广西莪术EST-SSR标记开发

目的利用NCBI公布的姜黄EST序列,挖掘SSR位点,开发近缘种广西莪术EST-SSR标记。方法下载NCBI公布的姜黄EST序列,利用SSR-FINDER搜索SSR位点,采用Primer5.0设计SSR引物,挑选30个表现型差异较大的广西莪术进行有效性及多态性检测。结果 12 678条EST序列含有SSR位点1 243个,其中二核苷酸、三核苷酸重复序列最多,分别占50.36%,31.54%,以AT/TA和CT/GA出现频率最高。利用Primer5.0设计引物共325对,PCR检测表明,104对引物可以扩增出稳定清晰的带型;在至少30份不同种质广西莪术中检测到48对SSR引物具有多态性,占设计引物的38.09%。结论姜黄EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR标记开发效率较高。     

丹参新的EST-SSR分布规律及分子标记的建立

目的:建立新近较高覆盖度丹参KST-SSR分子标记,为不同产地来源丹参居群的遗传变异分析奠定基础.方法:对截止2010年11月Genbank下载的丹参EST序列结合HMPL实验室获取的共计1 408条EST序列,进行处理,获取高质量EST序列;经SSRIT软件搜索、分析EST序列中SSR位点的分布规律及类型;在此基础上,运用Websat软件设计EST-SSR引物,经对不同产地丹参样本DNA模板的PCR筛选和条件优化,建立最新EST-SSR分子标记.结果:丹参的EST-SSR种类丰富、覆盖度较大,平均每5.8 kb就检出1条SSR.各种类型出现的频率相差很大,主要重复类型为二核苷酸、三核苷酸重复,分别占SSR总数的63.0%,35.5%,其次为四核苷酸和五核苷酸重复.在重复基元类型中,二核苷酸重复以CT/AG为主,三核苷酸重复以GAA/TCC为主.所优选的36对引物中有29对引物有扩增产物,有效率达80.5%,所选引物对不同产地丹参居群的分子标记出现了多态性.结论:建立的丹参最新EST-SSR分子标记具有较高的覆盖度和多态性,可用于不同产地丹参居群的遗传变异分析.     

虫草属EST-SSR标记系统的建立研究

目的:通过球孢虫草、蛹虫草EST设计EST-SSR引物,建立虫草属EST-SSR标记系统.方法:从NCBI公共数据库下载获得虫草EST,利用Sequece Seiners 1.2软件去除冗余序列并设计引物,进行PAGE电泳.结果:通过去除EST总序列中低质量的和冗余的序列后,得到全长为2 953 173 bp的4 556条无冗余球孢虫草EST.从中发掘出718个EST-SSR,分布于616条EST中,出现频率是15.8％.平均分布频率是每4 096 bp出现1个,三核苷酸重复序列有419个,是出现最多的重复类型.蛹虫草EST去冗余后得到1 363条无冗余EST,共含有1 117个EST-SSR,出现频率为81.95％,出现最多的重复类型是A核苷酸重复.根据球孢虫草EST-SSR序列,设计合成50对引物,有扩增产物的引物为34对,占总设计引物数的68％.根据蛹虫草EST-SSR,设计合成40对引物,有扩增产物的引物为39对,占总设计引物数的97.5％.基于SSR标记进行聚类分析,7种虫草无性型均能分开,且分为4支.结论:虫草属EST-SSR出现频率较高、类型较丰富、多态性潜能较高,具有较高的利用价值.球孢虫草和蛹虫草EST开发的SSR标记在虫草属有较好的转移性与通用性,可以很好的应用于虫草种间遗传关系的研究.应用虫草物种EST建立分子标记是一条简便而又有效的途径.     

