bcl-2转基因表达载体的构建对脑缺血再灌注损伤保护机制的意义

目的:构建人Bcl-2基因的转基因表达载体用于转基因动物模型的建立,以便深入探讨脑缺血再灌注损伤中的基因机制。方法:利用RT-PCR技术,用包含bcl-2cDNA的引物从慢性淋巴细胞白血病患者的血液扩增得到一约为708bp的DNA片段,克隆后测序和同源性分析。结果:经RT-PCR扩增获得的产物大小与预计的目的片段大小一致,目的基因测序与国外报道的参考序列相比,序列同源性为99%。结论:以pEGFP-C1载体作为真核表达载体,形成以绿色荧光蛋白作为报告基因的融合基因,可以用于转基因的研究。     

自噬相关基因Beclin-1的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆并构建自噬相关基因Beclin-1原核表达载体.方法 根据Beclin-1编码区DNA序列设计引物,用前列腺癌细胞LNCaP作为模板进行RT-PCR,扩增Beclin-1编码区全基因片段,与pQE-80质粒连接后进行测序鉴定.结果 RT-PCR扩增出Beclin-1目的基因,限制性内切酶证实其已插入表达质粒中,DNA测序证实Beclin-1编码区全基因片段与GenBank公布的相应基因核苷酸序列的同源性为完全一致.结论 成功克隆并构建了自噬相关基因Beclin-1原核表达载体,为研究Beclin-1蛋白的细胞自噬作用奠定了基础.     

凋亡抑制基因Survivin的表达在肿瘤预后评估中的作用

目的：克隆、表达SW基因，并探讨其在肿瘤预后中的作用。方法：从人白血病细胞系HL60提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出SW基因片段。将SVV基因片段插入载体pGEM-T Easy中，经全自动序列分析仪测序正确后用NdeⅠ／XhoⅠ双酶切，亚克隆到原核表达载体pRSET-C中，构建重组表达载体pRSET-c-SW，并转化大肠杆菌BL2l菌株。取工程菌，经IPTG诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE鉴定并初步纯化。结果：经RT-PCR，测序和酶切鉴定，成功地克隆了人SW基因；经IPTG诱导的重组质粒pRSET-C-SW表达出相对分子质量约为16500u的蛋白，与预期的结果相符。结论：成功克隆了人肿瘤细胞的抗凋亡基因SW，并在大肠杆菌BL2l中表达出SW蛋白。该基因的高效表达为进一步探讨以SVV为基础的肿瘤的防治及预后判断提供工具。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的 构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3，制备肿瘤DNA疫苗，为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法 从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA，进行RT-PCR扩增出全长cDNA，并克隆入PUCl9载体，经DNA测序证实序列无误后，将MAGE-3基因克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体。结果 经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段，成功克隆人PUCl9载体，经DNA测序证实为MAGE-3，编码MAGE-3基因全部947bp序列，读框正确，进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3．1／MAGE-3。结论 成功构建了MAGE-3真核表达质粒，为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础，对提供有效治疗方案，提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体。方法以 A549的 mRNA 为模板,应用所设计的引物通过 RT-PCR 法扩增 CDCP1胞外段基因;将 PCR 产物与 pGEX-KG 载体连接,获得重组质粒 pGEX-KG/CDCP1;经双酶切、PCR 及 DNA 序列测定进行鉴定;IPTG 诱导表达。结果①RT-PCR 扩增得到约270 bp 大小的 CDCP1胞外段基因目的片段;②目的片段正确插入到 pGEX-KG 中;③经 IPTG 诱导表达,可见在相对分子质量约35kD 处出现明显的诱导蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中获得大量表达。     

联合应用自杀基因和细胞因子基因对人喉癌抑制作用的实验研究

背景：目前喉癌的治疗方法对于晚期复发和远隔转移病例难以获得满意效果，自杀基因联合免疫基因疗法可能能够长期提高肿瘤患者的生存率及生活质量。目的：构建含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)、重组人白介素2(rhlL-2)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)(rhTNF-a)不同组合融合基因的反转录病毒表达载体，寻找一个更有利于患者生存期内不易复发、根治效果良好、有利于社会、心理、生活质量基因治疗的理论基础。设计：前瞻性实验研究。地点和对象：实验在第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所完成，对象为HSV-tk、白介素2(lL-2)、TNF-a融合基因。干预：以RT-PCR制备人IL-2 cDNA，分别以PCR方法扩增3目的基因，扩增产物纯化、测序后以定向克隆方法依次将各片段正向插入至pLXSN表达载体的多克隆位点间，以构建含不同融合基因的真核表达载体。主要观察指标：各目的基因PCR扩增结果，目的载体的酶切鉴定，PCR鉴定目的载体。结果：pL(TIT)SN经EcoRI，BamHI双酶切得到大小约2．07kb融合基因片段，pL(TI)SN经EcoRI，XhoI酶切得到大小约l.58kb融合基因片段，pL(TT)SN经EcoRI，BamHI双酶切得到大小约l.59kb融合基因片段，pL(TK)SN经EcoRI，BamHI双酶切得到大小约l.13kb片段。经限制性酶切分析及PCR方法鉴定，各插入基因及融合基因大小、位置、方向均正确无误。结论：自杀基因联合免疫基因疗法是肿瘤基因治疗中较放、化疗更有利于患者生活质量的疗法，本研究也为基因治疗肿瘤提供理论基础。     

