Fas通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活调控肝癌细胞增殖

目的 探究肿瘤坏死因子受体超族成员6(Fas)调控肝癌细胞株增殖的潜在分子机制。方法 收集正常肝细胞LO2和肝癌细胞株Hep3B、Huh7、PLC/PRF/5、Bel-7402、SMMC-7721、HepG2和SK-hep1,实时荧光定量PCR法检测Fas基因表达,运用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析Fas基因表达与肝癌的关系,设计特异性靶向Fas的siRNA,敲低肝癌细胞中Fas基因的表达,通过噻唑蓝(MTT)实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力,用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布,双荧光素酶实验检测β-连环蛋白(β-catenin)介导的T细胞因子(TCF)/淋巴增强子(LEF)转录活性,蛋白质印迹法检测β-catenin蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt)/β-catenin信号通路下游靶基因八聚体结合转录因子3/4(Oct3/4);G1/S-特异性周期蛋白-D1(CCND1);血管内皮生长因子(VEGF);B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(Bmi)的表达。结果 TCGA肝癌样品中Fas基因表达谱结果显示,肝癌组织Fas ...     

氯化锂激活的Wnt/β-catenin信号通路对激素型骨质疏松的防护作用

目的 研究氯化锂(LiCl)激活的Wnt/β-catenin信号通路对糖皮质激素引发的小鼠骨丢失的防护作用.方法 将C57BL6/J小鼠随机分为3组:对照组、骨质疏松模型组和LiCl组.骨质疏松模型组及LiCl组小鼠皮下注射地塞米松(50 mg/kg),对照组小鼠皮下注射同等剂量生理盐水.LiCl组小鼠在注射地塞米松同时通过饮用水给予LiCl(200mg/kg).处理5周后处死小鼠做骨组织切片,用免疫组化染色检测活性β-catenin蛋白的表达,鉴定体内Wnt/β-catenin通路激活情况;用H-E染色鉴定骨组织形态.同时取小鼠股骨进行microCT扫描,测定骨形态计量学参数.用钙黄绿素荧光标记实验鉴定新骨形成能力,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定骨吸收情况.结果 LiCl组小鼠体内活性β-catenin蛋白水平高于骨质疏松模型组,其骨量、骨小梁数量、骨小梁间隙及骨密度均得到改善(P＜0.05),但与对照组相比差异仍有统计学意义(P＜0.05).钙黄绿素荧光标记实验证实LiCl组小鼠新骨形成能力比骨质疏松模型组有所提高,但仍低于对照组.TRAP染色证实各组小鼠骨吸收活性未发生明显改变.结论 口服LiCl能有效激活体内Wnt/β-catenin信号通路,促进新骨形成,对糖皮质激素引发的骨丢失有一定的防护作用.     

MAGEA1通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进恶性黑色素瘤的转移

背景 恶性黑色素瘤是源自黑色素细胞的恶性肿瘤,恶性程度高.其中转移性黑色素瘤患者的5年生存率不足10％,且发病率逐渐增加.黑色素瘤相关抗原家族A1(melanoma?associated?antigen?family?A1,MAGEA1)是MAGE-A基因亚家族的成员,在多种恶性肿瘤中均有表达,但其在恶性黑色素瘤中的表...     

TRIB3通过激活β-catenin信号通路促进鼻咽癌细胞增殖和侵袭迁移

目的 探讨TRIB3对鼻咽癌细胞增殖和侵袭迁移的影响,并研究其作用机制。方法 使用荧光定量PCR检测鼻咽癌组织和正常癌旁组织中TRIB3的相对表达量,并检测正常鼻咽上皮细胞(N69)和鼻咽癌细胞(HNE-1、CNE-2Z、5-8F)中TRIB3的相对表达量。体外培养人鼻咽癌细胞HNE-1、CNE-2Z,每株细胞分2组：即阴性对照组(NC组)和敲低TRIB3组(sh-TRIB3组)。荧光定量PCR和Western blot法检测转染后各组细胞TRIB3的表达水平。敲低TRIB3后,CCK-8实验和集落克隆实验检测鼻咽癌细胞增殖能力,Transwell实验和划痕实验检测鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测EMT相关蛋白Snail、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin和β-catenin信号通路相关蛋白GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和p-β-catenin的相对表达水平。结果 荧光定量PCR结果显示,与癌旁组织相比,鼻咽癌组织中TRIB3表达高度上调(P<0.001);与正常鼻咽上皮细胞(N69)相比,鼻咽癌细胞(HNE-...     

