从噬菌体构象型7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽

目的 :从噬菌体构象型 7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽。方法 :用重组人BLyS筛选噬菌体构象型 7肽库 ,用间接ELISA、竞争ELISA和细胞增殖活性试验鉴定噬菌体克隆。结果 :经过 3轮亲和筛选 ,噬菌体的回收率增加 ,阳性克隆得到富集。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制BLyS刺激细胞增殖的活性。结论 :获得了噬菌体呈现的能够抑制BLyS的两个短肽。     

抗人HPPCn单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高灵敏度的抗人HPPCn单克隆抗体(mAb),以用于HPPCn的功能研究及其疾病相关性研究。方法:用重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术进行细胞融合,经ELISA法进行阳性克隆筛选、通过有限稀释法进行亚克隆,获得稳定分泌抗人HPPCn mAb的细胞株。采用间接ELISA、Western blot、Ig亚类快速定性试纸分析法等鉴定抗体的生物学特性;通过细胞免疫荧光实验观察了HPPCn蛋白的细胞定位。通过噬菌体肽库技术分析抗体所识别的抗原表位。结果:得到了1株稳定分泌抗人HPPCn抗体的杂交瘤细胞株,命名为W2-D5。经Ig亚类分析确定,该细胞株分泌的抗体属于IgG1亚类。间接ELISA检测表明,该抗体检测HPPCn的极限为0.1μg/L;Western blot结果显示,该抗体能特异性识别HPPCn。细胞免疫荧光实验,证实了HPPCn蛋白定位在细胞核。通过肽库筛选及表位分析认为,该抗体识别的表位可能为HPPCn7-13(IHLELRN)。结论:成功地获得了抗人HPPCn的特异性mAb。     

从随机肽库中筛选抗入ANG抗体的模拟小肽

目的从随机噬菌体十二肽库中寻找抗重组人 ANG抗体的模拟肽。方法以重组人 ANG为目标分子 ,对随机十二肽库进行亲合筛选 ,用噬菌体 EL ISA及竞争抑制实验鉴定阳性克隆的结合性和特异性。结果经过 3轮亲和筛选 ,噬菌体的回收率从 2 .0× 10 - 4 %增加到 9.3× 10 - 2 % ,阳性克隆得到富集 ;EL ISA和竞争抑制实验证明 :有 9个噬菌体克隆与靶分子有较强的结合活性 ,其中 6个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制抗人重组 ANG单抗与 ANG的结合。结论该小肽可能是抗人ANG抗体的模拟小肽 ,可作为 ANG的拮抗剂     

抗人aFGF单克抗抗体抗原表位的筛选

成纤维细胞生长因子ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＦＧＦ是一类多功能的分子,现已发现其有多种同源结构形式,形成了一个生长因子的家族。酸性ＦＧＦａｃｉｄｉｃＦＧＦａＦＧＦ,也称为ＦＧＦ－１,是ＦＧＦ家族中的主要成员,其结构与功能方面的研究受到广泛的关注１２。本室曾制备了抗人ａＦＧＦｈａＦＧＦ的单克隆抗体ｍＡｂ,并建立了检测ｈａＦＧＦ的双抗体夹心测定方法３４。在此基础上,我们采用噬菌体多肽展示技术,筛选出抗ｈａＦＧＦｍＡｂ的抗原表位,为ｈａＦＧＦ的免疫分析…     

噬菌体展示文库及其应用

近十几年来 ,噬菌体展示技术得到了迅速的发展。通过展示随机肽库可用来筛选与特殊靶分子相结合的配基 ;模拟非蛋白的配基 ;也可用作确定抗体表位的工具。展示蛋白 ;或其功能结构域的文库为我们提供了分析结构与功能关系的体系 ,并能产生具有改变结合位点或新的催化活性的蛋白。展示短的抗原决定簇的融合噬菌体为开发新的疫苗提供了基础 ,而表达抗体片段的文库则提供了一种产生单克隆抗体的方法。     