难愈性创面修复局部人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建与评价

目的：克隆人血管内皮生长因子165cDNA并构建其真核表达载体，为放创复合伤的难愈性创面的促愈修复提供实验基础。方法：实验于2001-09／2003-05在第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。从白血病HL-60细胞提取总RNA，经过反转录-聚合酶链反应扩增编码人血管内皮生长因子165的cDNA序列，将其克隆至pMD18-T载体后进行测序鉴定，然后将该序列插入双顺反子的真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。观察以下指标①反转录-聚合酶链反应扩增人血管内皮生长因子165 cDNA。②阳性重组质粒pMD18-T-hVEGF165的筛选。③DNA测序鉴定。④阳性重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165的筛选。结果：反转录-聚合酶链反应扩增得到约600bp的目的DNA片段，酶切pMD18-T-hVEGF-65得一与目的片段大小一致的条带，且测序分析其与GeneBank中报道的编码人血管内皮生长因子165cDNA序列完全一致。pIRES2-EGFP-hVEGF165的酶切电泳显示目的条带成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中。结论：成功构建了含有人血管内皮生长因子165cDNA的真核表达载体，如果通过转基因技术可提高血管内皮生长因子165在放创复合伤难愈性创面的局部的表达，有望为修复难愈创面开辟一条新的途径。     

EB病毒BMRF1基因原核表达载体的构建

目的克隆EB病毒早期蛋白P54的编码基因BMRF1，构建原核表达载体，为相应蛋白的表达和应用奠定基础。方法以含EB病毒的B95-8细胞培养上清为模板，PER扩增出BMRF1基因。PER产物经BamH I和Xho I双酶切后克隆至原核表达载体pGEX-5T，用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PER扩增的特异性片段长度为1233bp，以此构建的重组质粒pGEX-5T-BMRF1双酶切的片段大小与预期符合，重组克隆外源基因的测序结果与GenBank中的EB病毒BMRF1基因eDNA序列一致。结论成功构建了pGEX-5T-BMRF1原核表达载体。     

体外促进血管内皮细胞分化的实验观察：人血管生成素相关蛋白2全长编码基因的克隆

目的：克隆人血管生成素相关蛋白2(angiopoietin-related protein2．ARP2)全长编码基因，使其以体外方式促进血管内皮细胞分化，拟构建PET32a载体。方法：采用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人脾脏组织中扩增ARP2cDNA，构建PET32a载体，采用EcoRⅠ，HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定。结果：RT-PCR扩增长度为1492bp的基因片段。EcoRⅠ，HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段，测序结果显示编码区无基因突变。结论：顺利构建PET32a载体，人ARF2全长cDNA基因克隆成功。ARP2有非常明显的促进血管内皮细胞生长的作用，可能对缺血性心脏病的促血管形成治疗有较大帮助。     

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的：克隆表达SARS-CoVS蛋白，构建SARS全长基因疫苗。方法：从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1和S2蛋白的编码序列，再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western检测S蛋白的表达。结果：PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段，两片段插入pVAX1构建重组表达载体后，经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoVs蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

糖尿病视网膜病变的二级康复干预：人血管生成素1的克隆和分析

目的：从人的胎盘中克隆血管生成素(angiopoietin-1，Ang-1)基因，并分析其结构特征。方法：提取人胎盘组织总RNA，用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出Ang-1基因片段，并将其克隆到PGEM-T Easy载体中进行序列分析。结果：获得高质量的胎盘组织总RNA。RT-PCR扩增出1．5kb的cDNA片段，成功构建了PGEM-T／Ang-1载体，Blast序列分析与GenBank中AY121504一致。结论：从人的胎盘中克隆Ang-1基因无突变，满足为进一步研构建pPIC9K／Ang-1毕氏酵母表达载体和表达蛋白质的需要。     

