达载体的构建和鉴定

目的: 构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2),又称激酶功能区受体(KDR)的pSilencerTM3.1 siRNA(small interfering RNA)表达载体,并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果. 方法: 设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamH Ⅰ, HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1-H1 neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定. 以脂质体法将pSilencerTM3.1-H1 neo空载体和3个(pSilencer3.1-KDR1, pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系. 72 h后用RT-PCR和Western blotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDR mRNA及蛋白水平的表达情况. 结果: 经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断. 转染KDR-siRNA的前列腺癌细胞,72 h后,而以pSilencer3.1-KDR3的抑制KDR mRNA及蛋白表达效果最为有效,其抑制率约为55%. 结论: 成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1-KDR1, pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3, pSilencer3.1-KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达,为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.     

整合素β1介导血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞与单核细胞间黏附作用

目的探讨血小板源生长因子（PDGF）对血管平滑肌细胞（VSMC）与人单核细胞系（THP-1）间黏附作用的影响以及可能的分子机制。方法培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞分别用2．5、5、10和20ng／mlPDGF刺激不同时间后,在无或含有整合素β1单克隆抗体培养液中,加入经PKI-126标记的THP-1细胞与VSMC共培养,测定黏附的THP-1细胞数量。采用Western免疫印迹法检测PDGF对VSMC表达整合素13。的影响。结果PDGF刺激SMC促进THP-1与VSMC的黏附的作用随着浓度的增加而增强,THP-1与血管平滑肌细胞黏附的数量是对照组的1．1、2．1、3．1和4．4倍;在10ng／mlPDGF刺激下,黏附的THP-1细胞数量是对照组的3．1倍（135±47个细胞／视野伽43±14个细胞／视野,P〈0．001）;整合素β1单克隆抗体能显著抑制PDGF刺激的THP．1细胞与VSMC的黏附作用,黏附的细胞数量（54±13个细胞／视野,P〈0．01）;PDGF促进THP-1与VSMC黏附的作用在PDGF刺激后8h达到高峰。免疫印迹显示PDGF能诱导VSMC表达整合素β1,在8h左右达高峰。结论血小板源生长因子能够呈剂量和时间依赖性地促进单核细胞与血管平滑肌细胞的黏附,该作用部分是通过整合素β1介导的,这一效应在动脉粥样硬化发病过程中可能具有重要意义。     

非限制性外支架对兔移植静脉血小板源性生长因子表达的影响

目的 探讨非限制性外支架防治移植静脉再狭窄的可能作用机制. 方法新西兰白兔随机分为支架组和对照组,每组18只.均实施颈外静脉-颈总动脉移植术,支架组在移植静脉外套以外支架(直径6 mm的人造涤纶血管),对照组无外支架.术后7、14、28 d每组各6只兔手术取出移植静脉,分别进行血小板源性生长因子B链(PDGF-B)免疫组织化学染色,计算PDGF-B阳性率;以RT-PCR方法检测PDGF-B mRNA的表达量. 结果支架组移植静脉内膜PDGF-B阳性率术后14、28 d均明显低于对照组(15.2%±3.6%vs 21.6%±4.6%,6.5%±2.6%vs 12.5%±4.4%,均P＜0.05);中膜阳性率术后7、14、28 d均明显低于对照组(13.8%±4.6%vs 25.4%±6.2%,21.3%±4.4%vs 35.7%±7.3%,7.2%±3.2%vs 19.2%±5.4%,均P＜0.01);外膜阳性率术后28 d达高峰,而对照组在术后14 d达高峰,28 d时支架组阳性率明显高于对照组.RT-PCR检测显示术后7、14、28 d 2组移植静脉均可见PDGF-B特异条带(457 bp),各时间点支架组PDGF-B mRNA的表达均明显低于对照组(31.2%±6.5%vs 45.4%±8.4%,P＜0.05;42.3%±6.2%vs 65.2%±11.5%,P＜0.01;21.3%±5.6%vs 36.2%±9.4%,P＜0.01). 结论抑制移植静脉PDGF合成、改变PDGF分布规律可能是非限制性外支架防治移植静脉再狭窄的作用机制之一.     

Inhibition effect of small interfering RNA of connective tissue growth factor on the expression of vascular endothelial growth factor and connective tissue growth factor in cultured human peritoneal mesothelial cells