GPP34激活结肠癌细胞Wnt信号通路促进癌细胞增殖的研究

探讨人结肠癌细胞中高尔基相关蛋白34（ 34）基因高表达,激活经典Wnt信号通路,促进癌细胞增殖的机制。方法将SW620 结肠癌细胞株分为4 组：对照组、siRNA 转染组、Tricinbine 组及TWS119组,分别培养;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测结肠癌细胞转染后的沉默效果;分别用Topflash报告基因活性法、噻唑蓝（MTT）、流式细胞技术检测各组癌细胞Wnt 信号通路活性、生长抑制率、细胞凋亡率;Western blot检测各组结肠癌细胞中GPP34、β-catenin、pS9- 糖原合酶激酶-3β（pS9-GSK-3β）蛋白的表达。结果转染siRNA 后,沉默结肠癌细胞GPP34 表达效果佳;与对照组比较,各实验组癌细胞的生长抑制率和凋亡率升高,且Wnt信号通路活性抑制。Western blot检测结果显示,siRNA-GPP34 组GPP34 蛋白表达下降,其余两组GPP34蛋白表达比较,差异无统计学意义;siRNA转染组、Tricinbine组和TWS119组的β-catenin和pS9-GSK3β蛋白表达降低。结论SW620 结肠癌细胞中34 基因的高表达可通过激活经典Wnt 细胞信号通路,促进癌细胞增殖并抑制其凋亡。     

Wnt信号通路在乳腺癌中的作用

目的 探讨乳腺癌中Wnt信号通路关键因子β-catenin的突变和表达及靶基因cyclinD1、c-myc的表达及意义.方法 应用免疫组化SP法检测119例乳腺癌,72例乳腺增生症和40例正常乳腺组织中β-catenin、cyclinD1、c-myc的表达,并分析其与乳腺癌临床病理特征的关系.应用PCR和基因测序的方法检测44例乳腺癌β-catenin外显子3的突变情况,同时应用免疫组化SP法检测其β-catenin的表达.结果 40例正常乳腺组织中β-catenin在细胞膜中强表达,cyclinD1及c-myc 阴性表达.乳腺癌β-catenin异常表达率明显高于乳腺增生症,组间比较差异有显著性(78.15%vs44.44%,P<0.01),乳腺癌cyclinD1、c-myc阳性表达率高于乳腺增生症(57.98%vs33.33%;56.30%vs27.78%,均P<0.01).β-catenin异常表达、cyclinD1的过表达与淋巴结转移相关,c-myc的过表达与肿瘤大小和淋巴结转移相关.β-catenin的异常表达与cyclinD1的表达相关,而与c-myc的表达无关.44例乳腺癌组织中未检测到β-catenin基因外显子3的突变,v-catenin的异常表达率为77.30%.结论 β-catenin异常表达是乳腺癌发生发展过程中的重要因子,这个过程可能是通过激活cyclinD1实现的.β-catenin异常表达和cyclinD1、c-myc过表达可作为评估乳腺癌转移预后、指导治疗的指标.乳腺癌组织中细胞内β-catenin异常积聚不是由β-catenin基因突变所致,可能存在其他机制.     

ITGB4BP对Wnt/β-catenin信号通路活性的下调作用

目的 探讨β4整合素结合蛋白ITGB4BP 对Wnt/β-catenin信号通路的影响.方法 将对照组空载体pCMV-3B质粒和实验组pCMV-ITGB4BP质粒分别转染至HEK293细胞中,用Western blot和激光共聚焦技术检测细胞中β-catenin含量的变化,用含TCF/LEF启动子的荧光素酶TOPFlash质粒和内参pRL-TK质粒共转染对照组和实验组的HEK293细胞,用荧光素酶活性分析法检测ITGB4BP转染后HEK293细胞TCF/LEF活性的变化.设不转染质粒组为正常组,对照组和实验组均分别设未加LiCl组和加LiCl组.结果 Western blot检测结果:与正常组或对照组比较,实验组细胞β-catenin表达显著减少(P<0.05).加LiCl之后,β-catenin的表达显著增强(P<0.05),与未加有LiCl的正常组或对照组比较,加LiCl的实验组细胞内β-catenin仍有较高的表达,但差异无显著性.激光共聚焦技术观察:实验组β-catenin(绿色荧光)表达较对照组降低.加LiCl之后,β-catenin(绿色荧光)表达增强,与未加LiCl的对照组相比,加LiCl的实验组仍有较强的荧光强度.荧光素酶活性分析法检测:实验组的荧光素酶活性较对照组显著降低(P<0.05).LiCl作用之后,Wnt/β-catenin信号通路活性明显增强(P<0.05),与未加LiCl的对照组相比,加LiCl的实验组仍有较强的荧光素酶活性(P<0.05).结论 ITGB4BP可以下调Wnt/β-catenin信号通路的活性.     