重组人载脂蛋白A5原核表达载体的构建及分析鉴定

目的构建重组人载脂蛋白A5(apoA5)原核表达载体,为进一步制备抗apoA5的单/多克隆抗体奠定基础。方法从人肝癌组织中抽提总RNA,以此为模板,逆转录降度PCR扩增载脂蛋白A5编码区基因全长,构建含有目的片段的克隆载体pPCR-ScriptampSK(+)-apoA5及原核表达载体pET16B-apoA5,通过酶切、测序及诱导表达等验证重组质粒的准确性。结果PCR扩增出1.1kb特异性片段,克隆至pPCR-ScriptampSK(+)后测序,结果表明序列同源性与genebank报道一致,重组质粒pET16B-apoA5经双酶切后电泳显示约为5.7kb和1.1kb的片段,酶切图谱与预期一致,诱导表达蛋白的大小与预期一致。结论成功构建了重组人载脂蛋白A5的原核表达载体。     

dystrophin基因常见易缺失外显子片段的克隆和鉴定

背景:dystrophin基因是人类常见的X染色体连锁隐性遗传的神经肌肉系统疾病,dystrophin基因缺失集中在两个热点区域即外显子2～20和44～53,其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现.然而对dystrophin基因缺失的18个常见易缺失外显子片段的系统检测却鲜有报道.目的:拟对dystrophin基因18个常见易缺失外显子片段进行克隆、鉴定.方法:以人类基因组DNA为模板,应用18对引物对dystrophin基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增.将扩增产物与pGEM-TEasy载体连接,转化E.coli JM109感受态细胞.通过平板培养,挑选阳性克隆.提取重组质粒,Notl酶切,获得完整的探针片段,并作测序鉴定.通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性.结果与结论:PCR扩增出18个片段,与dystrophin基因预期扩增片段大小相一致.重组克隆质粒的酶切产物与PCR产物大小相近,与预期相一致.经测序获得18个克隆片段全序列,其核苷酸数量与预期基本一致,序列相似性检索分析证实了这些克隆片段与GeneBank收录的dystrophin基因片段具有极高的同源性.克隆产物确为dystrophin基因常见易缺失外显子片段.     

小鼠Wnt-3a基因真核表达载体的构建及其在cos-7细胞中的表达

目的：克隆小鼠胚脑中Wnt-3a基因片段，构建pSecTag2／Hygrn B—Wnt3a真核表达载体，观察其在cos-7细胞中的表达，为基因治疗脊髓损伤提供实验依据。方法：实验于2004-09／2005-03在安徽医科大学分子生物学实验室完成。选取清洁级孕13．5d的KM小鼠1只，脱颈处死，冰冷条件下迅速取出胚鼠，解剖显微镜下剥离胚脑，在无RNA酶污染的条件下迅速提取胚脑总RNA。利用反转录聚合酶链方法扩增小鼠胚脑Wnt-3a基因片段，将该基因片段克隆入T载体，聚合酶链反应法筛选并测序，双酶切后构建重组真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a。转染并筛选稳定表达的COS-7细胞，Western blot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达。结果：①反转录聚合酶链反应获得目的基因小鼠Wnt-3a cDNA：自胚鼠脑组织总RNA经反转录聚合酶链反应扩增后，凝胶电泳可见约1．1kh的特异性扩增片段，与预期获得产物大小相符。②pMD18-T／Wnt3a克隆质粒聚合酶链反应初步筛选与测序：测序报告所克隆的Wnt-3a为1058bp．通过Blast同源性分析，与GeneBank收录的序列一致，克隆小鼠Wnt-3a基因获得成功。③真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a的双酶切及测序：随机挑选10个克隆，聚合酶链反应扩增筛选出阳性克隆5个。经XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功。④Western Blot鉴定重组小鼠Wnt-3a蛋白在cos-7细胞中的表达：脂质体转染cos-7后48h，Western Blot鉴定出在细胞内存在Wnt-3a蛋白的表达，转染pSecTag2／Hygro B—Wnt3a的COS-7细胞裂解液在45KD处出现阳性条带，而培养上清中未能检测到蛋白的表达。结论：小鼠胚脑Wnt-3a基因的真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a构建成功，转染COS-7细胞后能够表达重组Wnt-3a蛋白。     

hVPS4A 基因克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆人细胞空泡蛋白分选因子4A（human vacuolar protein sorting 4A,hVPS4A）基因,构建其真核表达质粒。方法以 Huh7细胞 cDNA 为模板,设计引物扩增全长 hVPS4A 基因,再将目的基因插入到真核载体 pRK5中。重组质粒经PCR、酶切和 DNA 测序确认。结果从 Huh7细胞 cDNA 中扩增得到约1350 bp 大小的目的片段,经回收、纯化、酶切后与载体pRK5连接,转化 DH5α大肠杆菌。选择 PCR 鉴定阳性的重组质粒,经 EcoRⅠ单酶切可见约一条5900 bp 片段;经 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切可得到4600 bp 和1350 bp 两个片段,分别与载体 pRK5和目的片段 hVPS4A 预期大小一致;DNA 测序结果显示插入片段与 hVPS4A 参考序列一致。结论成功构建了含 hVPS4A 基因的真核表达载体,为进一步研究 hVPS4A 的生物学功能提供了条件。     