噬菌体展示法筛选抗人 PTA1单克隆抗体结合肽

目的从噬菌体展示文库中筛选能与抗人PTA1单克隆抗体(mAbs)特异性结合的短肽。方法采用protein-A亲和层析法纯化系列抗人PTA1mAbs,通过流式细胞术检测筛选出能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb,经过三轮亲和筛选,从噬菌体随机12肽库中筛选可特异性结合mAb的重组噬菌体阳性克隆,进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析。结果确定了能够阻断PTA1-Fc融合蛋白与其天然配体结合的mAb为LeoA1,得到了13个具有特异性结合LeoA1的重组噬菌体阳性克隆,序列测定结果发现,这些可结合LeoA1的短肽,有较保守而集中的模式序列,即WPXHHX序列。结论这些具有保守模式序列的短肽,有可能模拟PTA1分子的功能表位,成为其天然配体拮抗剂的候选肽段。此外,PTA1分子与其配体结合的功能表位的确定,也为今后寻找天然配体和进一步深入研究PTA1分子的结构和功能提供了实验依据。     

抗人aFGF单克隆抗体抗原表位的筛选

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)是一类多功能的分子,现已发现其有多种同源结构形式,形成了一个生长因子的家族.酸性FGF(acidic FGF,aFGF),也称为FGF-1,是FGF家族中的主要成员,其结构与功能方面的研究受到广泛的关注[1,2].本室曾制备了抗人aFGF(haFGF)的单克隆抗体(mAb),并建立了检测haFGF的双抗体夹心测定方法[3,4].在此基础上,我们采用噬菌体多肽展示技术,筛选出抗haFGF mAb的抗原表位,为haFGF的免疫分析方法的进一步改进,以及对FGF结构与功能深入研究提供一些信息.     

应用噬菌体展示技术筛选HMGB1启动子结合蛋白

目的:筛选高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子结合蛋白。方法:应用噬菌体展示技术,以HMGB1启动子DNA作为固相筛选分子,对噬菌体展示环七肽库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"生物筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定。对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果:经过4轮筛选后,对随机选取的20个噬菌体克隆进行鉴定,其中11个可与HMGB1启动子结合。DNA测序后经过同源性搜索,确定了与HMGB1启动子具有结合作用的蛋白,包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等6种已知功能蛋白和2种未知功能蛋白。结论:筛选到HMGB1启动子的结合蛋白,为研究HMGB1基因的转录调控机制奠定基础。     

人67 LR噬菌体结合肽的筛选与功能分析

目的 为了获得能够与人67 ku层黏连蛋白受体(67 ku laminin receptor,67 LR)特异性结合的噬菌体呈现肽.方法 以重组人67LR蛋白为诱饵,分别对噬菌体12肽库和环7肽库进行亲和凝胶筛选,ELISA测定所筛选噬菌体克隆与靶蛋白的亲和力,经测序分析得到67 LR特异性结合噬菌体克隆,并通过293细胞侵袭转移实验测定阳性噬菌体呈现肽对67LR促细胞侵袭作用的抑制效果.结果 经4轮筛选共筛到2类新的67LR结合肽,分别具有DXCETCT(X可变)和YRPMXEY(X可变)一致序列.其中DX-CETCT噬菌体呈现肽可显著抑制67 LR所诱导的细胞侵袭,且这种抑制作用与YIGSR 5肽具有一定互补性.结论 成功筛选到2类新的67 LR结合肽,其中DXCETCT噬菌体呈现肽可针对性抑制67LR所诱导的细胞侵袭作用.     