Wnt信号通路在脑卒中疾病中作用的研究进展

Wnt信号通路是由配体蛋白Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径,分为经典和非经典Wnt通路。其在多细胞生物体轴分化过程中起重要作用,参与了器官发生、大脑形成、海马回发育、生长锥重建、轴突形成,能够多环节、多靶点参与神经元的增值、分化、抑制迁移。脑卒中属急性脑血管疾病,具有高发病率、高死亡率、高复发率。Wnt通路是调控细胞生长、增殖、分化的关键途径,无论是在正常的神经发生、还是神经系统疾病形成和发展过程中,均有Wnt信号通路的参与。Wnt信号通路对神经干细胞的增殖分化发挥着决定作用,为很多脑损伤疾病提供启发与研究方向。研究Wnt通路与中枢神经系统细胞的作用可以为脑卒中在实验机制研究与临床针刺康复治疗提供新的依据与思路。     

姜黄素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制晶状体上皮细胞增殖的实验研究

[目的] 探讨姜黄素通过Wnt/β-catenin信号通路对人晶状体上皮细胞（LECs）增殖的影响及其可能的作用机制,为晶状体后囊膜混浊（PCO）的临床治疗提供新的靶点。[方法] 人LECs系SRA 01/04细胞为研究对象,实验分为3组：Wnt3a组,姜黄素组和对照组。Wnt3a组采用脂质体介导转染技术将Wnt3a cDNA表达载体瞬时转染入人SRA 01/04细胞中,构建PCO的细胞模型。姜黄素组在转染Wnt3a cDNA表达载体48 h后加入20 μmol/L姜黄素,对照组转染pcDNA3-HA表达载体。采用Western blot技术验证载体在转染细胞中的表达,CKK-8实验检测姜黄素对SRA 01/04细胞增殖能力的影响,采用免疫细胞化学法检测Wnt3a过表达后增生细胞核抗原（PCNA）蛋白表达的变化;Western blot法检测Wnt3a过表达对Wnt/β-catenin下游信号分子cyclin D1和c-Myc蛋白表达的影响;应用免疫荧光法检测Wnt3a过表达后β-catenin表达的定位变化。[结果] Western blot检测证实,转染pcDNA3-HA表达载体后,SRA 01/04细胞内Wnt3a蛋白表达明显升高。CKK-8检测表明,姜黄素组SRA 01/04细胞的增殖率明显低于Wnt3a组（t=2.782,P=0.049）。姜黄组SRA 01/04细胞PCNA蛋白表达阳性率为23.6%±4.0%,明显低于Wnt3a组的43.4%±5.4%,差异有统计学意义（t=2.951,P=0.018）。转染后48 h,β-catenin蛋白密集分布于Wnt3a组细胞核和细胞质中,而在对照组仅出现于细胞之中,姜黄素组β-catenin蛋白主要分布于细胞核中,少量分布于细胞质中。Western blot检测姜黄素组Wnt/β-catenin信号通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc蛋白表达明显低于Wnt3a组。[结论] 在SRA 01/04细胞中,姜黄素抑制Wnt3a过表达诱导的Wnt/β-catenin信号通路活化,下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达下调,抑制人LECs的增生。     

Wnt信号通路调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

Wnt通路作为调控细胞生长、发育和分化的重要信号途径一直是医学研究的热点。近年来的研究表明,Wnt信号通路在调控间充质干细胞（MSCs）成骨分化过程中发挥重要作用,其机制已成为骨组织工程研究的热点,也为骨质疏松症等疾病的治疗提供了新思路。该文对Wnt信号通路调控MSCs成骨分化的研究进展进行综述。     

Wnt信号转导路径与口腔颌面部肿瘤相关性的研究进展

信号转导是指细胞外部的信号或刺激通过不同途径使细胞表型发生变化并产生各种生物效应。Wnt信号转导路径是多细胞真核生物中高度保守的一类信号转导途径,它主要通过经典路径使β连环蛋白在细胞质中积累,并进入细胞核与T细胞因子相互作用,促进靶基因的表达而导致细胞的异常增殖及分化,从而引起肿瘤的发生。了解此通路在口腔颌面部肿瘤病程中的分子机制有助于为临床诊断和治疗提供依据。     