小鼠甲状腺转录因子-2转基因动物表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建小鼠甲状腺转录因子-2（TTF2）转基因动物表达载体（pBROAD3-TTF2）,观察其在小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）中的表达。方法从C57BL／6J小鼠肝脏组织中提取基因组DNA,利用聚合酶链式反应方法扩增出nF2基因1113bD开放阅读框,通过DNA重组技术将丌R2基因片段插入克隆载体pMDl8．T中,经测序正确后,再重组于pBROAD3．mcs中,构建转基因动物表达载体pBROAD3-TTF2,用酶切电泳分析对其进行鉴定。运用脂质体转染试剂将其转染BMSC后,蛋白质印迹法检测717F2基因的表达。结果①DNA测序证实目的基因序列正确无突变,酶切电泳分析得到相应的目的片段,大小与理论计算值一致,成功构建转基因动物表达载体pBROAD3-TTF-2。②蛋白质印迹法显示转染的BMSC高表达TTF-2蛋白。结论成功构建了pBROAD3-TTF2转基因动物表达载体,显示其转染BMSC后丌F2基因的表达,为下一步建立刀F2转基因小鼠模型奠定了基础。     

VIM-2型金属β内酰胺酶的序列分析、原核表达及纯化

目的对铜绿假单胞菌所产blaVIM-2进行基因重组表达及纯化。方法以产blaVIM-2铜绿假单胞菌总基因组DNA为模板，PCR扩增blaVIM-2，将其克隆入pUCm-T载体后测定该核苷酸序列，再将blaVIM-2克隆入表达载体pET-41b（＋），然后在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，表达产物再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为801bp的基因片段，与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100％。此基因能在大肠埃希菌中大量表达，蛋白分子质量大约为56000u。结论对VIM-2金属酶的成功表达及纯化为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定了基础。     

人KiSS-1基因克隆及其慢病毒载体的构建

背景：慢性病毒载体技术是目前转基因中最有效和最成功的方法，技术操作简便。目的：克隆转移抑制基因KiSS-1基因不含信号肽的表达序列，构建人KiSS-1基因的慢病毒表达载体。设计、时间及地点：开放性实验于200609／2007-12在福建师范大学发育学院实验室完成。材料：载体pNL-IRES2-EGFP由福建师范大学发育学院实验室保存。方法：从人正常胎盘组织中提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列，行将其克隆到慢病毒载体pNL-IRES2-EGFP中，构建其表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1。主要观察指标：KiSS-1目的基国片段的克隆，重组表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1的酶切鉴定及测序。结果：经酶切鉴定和基因序列测定，证实重组入载体pNL—IRES2-EGFP的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。结论：成功构建了重组质粒pNL-IRES2-EGFP-KISS-1。     

心肌损伤修复实验指标：MyoD基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：MyoD基因是肌肉转录因子家族成员之一，转染MyoD基因可以启动肌分化过程，使非肌细胞转变为肌细胞。MyoD基因仅在骨骼肌表达，基于心肌细胞和骨骼肌细胞有相同的收缩装置，可以设想将外源MyoD基因诱导坏死心肌局部的成纤维细胞向具收缩功能的骨骼肌细胞转化，可能会成为临床治疗心衰的又一种方法。目的：构建和鉴定MyoD基因重组腺病毒载体，为研究MyoD对心肌损伤的修复作用提供试验基础。设计：单一样本实验。单位：南京医科大学第一附属医院心脏科。材料：实验于2004-09／2005-09在南京医科大学微生物学与免疫学实验室完成。以MyoD基因和非复制型腺病毒表达载体为研究对象。方法：从pEMSV—MyoD质粒上用聚合酶链反应法扩增出MyoD cDNA片段，再通过聚合酶链反应使MyoD基因加上CACC序列接头，经过定向拓扑克隆使目的基因连接到转移载体上，再通过LR酶促反应，将目的基因转移到腺病毒表达载体DNA上，获得MyoD基因重组的腺病毒DNA，用脂质体转染法转染HEK293A细胞，包装扩增出MyoD基因重组的腺病毒。主要观察指标：聚合酶链反应鉴定和DNA测序来证实MyoD cDNA片段大小和序列的正确性，并测定病毒滴度。结果：经聚合酶链反应鉴定和DNA测序证实MyoD基因重组腺病毒含大小正确的目的片段，其DNA序列正确。病毒滴度为1．3&;#215;10^11pfu／mL。结论：成功构建了MyoD基因重组腺病毒载体。