利用噬菌体肽库技术获得与人Fas结合的多肽基序

目的　利用噬菌体随机肽库技术获得与人Fas胞外区结合的多肽及其多肽基序 ,观察多肽基序的生物学功能。方法　以人Fas胞外区与IgGFc段的融合蛋白Fas .Fc为筛选配基 ,筛选噬菌体随机九肽库 ;微量淘洗与ELISA相结合鉴定阳性克隆 ,DNA测序和分析。化学合成多肽进行竞争性ELISA以及细胞增殖抑制实验。结果　经过 4轮亲和筛选 ,微量淘洗鉴定 ,获得 4 2个阳性克隆 ;固定ELISA实验显示筛选到的噬菌体短肽能与Fas .Fc特异性结合 ,并呈剂量依赖关系 ;随机选取 13个阳性克隆进行DNA测序 ,其序列及出现几率分别为 :PRKARVDTS(2 / 13)、YKKKSLQVQ (2 / 13)、YKKKSMLQA(2 / 13)、SRKKYDQYA(4/ 13)、YARKIKPTA(2 / 13)和ARKKTEGAG(1/ 13)。经多重序列分析 ,获得多肽基序 : R/KKK A。在ELISA和竞争性ELISA实验中 ,化学合成多肽EGEFYKKKSM LQADPAK (P3)可抑制Fas与抗人Fas单抗Apo 1的结合 ,且呈剂量效应关系 ;P3不能抑制Fas与FasL的结合。细胞增殖实验表明 ,多肽可抑制Jurkat细胞增殖 ,且随多肽剂量的增加而加强。多肽与单抗Apo 1联合作用对Jurkat细胞增殖的影响与单独使用P3没有明显差别。结论　通过噬菌体随机肽库技术获得与Fas结合的多肽及其多肽基序 ,它们可能模拟了抗Fas抗体Apo 1对Fas的结合位点 ,为基于Fas凋     

从噬菌体随机环七肽库筛选可模拟C1qR的C1q结合肽

为获得能结合C1q并模拟C1q受体 (C1qR )配体结合位点的短肽 ,以C1q为钓饵蛋白筛选噬菌体环七肽库 ,采用C1q结合ELISA、U937细胞配体结合抑制试验、多聚IgG (AIgG )竞争抑制试验鉴定阳性克隆 ,再进行单链DNA测序和分析。结果经 3轮筛选后 ,随机挑选 2 3个噬菌体克隆进行ELISA鉴定 ,10个克隆与C1q有较强的结合 ;利用U937细胞配体结合抑制试验 ,得到了 7个阳性克隆 ;从其展示肽DNA测序结果推导氨基酸序列 ,获得 7个短肽序列 :QTPFQLW、NPFNWTS、SPFXLTS、FLTWLDP、FSTFLYP、GPMWWSY和NPFXLIL。     

外源性HMGB1的研究进展

胞内HMGB1可以主动或被动释放到胞外,外源性HMGB1被认为是重要的晚期炎症因子,在炎症的发生发展中起重要作用.胞外HMGB1能与很多因子形成复合物,通过不同的受体通路影响转录因子NF-κB的活性,发挥不同的生物学效应.除发挥炎症因子的作用外,HMGB1在组织的修复和重建中的作用也不容小觑.另外,HMGB1预处理可以诱导产生免疫耐受,可能与脓毒症末期免疫功能低下有一定关系.     

模拟HIV-1 gp41 CHR表位短肽的筛选及研究

目的 利用针对HIV-1跨膜蛋白gp41CHR序列合成肽C34的单克隆抗体1G1筛选噬菌体12肽库，旨在找寻模拟C34肽表位的序列，同时探索该短肽成为HIV-1gp41NHR与CHR结合抑制物的可能性。方法 以1G1为钓饵蛋白对噬菌体12肽库进行亲和筛选，以双夹心ELISA鉴定阳性克隆。结果 经3轮筛选后，随机挑选17个噬菌体克隆，其中6个克隆与1G1显示出较强的结合活性，上述6个阳性克隆经DNA测序，氨基酸序列相同；HYEFWAWNWEAN，其明显的疏水性质类似于G34N末端，特异性鉴定显示这些克隆均能够与HIV-1gp41N多肽结合，结论 该噬菌体克隆展示肽可模拟HIV-1gp41CHR多肽表位，并可与N多肽结合。     

胃癌相关抗原表位模拟短肽的筛选

目的：筛选能模拟胃癌相关抗原表位的功能短肽。方法：利用离子交换层析，对抗胃癌相关抗原单克隆抗体(mAb)进行纯化，并以此mAb为靶标，将其包被于ELISA板上，以噬菌体随机12肽库对其进行3轮亲和筛选。结果：从噬菌体随机12肽库中，筛选到12个噬菌体阳性克隆：结论：获得了具有模拟胃癌相关抗原表位的阳性噬菌体克隆，且有共同的基序。     