乌拉尔甘草EST资源的SSR信息分析

目的:为了在乌拉尔甘草中开发功能性EST-SSR分子标记,分析乌拉尔甘草EST-SSRs特征。方法:从NCBI公共数据库中下载乌拉尔甘草EST序列,运用DNAstar软件中的Seqman Pro程序,对下载序列进行拼接和聚类,去除冗余序列,利用SSRIT软件筛选重复序列长度≥20 bp的二、三、四、五核苷酸4种类型的SSR,统计分析乌拉尔甘草EST-SSR的特征。结果:从NCBI公共数据库中下载50666条乌拉尔甘草EST序列,剔除冗余序列,得到全长为9.28×106bp的无冗余EST序列11100条。在这些序列中搜索出752条EST序列含有963个SSR,占无冗余EST序列的8.68%,平均每9.64 kb EST出现1个SSR位点。二核苷酸重复基元SSR出现频率最高(43.41%),其次是三核苷酸(41.95%),AG/TC、GA/CT和CTT/GAA是二、三核苷酸中的优势重复基元。乌拉尔甘草EST-SSR以4～10次重复为主,基序长度主要集中于20～30bp。结论:乌拉尔甘草EST-SSR的出现频率高,重复类型丰富,理论上表明这些EST-SSR具有较高的可用性。本文通过对乌拉尔甘草EST资源的SSR信息的研究,为分子水平和生物信息学角度上开发乌拉尔甘草的SSR功能性标记提供了候选序列。     

马蹄香表达序列标签资源的SSR信息分析

目的分析马蹄香EST资源的SSR信息,为开发EST-SSR标记奠定基础。方法从GenBank中获得马蹄香EST序列,用Sequencher4.8软件进行序列拼接得到Uni-EST序列,用SciRoKo3.4软件对Uni-EST序列进行SSR扫描,分析EST-SSR的分布频率和重复基元的类型特征。结果共获得10274条马蹄香EST序列,通过预处理共得到全长为5.11×106bp的无冗余Uni-EST6643条。在这些序列中共搜索出1408个SSR位点,分布在1232条Uni-EST序列中,发生频率为18.55%,EST-SSR的平均长度为22.30bp,平均每3.63kb含1个SSR位点。单核苷酸重复在马蹄香EST-SSR中占主导地位,发生频率为12.24%,其次为二核苷酸重复,发生频率为5.01%。在所有重复基元中,A/T基元出现频率最高,其次为AG/CT。结论马蹄香EST中SSR出现的频率较高,并且类型较为丰富。     

黄花蒿EST资源的SSR信息分析及标记开发

目的:研究黄花蒿Artemisia annua EST-SSRs的分布频率及核苷酸重复特征,开发微卫星(microsatellites)标记,为黄花蒿种质资源利用提供理论依据与技术支持。方法:NCBI下载黄花蒿94 923条EST序列经组装后去除冗余,MISA获得EST-SSRs序列,分析EST-SSRs组成特点和分布规律。Pfam2go注释黄花蒿SSR-ESTs数据集,GOSlim程序对注释结果进行分类。Primer3程序设计18对SSR引物扩增黄花蒿基因组DNA,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性。结果:黄花蒿拼接组装后获得24 601条序列,含2 110个SSR,出现频率为8.6%,其中二、三核苷酸重复分别占28%,50.4%,三核苷酸重复中ACC/GGT为主要类型,占9.8%。312条黄花蒿SSR-ESTs序列被功能注释。15对引物建立了合适的PCR反应体系,在36个黄花蒿样品中扩增呈现良好多态性。结论:黄花蒿EST-SSR基元类型丰富,在检测的18对引物中有效扩增和多态性均较高,根据EST资源规模开发SSR标记是可行的,为进一步开展黄花蒿种质资源的研究奠定了基础。     

丹参EST序列中SSR信息的分析及分子标记的建立

本文对从NCBI下载的鼠尾草属11747条EST序列（其中,丹参10228条）进行分析,搜索到含SSR的序列1911条,共含有SSR 2156个,出现频率为18.35%。在丹参EST-SSR中,核苷酸重复基元种类共77种。单核苷酸重复最多,出现频率为10.45%,二、三核苷酸的出现频率为3.72%、4.40%。三核苷酸重复中ACG/CTG为主要类型,占27.3%。共设计引物143对,合成13对（其中,丹参6对,Salvia fruticosa7对）,在对引物、dNTP、MgCl2进行测试后,建立了合适的PCR反应体系。引物筛选发现7对引物（丹参6对,S.fruticosa 1对）对丹参基因组DNA均有良好的扩增,并对11个不同产地丹参样品进行扩增均呈现良好的多态性。本研究结果证明根据丹参EST资源建立丹参EST-SSR标记是可行的。     