青蒿琥酯通过PI3K-Akt通路促进大鼠室管膜下区神经干细胞增殖的体外研究

目的 探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对室管膜下区(subventricular zone,SVZ)神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响.方法 不同浓度的ART(400 nmol/L、800 nmol/L、1.6 μmol/L、3.2 μmol/L)作用于NSCs 24 h后,采用CCK-8法检测其对NSCs增殖的影响.促增殖作用明显的800 nmol/L ART组加入10 μmol/L PI3K-Akt通路阻断剂(LY294002),采用CCK-8法检测该通路对NSCs增殖的影响;分别设置空白对照组、LY294002组、800 nmol/L ART组、800 nmol/L ART+ LY294002组,待细胞培养24h时,行Ki-67免疫荧光染色观察ART对NSCs增殖的影响及PI3K-Akt通路在其中的作用,同时采用Western blot检测各组Nestin、Akt及p-Akt蛋白的表达水平.结果 ①CCK-8法检测结果显示800 nmol/L ART组在波长450 nm处的光密度值较空白对照组明显升高,在加入LY294002后,其光密度值明显下降(P＜0.05),与空白对照组水平相当;②Ki-67免疫荧光染色结果提示800 nmol/L ART可促进NSCs增殖,LY294002可抑制这一作用;③Western blot检测结果显示:神经干细胞表面标志蛋白Nestin及p-Akt蛋白表达水平在800 nmol/L ART组明显上调,在加入LY294002后两者表达水平均下调(P＜0.05).结论 ART可在体外促进SVZ区NSCs的增殖,其机制与PI3K-Akt信号通路相关.     

Wnt通路新调控因子R-spondin家族在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的：探讨结直肠癌及癌旁组织中R-spondin家族的表达水平及其与患者临床病理分期之间的关系。 方法：收集中南大学湘雅医院2014年1月至2014年8月行根治性手术治疗后的64例结直肠癌新鲜组织及配对的癌旁组织 标本,利用实时荧光定量PCR及免疫组织化学法检测癌组织及癌旁组织中R-spondin 1~4及β-链蛋白(β-catenin)的mRNA 及蛋白表达情况;分析R-spondin 1~4表达水平与结直肠癌的临床病理因素之间的关系;探讨R-spondin 1~4与β-catenin 在结直肠癌中表达的相关性。结果：与癌旁组织相比较,R-spondin 1蛋白及mRNA在结直肠癌组织中呈高表达 (P<0.05);与正常组织比较,R-spondin 2~4在结直肠癌组织中呈高表达,但与癌旁组织的表达水平比较差异无统计学 意义(P>0.05);结直肠癌组织中R-spondin 1表达水平与β-catenin的细胞核表达水平呈正相关(r=0.6307,P<0.05)。结论： 与癌旁组织相比较,R-spondin 1在结直肠癌组织中呈高表达;R-spondin 1可能通过调控Wnt信号通路下游的β-catenin活 性而发挥促癌作用。     

Wnt信号通路异常激活在卵巢上皮性癌中的作用

Wnt信号通路是重要的细胞信号传导通路,参与了从胚胎到成体的一系列调控,在细胞增殖、分化、运动、黏附及机体发育中起重要的调节作用,异常激活会导致相关疾病尤其是肿瘤的发生。人类卵巢上皮性癌的发生发展过程中存在经典Wnt信号通路的异常激活。研究发现,在卵巢上皮性癌细胞中Wnt信号通路相关蛋白β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt-1、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达明显增高,其中β-catenin蛋白与癌细胞的异常增殖及转移有密切关系。针对Wnt信号通路变化的研究对卵巢上皮性癌的临床诊断与治疗有重要意义。     

Blocking Ihh signaling pathway inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of PSCs

Summary： The roles of Indian hedgehog （Ihh） signaling pathway in the proliferation and apoptosis of precartilaginous stem cells （PSCs） were investigated. PSCs, labeled with fibroblast growth factor receptor 3 （FGFR-3）, were isolated from neonatal rats by immunomagnetic separation. After identification with FGFR-3 and Col II, the cells were incubated with different concentrations of cyclopamine （cyclo）, the specific inhibitor of Ihh signaling pathway. The morphologic changes of the cells were observed under the inverted phase contrast microscope. The mRNA expression levels of Ihh, parathyroid hormonerelated peptide （PTHrP）, protein Patched （Ptch）, Bcl-2 and p21 were detected by RT-PCR. The protein expression levels of Ihh and Ptch were measured by Western blot. MTT assay was used to examine the effects of cyclo on proliferation of PSCs. Apoptosis rate of PSCs was examined by AnnexinV/PI assay of flow cytometric analyses. After PSCs were incubated with cyclo, obvious morphologic changes were observed as compared with the control group. The mRNA expression levels of PTHrP, Ptch and Bcl-2 were decreased to varying degrees in a cyclo dose-dependent manner. However, the expression levels of Ihh and p21 mRNA were increased. The protein expression of Ptch and Ihh had the same change as the mRNA expression. Meanwhile, cyclo could obvi- ously inhibit the proliferation and promote the apoptosis of PSCs. The results indicated that Ihh signaling pathway plays an important role in regulating the proliferation and apoptosis of PSCs, which is probably mediated by Bcl-2 and p21.     