单纯疱疹病毒糖蛋白模拟位的研究

目的 为了充分认识单纯疱疹病毒（HSV）糖蛋白的抗原表位，寻找HSV多组分疫苗和新型基因工程疫苗更有效的小片段短肽作为该病毒疫苗的备选免疫原。方法 利用有动物保护活性的抗HSV糖蛋白C（gC)单克隆抗体（McAb)1A12淘筛噬菌体随机12肽库，经4轮筛选后进行ELISA检测，随机挑取14个阳性克隆进行序列测定，序列比较后得到保守序列，做ELISA阻断实验进一步鉴定筛选结果并与相关天然蛋白HSV gC进行序列比较。结果 获得保守序列－SG（L）RHII－和其侧翼辅助序列－AK－、－VW－，其与天然相关蛋白HSV gC114-116位氨基酸十分相似。携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合，并可部分阻断抗体与HSV囊膜抗原的反应。结论 所筛选到的保守序列可模拟McAb针对的抗原表位，可能是HSV的替代抗原。这一研究方法有望使短肽替代庞大的糖蛋白全长氨基酸序列，为研制更有效及更广谱的基因工程疫苗提供依据，也使研制基于抗原表位水平的特异诊断试剂成为可能。     

Ulinastatin Preconditioning Attenuates Inflammatory Reaction of Hepatic Ischemia Reperfusion Injury in Rats via High Mobility Group Box 1(HMGB1) Inhibition

Objective It has been found that ulinastatin (UTI) can attenuate hepatic injury in a rat model of ischemia reperfusion (IR), but the specific mechanism is unclear. This study aims to investigate possible pathomechanism of ulinastatin in reducing the inflammatory response after hepatic IR.Methods A male sprague-dawley(SD) rat model of hepatic ischemia reperfusion injury was used. The rats were randomly divided into 4 groups on average, which were 0.9% saline and IR group as control, ulinastatin preconditioning (UPC) group, UPC+rHMGB1 (recombinant HMGB1) group and UPC +anti-HMGB1 group. Serum aminotransferases, TNF-α, IL-1 and Myeloperoxidase (MPO) levels were measured. Histopathology examination and apoptotic cell detection and the different expression of HMGB1 protein were also assessed.Results Serum levels of aminotransferases, cytokines and hepatic MPO in UPC and UPC+anti-HMGB1 groups were significantly lower than those in control group (p<0.05). Decreased histologic damage and apoptosis were also seen in these two groups (p<0.05).Conclusions HMGB1 expressions in UPC and UPC+anti-HMGB1 groups were significantly lower than those in the two control groups (p<0.05), pretreatment with ulinastatin attenuated liver IR injury by reducing HMGB1 expression through its anti-inflammatory effects.     

噬菌体展示ICAM-1模拟肽的制备及活性鉴定

目的：获得具有生物学活性的细胞间黏附分子-1（ICAM-1）模拟肽。方法：以噬菌体扩增及PEG沉淀法，大量制备展示十二肽P1，P2的噬菌体，采用ELISA，竞争抑制试验及免疫组化染色法，分别鉴定P1，P2模拟ICAM-1分子的结合特性及生物学活性。结果：噬菌体展示肽P1，P2能与抗ICAM-1单克隆抗体（mAb)15.2特异性结合，该结合作用可被ICAM-1分子竞争性抑制，P1，P2能模拟ICAM-1分子与LFA-1结合的功能。结论：噬菌体展示的短肽P1，P2具有天然ICAM-1的生物学活性。     

Identification of Peptide Sequences Specific for Serum Antibodies from Human Papillomavirus-Infected Patients Using Phage Display Libraries

Three random phage display peptide libraries were screened with sera from human papillomavirus (HPV)-infected patients to characterize the specificities of antibodies present in patients' sera and to identify molecules that correspond to or mimic natural epitopes; 141 phage clones were randomly selected in three rounds of bioselection and their binding properties were analyzed in ELISA using sera from 36 patients with confirmed HPV 16 infection and 24 healthy control female blood donors. Sixteen of 36 (44%) patients' sera reacted with at least 1 phage clone, and only 2 of 24 female donors' sera showed positive reaction with 1 of the selected clones. We conclude that the combination of various disease-specific epitopes generated by screening of phage display peptide libraries may potentially lead to a multicomponent diagnostic assay for the early detection of HPV infection and precancerous cervical lesions, making possible the prevention of one of the most common cancers in women.