栀子全基因组SSR标记开发及遗传多样性分析

目的 揭示栀子基因组的SSR分布规律,开发SSR标记引物,探究不同栀子居群间的遗传差异。方法 利用MISA软件对栀子全基因组序列进行SSR位点搜索分析,Primer 3.0软件设计SSR引物,然后对引物进行有效性和多态性检测,并利用筛选到的多态性引物对6个居群的57份栀子材料开展遗传多样性分析。结果 栀子基因组共鉴定到232 880个SSR位点,每2.3 kb有1个SSR位点,其中83.02%的SSR位点分布于基因间区域,外显子区域SSR位点最少,单核苷酸为栀子的优势重复基序,占总SSR的64.60%。从设计的SSR引物中挑选80对进行PCR扩增,85%的引物能够扩增成功。利用筛选出的9对高多态性SSR引物,对6个栀子居群进行遗传多样性分析,共检测到64条扩增条带,其中多态性条带62条,居群总遗传多样性(Ht)为0.246,居群内遗传多样性(Hs)为0.210,Nei’s基因分化系数(Gst)为0.146,基因流(Nm)为2.923。聚类分析结果显示,地理位置相邻的重庆、贵州、四川居群聚为一类,福建、浙江、江西居群聚为另一类。结论 基于全基因组序列开发栀子SSR标记是一种高效的途径,可...     

轮叶党参EST-SSR标记的开发及在党参属中的应用

目的开发EST-SSR标记,分析其在党参属及近缘属种间的通用性。方法利用MISA软件对轮叶党参在NCBI公布的EST序列进行SSR位点查找,Primer 3.0软件设计引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,聚丙烯酰胺凝胶电泳对所筛选的引物进行多态性检测。结果共查找到204个EST-SSR位点,总长5 263 bp,平均长度25.80 bp,出现频率为22.97%,其中单核苷酸、二核苷酸和六核苷酸重复占比最多,分别为36.8%、24.8%和15.3%。单核苷酸、二核苷酸、六核苷酸中的主要重复基元类型是A、TG和CAGCTC/GTGGCA。共设计引物112对,以党参为模板,能够扩增出清晰稳定条带的引物有67对,有效引物比率59.82%,其中27对能扩增出多态性条带,多态引物比率24.11%。随机选取5对引物对党参属及桔梗共12份材料进行PCR扩增,聚类结果将党参属和桔梗属分为2大类。结论研究筛选出的EST-SSR标记能够在党参属及近缘属内进行区分鉴别,研究结果为党参种质鉴别、遗传多样性分析及资源的评价利用等提供了重要技术手段。     

党参转录组中SSR位点信息分析

目的采用生物信息学方法分析党参转录组文库EST序列简单重复序列(SSR)位点,快速、大规模鉴定党参功能性SSR。方法使用MicroSAtellite(MISA)软件分析党参高通量转录组SSR的分布频率和重复基元的类型特征,利用软件Primer3设计引物,并通过SSRFinder校验SSR,筛选SSR引物。结果从45 511条Unigenes中共搜到7 327个SSR位点,分布在6 017条Unigenes序列中,发生频率为12.22%,共有415种重复基元,平均每4 520 bp含1个SSR位点,二核苷酸重复占主要地位,发生频率为58.67%,在所有重复基元中,AG/CT出现频率最高。共获得4 329条SSR引物。结论大规模的SSR分子标记开发将有助于党参遗传多样性与分子育种研究。     

