溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系的建立

目的:建立溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系。方法:根据溶藻弧菌胶原酶基因colH的保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针,优化反应体系中的引物浓度和探针浓度,评价此反应体系的特异度,并确定其检测下限。结果:优化的反应体系中,引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L,检测下限为1.0×102拷贝/μl,较普通PCR提高了100倍。特异度为100%。结论:本研究所建立的检测体系能够灵敏和特异地检测溶藻弧菌,可以作为溶藻弧菌的快速检测方法。     

实时荧光定量PCR快速检测嗜水气单胞菌方法的建立

目的利用实时荧光定量PCR技术,建立一种快速、特异、灵敏、定量检测嗜水气单胞菌的方法,用于病人腹泻物或水产品病变部位目的菌的快速检测。方法以GenBank中嗜水气单胞菌WP3的溶血素基因(hlyA)为靶序列,设计引物与TaqMan探针,对模板DNA制备方法,PCR反应时间和温度进行优化,以嗜水气单胞菌ATCC7966和20株相关细菌考核检测体系的特异性、灵敏性和重复性。结果本方法检测时间仅需30min,定量线性范围5.4×103～5.4×108cfu/ml,与20株常见肠道细菌均无反应,对4个浓度的嗜水气单胞菌测定的批内标准差在0.08～0.14之间。结论成功建立实时荧光定量PCR检测嗜水气单胞菌方法,该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌,具有推广应用价值。     

河弧菌Taqman实时荧光PCR检测方法建立

目的 建立以Taqman实时PCR检测河弧菌的方法.方法 根据河弧菌toxR基因的保守序列设计引物和Taqman探针,建立检测河弧菌的实时PCR方法;对引物和探针的浓度进行优化,对优化后建立的方法分别进行实验室内的灵敏度和特异性评价,并与常规PCR比较.结果 建立了检测河弧菌的实时PCR方法,经优化该方法选择引物的浓度为100 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L;该方法对纯菌的检测下限为4.17×102cfu/mL,比常规PCR高1000倍;针对toxR基因建立的河弧菌实时PCR方法,对8种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增.结论 建立的方法能够特异和敏感地检测河弧菌,可用于河弧菌的快速筛检.     

新型细菌耐药基因NDM-1实时PCR检测方法的建立

目的 建立灵敏、特异、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测新型细菌耐药基因NDM-1.方法 根据NCBI数据库中β-内酰胺酶类相关耐药基因的序列,详细进行比对,选择特异性最高的片段设计引物和TaqMan探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光PCR方法.对所建立的实时荧光PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价.结果 本方法对各种细菌病原体的新型细菌耐药基因NDM-1的检测具有高度特异性和灵敏度.优化后的引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为100 nmol/L,灵敏度和特异度均为100％.该方法的检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,远远高于普通PCR1.0×105拷贝/μl的检测下限.结论 所建立的方法能够特异和敏感地检测携带NDM-1基因的超级细菌,能够作为携带有该基因细菌的灵敏快速的检测方法.     

霍乱毒素基因(ctx)和耐热直接溶血素基因(tdh)双重TaqMan实时PCR检测方法的建立

[目的]建立霍乱毒素和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时-PCR实验室检测方法。[方法]根据霍乱毒素基因(Cholera toxin gene,ctx)和耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin,tdh)的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测霍乱毒素和耐热直接溶血素两种毒力基因的双重TaqMan实时PCR方法。对所建立的霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。[结果]建立了霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR的实验室检测方法。优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中,ct引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L;tdh引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为94%和97.7%。[结论]本研究建立了基于TaqMan探针的tdh和ct双重实时PCR检测方法,具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,高于普通PCR100倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,这为费时又繁琐的传统检测方法提供了一种可靠又快速的替代选择。     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌

目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。     

从海产品中检出1株嗜水气单胞菌

目的 2012年夏季连续暴雨水过后,为了解大连开发区海产品卫生状况,为市民的食品提供安全保障,对部分近海贝类产品检验。方法依据国标GB4789食品微生物学检验及GB/T18652-2002致病性嗜水气单胞菌检验方法检测海产品沙门氏菌、副溶血性弧菌、气单胞菌。结果在22份近海贝类产品中检出1株嗜水气单胞菌。结论气单胞菌为水中常居菌,可引起人类肠道感染。在夏季暴雨过后,应注意海产品中气单胞菌的检测。     