Wnt信号转导通路与肝纤维化关系的研究进展

肝纤维化是十分复杂的病理过程,其本质是肝星状细胞（ hepatic stellate cells,HSCs）的活化和细胞外基质（ extracellular matrix,ECM）的过度沉积。目前认为HSCs的活化与多种信号通路的激活相关。相关研究证实Wnt信号转导通路在调控肝脏病理生理的过程中起到重要作用,阻断该通路可以抑制HSCs的增殖及诱导其凋亡。本文就Wnt信号转导通路与肝纤维化关系的研究进展进行综述。     

沉默核仁素可诱导大鼠神经干细胞的分化

目的 探讨核仁素(nucleolin)对原代神经干细胞(NSCs)分化的影响及其相关机制.方法 构建核仁素siRNA腺病毒表达载体,将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染HEK293A细胞,包装得到具有感染能力的nucleolin-siRNA重组腺病毒.病毒体外感染原代NSCs,采用Western blot检测nucleolin蛋白的表达情况,Nucleolin-siRNA对神经干细胞Nestin、Wnt3、β-catenin蛋白表达的影响;采用免疫细胞化学检测nucleolin-siRNA对神经干细胞分化的影响.结果 经酶切和测序鉴定均证实nucleolin-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误.Western blot检测结果显示,转染nucleolin-siRNA2的细胞nucleolin表达明显受到抑制.siRNA+组NSCs分化为NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞的分化率明显比CON组、siRNA-组增加,且差异具有统计学意义(P<0.01).与阴性对照组相比,siRNA+组Nestin的表达明显减少,Wnt3表达明显增多,β-catenin入核明显增多,其差异具有统计学意义(P<0.05).结论 本研究成功地构建了针对nucleolin基因的siRNA重组腺病毒载体,沉默nucleolin可诱导神经干细胞的分化,其机制可能与Wnt信号转导通路的激活有关.     

miR-155-5p调节Wnt信号通路促进肾透明细胞癌细胞的增殖与转移

目的 研究miR-155-5p和Wnt信号通路在肾透明细胞癌细胞中的作用机制。方法 采用qRT-PCR检测细胞中miR-155-5p的表达。WB检测各细胞中Wnt信号通路相关蛋白磷酸化水平及蛋白表达水平。通过MTT实验、细胞划痕实验、Transwell实验分别检测各细胞增殖、迁移和侵袭能力。结果 肾透明细胞癌细胞中miR-155-5p的表达明显高于正常细胞。过表达miR-155-5p促进肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭。加入通路蛋白抑制剂后,我们发现其会减弱过表达miR-155-5p对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进能力。结论 miR-155-5p和Wnt在调节肾透明细胞癌发生发展中起着关键作用,miR-155-5p可能成为肾透明细胞癌治疗的新靶点。     

干扰CXCR4基因抑制胰腺癌经典Wnt通路活化的体外实验研究

目的观察CXCR4 shRNA转染胰腺癌细胞后经典Wnt通路的活性变化.方法构建CXCR4 shRNA表达载体转染胰腺癌CXCR4高表达细胞Miapaca-2并应用G418筛选出稳定表达株,通过Realtime-PCR、WesternBlot实验观察RNAi对CXCR4基因的抑制效率;通过PGL3-OT/OF荧光素酶检测方法观察CXCR4基因沉默后对胰腺癌Wnt/β-catenin经典通路活性的影响,并通过Realtime-PCR、Western Blot实验观察CXCR4 shRNA对Wnt/β-catenin通路下游靶基因的影响.结果特异性CXCR4基因沉默能够在基因和蛋白水平稳定、高效、特异地抑制CXCR4的表达,抑制效率达70%以上,同时,特异性CXCR4干扰后能够显著抑制PGL3-OT转染后的荧光素活性（P〈0.05）以及Wnt/β-catenin下游靶基因的mRNA及蛋白的表达.结论CXCR4基因沉默能抑制Wnt/β-catenin经典通路在胰腺癌中的活性,阻遏Wnt/β-catenin通路下游靶基因表达,为CXCR4作为胰腺癌治疗的分子靶点提供依据.