广西地不容SSR标记开发及遗传多样性研究

目的基于广西地不容转录组序列开发SSR引物,并用于该物种自然居群遗传多样性的研究。方法从广西地不容转录组测序获得的unigene序列中挖掘SSR位点,采用Oligo 7.0软件设计引物,通过电泳法筛选得到多态性高的SSR引物用于遗传多样性研究。结果从广西地不容转录组20 637条unigene序列中,搜索到6 833个SSR位点,出现频率为33.11%。基于转录组序列设计50对引物,筛选得到10对多态性高的引物。10对引物在5个居群63个样本中共扩增得到83个条带,有效条带百分率为100%,多态性信息量(PIC)为0.6889。在物种水平和居群水平上,Nei基因多样性指数(H)分别为0.725 2和0.613 4,Shannon多样性指数(I)分别为1.576 6和1.220 3,观察杂合度(Ho)分别为0.584 5和0.558 4,期望杂合度(He)分别为0.731 2和0.643 5。居群的遗传分化系数(Fst)为0.146 5,基因流(Nm)为1.456 9。UPGMA聚类分析表明,5个居群可分为3支系。结论开发的SSR标记适用于广西地不容的遗传多样性分析。广西地不容在物种和居群水平上均具较高的遗传多样性,遗传分化主要存在于居群内部。     

卷丹及主要食用百合EST-SSR鉴别体系的构建

目的开发卷丹Lilium lancifolium、兰州百合L. davidii var. willmottia、岷江百合L. regale、香水百合L. casa和龙牙百合L. brownie var. viridulum的EST-SSR分子鉴别体系,分析EST-SSR分子标记技术对百合近缘种的开发效率和鉴别能力。方法利用MISA.pl程序对NCBI公布的百合属EST基因序列进行SSR位点的识别,通过Primer3程序模块批量生成EST-SSR引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初筛,用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证初筛引物,标记并分析不同种质的特征泳带,构建鉴别体系。结果共设计了199对SSR引物,经过26对引物的筛选,获得了2对高效鉴别引物,其中引物JZ391构建的分子鉴别体系,可有效鉴别混掺的商品百合,具有一定的实用价值。结论基于研究材料具有极端的遗传特征,本实验鉴定标记开发非常高效,研究结果证实了物种的遗传基础是影响其EST-SSR分子标记开发效率的重要因素,同时,该案例可为其他类似百合遗传基础的中药材进行EST-SSR标记开发,提供参考尺度。     

多花黄精转录组SSR位点分析及分子标记开发

目的基于转录组测序数据鉴别和分析多花黄精EST-SSR位点,开发可用于多花黄精种质资源评价与利用的SSR标记。方法利用MISA工具从多花黄精转录组126 544条Unigenes中鉴定SSR位点并进行分析;利用Primer 3.0设计SSR引物,随机选择50对SSR引物进行有效性验证。结果从9 982条Unigenes中鉴定出12 317个包含2～6个核苷酸重复类型的SSR位点,SSR的分布频率为9.73%,发生频率为1/5.91 kb;SSR位点中的主导类型是二核苷酸重复,占总SSR的53.14%,其次是三核苷酸重复,占33.31%。SSR引物的有效性筛选显示,50个SSR引物对中有29个(58%)可从多花黄精中扩增出预期大小的SSR条带。SSR荧光标记的毛细管电泳检测显示在多花黄精的7个SSR位点共鉴定出了9种基因型,进一步验证了SSR引物的有效性。结论多花黄精转录组SSR位点出现频率高,重复类型丰富,多态性较高,这将为多花黄精遗传多样性分析和遗传图谱构建提供大量有价值的候选标记,也可为黄精属内种间物种的分子鉴别、多花黄精优良品种的分子辅助育种提供技术手段。     