烟台市食品行业从业人员肠道致病菌的检测及意义

目的:对烟台市从事食品行业人员的肠道致病菌进行检测,为当地食品安全的危险性评估提供依据。方法:检测2009年-2011年烟台市25600名从事食品行业的服务人员的肠道致病菌;检测方法按照国家标准GB/T4789-2003《食品卫生检验方法微生物学部分》的规定;检测菌群范围包括:沙门菌、志贺菌、豚鼠气单胞菌、致泻性大肠杆菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、霍利斯弧菌、非O1群霍乱弧菌、副溶血弧菌。结果:(1)根据生化鉴定结果表明其生化谱线符合率为93.8%～99.9%;(2)检出肠道细菌254份,阳性率为0.99%,其中弧菌科细菌为144株(含117株副溶血弧菌,12株溶藻弧菌,6株温和气单胞菌,5株非O1群霍乱弧菌,2株豚鼠气单胞菌,1株嗜水气单胞菌,1株霍利斯弧菌),占检出肠道细菌的56.69%;肠道杆菌细菌为110株(含76株沙门菌6,株志贺菌,9株致病性大肠杆菌,14株侵袭性大肠杆菌,5株产毒性大肠杆菌,占检出肠道细菌的43.30%。肠道致病菌的阳性率呈现出逐年下降的趋势,差异有显著的统计学意义;(3)检出的肠道致病菌中,以副溶血弧菌(46.06%)和沙门菌(29.90%)阳性率为最高。结论:食品行业服务人员病原菌携带的肠道致病菌以肠道弧菌为主要的病原菌。对该人群进行健康携带病原细菌调查,有利于找出微生物引起食源性疾病的关键控制点,从而采取针对性措施来规范相关人员健康检查的工作以保障食品卫生安全。     

霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立霍乱弧菌和拟态弧菌的实时荧光PCR快速检测方法。方法根据霍乱弧菌外膜蛋白W基因(out membrane protein W,omp W)和拟态弧菌溶血素基因(Vibrio mimicus hemolysin gene,vmh)的保守序列设计引物和Taq Man探针,建立快速检测并区分霍乱弧菌和拟态弧菌的双重荧光PCR方法,并对所建立的方法进行灵敏度和特异度评价。结果建立了霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR快速检测方法。优化的反应体系中,omp W引物和探针的浓度分别为100 nmol/L和200 nmol/L;vmh引物和探针的浓度均为100 nmol/L。对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为100.9%和99.7%。灵敏度和特异度均为100.0%。结论基于Taq Man探针的omp W和vmh双重荧光PCR检测方法,具有好的灵敏度和特异度。并且能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,为繁琐费时的传统检测方法提供了一种快速可靠的替代选择。     

游泳池水中嗜水气单胞菌的毒力因子的研究

目的:对游泳池水检测出的19株嗜水气单胞菌进行毒力因子的研究.方法:通过蛋白酶试验检测嗜水气单胞菌的蛋白酶,采用血平板法观察溶血素,采用PCR方法检测hlyA和aerA两种毒素基因,并进行小白鼠毒力试验.结果:19株嗜水气单胞菌菌株含hlyA基因的占78.95%(15/19),含aerA基因占73.68%(14/19),18株嗜水气单胞菌菌株产生蛋白酶,溶血试验显示的结果与hlyA基因检测的结果相符.菌株对小白鼠的平均致死率达85.96%(49/57).结论:游泳池水中分离出的嗜水气单胞菌大多携带毒力基因.采用多种方法检测其毒力因子能客观地对其毒力进行判定.     

游泳池水中弧菌科病原菌的调查研究

目的：为了解室内游泳池中弧菌科病原菌的分布情况，预防和控制病原菌在游泳池中的传播流行。方法：采用碱性胨水增菌、TCBS平板分离和系统生化鉴定分离病原菌。并对分离到的菌株进行小白鼠毒力试验及药敏试验。结果：60份游泳池水中有25份水样检出了弧菌科病原菌，其中以嗜水气单胞菌为优势菌，其次为温和气单胞菌与非01群霍乱弧菌。小白鼠毒力试验等证明了这些菌株都具一定的毒力。药敏试验结果表明这些弧菌科细菌存在一定的耐药现象，特别是对羟氨苄青霉素100％耐药，且嗜水气单胞菌、非01群霍乱弧菌对头孢噻吩、头孢西丁也100％耐药。结论：弧菌科病原菌在室内游泳池水中具有较高的检出率。常规方法结合病原菌分析，能综合评价游泳池水的卫生状况。     