Background The peritoneum response to peritoneal dialysis can lead to fibrosis. The transforming growth factor β1 （TGF-β1 ） plays a key role in regulating tissue repair and remodelling after injury. Connective tissue growth factor （CTGF）, a downstream mediator of TGF-β1 inducing fibrosis, has been implicated in peritoneal fibrosis. Vascular endothelial growth factor （VEGF） plays a key role in angiogenesis that can hasten peritoneal fibrosis. In this study, we investigated the effect of small interfering RNA （siRNA） of CTGF by pRETRO-SUPER （PRS） retrovirus vector on the expression of CTGF and VEGF in human peritoneal mesothelial cells. Methods Retrovirus producing CTGF siRNA were constructed from the inverted oligonucleotides and transferred into packaging cell line PT67 with lipofectamine, and the virus supernatant was used to infect human peritoneal mesothelial cell （HPMC）. The cells were divided into seven groups： low glucose DMEM, low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml, low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml ＋ PRS-CTGF-siRNA1-4 and low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml ＋ PRS. The expression of CTGF and VEGF were measured by semiquantitative RT-PCR and Western blot. Results Low levels of CTGF and VEGF were detected in confluent HPMCs. Following stimulation with TGF-β1 , the levels of CTGF and VEGF were significantly upregulated （P〈0.01）. Introduction of PRS-CTGF-siRNA1-4 resulted in the significant reduction of CTGF mRNA and protein, and VEGF mRNA （P〈0.01）, especially in groups PRS-CTGF-siRNA, and PRS-CTGF-siRNA4. The introduction of PRS void vector did not have these effects （P〉0.05）. Conclusions The expression of CTGF siRNA mediated by PRS retrovirus vector can effectively reduce the level of CTGF and VEGF induced by TGF-β1 in cultured HPMCs. This study may provide potential therapeutic strategies to prevent the peritoneal fibrosis.     

靶向结缔组织生长因子的siRNA对于肝星状细胞介导肝纤维化的研究进展

肝纤维化是多种慢性因素导致肝内细胞发生持续、反复的坏死或炎症刺激,机体发生的修复反应,以肝内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积和肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）活化为特征。它不是一个独立的疾病,而是许多慢性肝病的共同病理过程,持续进展可导致肝内正常组织结构改建形成肝硬化并出现多种危及生命的并发症,预后极差。由于体内存在纤维降解过程,故肝纤维化逆转可以避免病情进展至肝硬化。研究表明靶向结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）可能抑制HSC活化、增殖及ECM的合成,使肝纤维化进程受阻。siRNA介导的CTGF基因沉默为肝纤维化治疗开辟了新的途径。     

人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体的构建

目的 构建带信号肽和不带信号肽的人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因酵母表达载体,探讨该基因在酵母中的表达效率和活性。方法 利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人血管内皮细胞总RNA中扩增出PDGF-B的cDNA,克隆入pGEM-T载体,进行序列测定。进而克隆至酵母表达质粒pMETB和pMETαA并进行重组子双酶切鉴定。结果 扩增获得了含信号肽(578 bp)和不含信号肽(340 bp)的编码PDGF-B链基因;构建了PDGF-B的酵母表达载体pMETB-PDGFB₁,pMETαA-PDGFB₂。测序结果显示,重组载体中目的基因序列与GENE BANK公布的序列一致。结论 人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体构建成功,为进一步在酵母中的高效表达奠定基础。     

特异性针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒载体的构建

目的 以小鼠VEGFa基因为靶基因,构建携带短发夹状干扰RNA(siRNA)的慢病毒载体。方法 设计并合成三对包含靶序列和一对针对无关序列的互补寡核苷酸链,克隆到pRNAT-U6.2/Lenti质粒;从小鼠NIH/3T3细胞扩增、纯化VEGFa cDNA,构建pCDNA-VEGF质粒;实验分6组,pCDNA-VEGF质粒或/和siRNA慢病毒质粒共转染NIH/3T3细胞,筛选最有效siRNA慢病毒表达质粒;将筛选siRNA慢病毒表达质粒和pRNAT-Negative质粒与慢病毒包装质粒混合物混合,共转染293T细胞,48h后收集上清。结果成功构建针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒质粒和质粒pCDNA-VEGF;慢病毒质粒有效抑制pCDNA-VEGF质粒增加NIH/3T3细胞VEGFa表达水平,pRNAT-siRNA3抑制作用最明显,VEGFa mRNA和蛋白表达分别下降80.0%和66.3%;纯化慢病毒滴度均为1×108ifu/mL。结论 成功设计、筛选、生产针对小鼠VEGFa基因沉默的特异性siRNA慢病毒。     

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠Nogo受体(Nogo receptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率.方法: 应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48 h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值.其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果: 酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108 ifu/m1,适合感染的MOI值为3.结论: 应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件.     

发卡样CTGF特异性RNA干扰重组体的构建及筛选

目的：利用Pgenesil 1质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，并筛选有效的抑制序列。方法:分别设计3对有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子的质粒载体Pgenesil 1中，构建重组体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。将构建成功的4组重组体转染HSC T6 24?h后，通过半定量RT PCR分析HSC T6 CTGFmRNA的表达水平，与空白对照及仅加转染试剂组比较分析。结果:CTGF的shRNA片段被成功克隆到Pgenesil 1质粒载体中，经酶切与测序证实构建成功，转染HSC T6 24?h后，与空白对照组相比，通过半定量RT PCR分析发现有两组细胞CTGFmRNA水平明显下降，24?h抑制效率分别为(74±5)%,(P<0.01);(61±3)%,(P<0.05)。转染非特异shRNA组及仅加转染试剂组CTGFmRNA表达水平无明显变化。结论:成功构建了能表达CTGFshRNA的3组重组体，并筛选出能高效抑制CTGF表达的shRNA序列，为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了实验基础。