鱼腥草转录组SSR位点信息分析及其多态性研究

目的分析鱼腥草Houttuynia cordata转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为鱼腥草分子标记辅助育种提供有力工具。方法利用MISA工具筛选了鱼腥草转录组测序获得的63 954条unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer 3设计SSR引物,并随机选择50对SSR引物对16株不同来源的鱼腥草进行多态性扩增分析。结果在鱼腥草的转录组中,共搜索到4 800个SSRs,分布于4 413条unigenes,SSR位点出现频率为7.51%。SSRs位点中三核苷酸重复是主要类型,占总SSRs的41.54%;其次是单核苷酸重复基序(占27.35%)。SSRs所包含的重复基元中,单核苷酸重复基元A/T是优势重复基元类型,占总SSRs的27.0%。利用Primer3共设计出3 068对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中43对(86.0%)扩增出清晰、可重复的条带,且表现出多态性。利用UPGMA作图,将16个样品分为2类。结论鱼腥草转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建奠定基础。     

野三七转录组中SSR位点信息分析及其多态性研究

目的 分析野三七Panax vietnamensis var. fuscidiscus（PVF）转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列（SSR）引物,以期为野三七分子标记辅助育种提供有力工具。方法 利用MISA工具筛选了野三七转录组测序获得的126 758条unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer3设计SSR引物,并随机选择30对SSR引物对13株不同来源的野三七进行多态性扩增分析。结果 在野三七的转录组中,共搜索到21 320个SSRs,分布于17 780条unigenes,SSR位点出现频率为16.82%。SSRs位点中二核苷酸重复是主要类型,占总SSRs的52.52%;其次是三核苷酸重复基序（28.08%）。SSRs所包含的重复基元中,二核苷酸重复基元AG/CT和AT/AT是优势重复基元类型,占总SSRs的46.25%。利用Primer3共设计出39 336对SSR引物。随机选择30对引物进行PCR扩增,其中29对（96.67%）扩增出清晰、可重复的条带,15对（50.00%）扩增条带表现出多态性。利用UPGMA作图,将13个材料分为2类。结论 野三七转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

款冬转录组SSR标记开发及其多态性研究

目的分析款冬转录组数据的简单重复序列标记(SSR)位点信息并设计特异引物,以期为款冬分子标记辅助育种提供有力工具。方法对款冬转录组测序数据库中长度1 kb以上的18 938条unigene,利用MISA软件搜索SSR位点信息,利用Primer3设计引物,并随机选择55对SSR引物分析18份不同来源款冬材料的多态性。结果共搜索到4688个SSR位点,分布于3844条unigene中,SSR出现频率为24.75%,平均7979bp含1个SSR位点。SSR位点中三核苷酸重复类型出现频率最高(37.12%),其次是单核苷酸重复(32.36%)和二核苷酸重复(28.20%)。共有60种重复基元,其中A/T(31.42%)、AG/CT(12.80%)、ATC/ATG(9.62%)是优势重复基元。随机选择55对引物进行多态性验证分析,其中42对有扩增产物,14对具稳定可重复的多态性;利用UPGMA作图,将18份样品分为3类。结论款冬转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富,多态性高,为其遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等研究提供了候选分子标记。     

适用于SSR分析的广西莪术DNA提取方法考察

目的:获取适用于广西莪术简单序列重复(SSR)分析的高质量DNA,为该品种的遗传多样性研究提供参考。方法:选择广西莪术嫩叶为材料,采用经典十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和改良CTAB法提取广西莪术总DNA,考察手工和机器研磨的差异性,采用UV检测DNA浓度和纯度,DNA作为模板进行聚合酶链反应(PCR)扩增,引物选择clest SSR-01,clest SSR-03,clest SSR-06,clest SSR-08,clest SSR-14,clest SSR-15,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA扩增效果。结果:改良CTAB法所提DNA的A260 nm/A280 nm1.8~2.0,蛋白质、多糖、RNA等物质去除较彻底,DNA符合PCR扩增结果要求,使用姜黄属通用引物能扩增出清晰条带。经典CTAB法所提DNA的A260 nm/A280 nm1.50~1.60,含较多杂质,无法用于PCR扩增等分子生物学研究。结论:改良CTAB法提取所得DNA质量较好,可有效去除次生代谢产物对DNA的干扰,适用于广西莪术SSR分子标记和遗传多样性分析。