大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的建立与应用

摘要:目的　建立快速检测食品中大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR 方法。方法　针对大肠杆菌O157︰H7菌体抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbE（O157）和fliC（H7）筛选设计引物和探针,优化反应条件,建立可特异性检测大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR方法,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价,对模拟样品和实际样品进行初步验证。结果　利用建立的方法对2株大肠杆菌O157︰H7及12株非大肠杆菌O157︰H7进行检测,O157︰H7菌株检测结果均为rfbE和fliC阳性,非O157︰H7菌株检测结果均为阴性,rfbE和fliC基因的特异性均为100%;2基因的检测灵敏度可达1.16×102 CFU/ml;批内、批间变异系数均小于3.5％;模拟样品立即检测,2个基因的最低检出限（2.7×102 CFU/ml）和细菌纯培养时接近;实际样品检测结果与我国检验检疫行业标准（SN/T 0973-2010）的检测结果一致。结论　建立的荧光定量PCR 方法特异性及重复性好,灵敏度高,可快速准确鉴定大肠杆菌O157︰H7菌株。     

两起食物中毒标本中气单胞菌的分离与鉴定

本文报道了两起食物中毒标本中气单胞菌的分离与鉴定，在采集的14份食物中毒样品中，检出嗜水气单胞菌3株、温和气单胞菌4株。证实两个型别的气单胞菌均可引起食物中毒。     

大肠杆菌O_(157)∶H_7实时荧光PCR快速检测方法的建立

[目的]利用特异性荧光探针为特点的TaqM an荧光定量PCR技术,建立大肠杆菌O157∶H7污染的快速敏感特异的检测方法。[方法]以大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以大肠杆菌O157∶H7菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度,以大肠杆菌O157∶H7和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。[结果]建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.6μmoL/L、0.8μmoL/L,Mg2+浓度为4mmoL/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除大肠杆菌O157∶H7出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限为17 cfu/mL。同一样品重复检测3次C t值的变异系数均小于5%。[结论]该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。     

普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的建立一种适应国境口岸地区特定鼠种中普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法利用Beacon Designer7.0软件设计引物和探针,以人工合成普马拉病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并验证该方法的灵敏度及特异性。结果模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线y=-3.122x＋38.605,R2=0.995,PCR扩增效率为109.1%,其最低检出限为31.6copies/μl。结论建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,适合于普马拉病毒的快速检测。     

用TaqMan探针实时定量PCR法快速检测鼠疫耶尔森菌

目的建立一种快速、准确、特异的定量检测鼠疫耶尔森菌的方法。方法针对鼠疫耶尔森菌特异的染色体标识序列设计引物和TaqMan探针，进行实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分析，优化反应体系，检测其灵敏度、特异性和重复性。结果以EV76灭活培养物为对象，检测灵敏度可达每反应体系0．08CfU；30株非鼠疫菌株的检测结果表明，对照菌株均为阴性，检测特异性良好；对同一样品进行17次重复检测，其循环阈值的标准偏差为0．35。结论TaqMan探针法能够灵敏、特异、稳定地对鼠疫耶尔森氏菌进行定量检测，为鼠疫监控、诊断提供有力手段。     

黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法建立

目的建立用于检测黄病毒属的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法。方法从GenBank中检索黄病毒属代表株的全基因序列,通过DNAstar进行序列比对和blast进行保守序列搜索和分析,用Beacon Designer 7.0软件进行引物和TaqMan探针设计,以乙脑毒株MB090509 RNA为模板,优化反应条件并应用于现场蚊虫标本检测。结果确定黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR反应条件为:45℃15 min,95℃10 min,95℃10 s→54℃45 s,40次循环,引物和探针终浓度为200 nmol/L。灵敏度为常规RT-PCR方法 100倍,检出限2.9×10-3噬斑形成单位(PFU)/mL,与甲病毒属、东南亚十二节段RNA病毒属、布尼亚病毒属均无交叉反应。从161份现场蚊虫标本中检测出11份阳性标本,经病毒分离、测序均被证实为乙脑病毒。结论本研究建立的黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有广泛应用价值。