低温保存条件下人肝细胞钙超载途径的研究

细胞内钙超载是导致细胞缺血再灌注损伤的主要原因,对人肝细胞低温保存下钙超载途径的研究报道不多,现有的研究中,对钙超载的途径尚无统一认识。本实验针对这一问题进行了探讨。一、材料和方法1.成人肝细胞的分离和培养:临床行同种异体肾移植时,联合切取肝脏,以4℃ＵＷ液保存。切取灌洗较好的肝叶组织于培养皿中,用剪刀将组织剪碎,收集于锥形瓶中,加入胶原酶10ｍｌ,37℃水浴消化。取出细胞悬液,400μｍ滤网过滤,滤液吹打后加入红细胞裂解液3ｍｌ,1000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,弃上清液,加入保存液10ｍｌ,吹打均匀,37℃孵箱保存。取1ｍｌ细胞悬…     

成人肝细胞分离及低温保存的研究

我们采用改进的胶原酶灌注技术 ,获取分离的成人肝细胞 ,并研究威斯康星 (ＵＷ )保存液对细胞活力和ＡＴＰ贮存的影响 ,现将结果报道如下。一、材料与方法1.主要试剂 :Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、ＤＮＡ酶Ｉ、4 2 羟乙基 1哌嗪乙磺(ＨＥＰＥＳ)均购自Ｓｉｇｍａ公司 ,离解酶(Ｄｉｓｐａｓｅ)Ⅱ型购自Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ公司 ,小牛血清为Ｇｉｂｃｏ产品。2 .分离方法 :成人肝脏取自脑死亡供体 ,采用腹部多器官联合快速切取技术获取 ,ＵＷ液低温灌洗。切取灌洗较好的肝叶组织 60～ 80ｇ(1个切面 ,保留3～ 4支血管行插管 ) ,ＵＷ液 0～ 4℃保…     

低温保存下异搏定对人肝细胞保护作用的实验研究

我们应用钙离子通道阻滞剂异搏定 (ＶＰ)保存成人分离培养的肝脏细胞 ,研究异搏定的保护作用机制 ,明确异搏定的具体作用途径。一、材料和方法1.成人肝脏细胞的分离和培养 :临床行同种异体肾移植时联合切取肝脏 ,以 4℃ＵＷ液 (ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓ ｃｏｎｓｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ)保存 1ｈ。切取肝叶组织 ,剪碎 ,加入胶原酶消化。取出细胞悬液过滤 ,滤液离心弃上清 ,加入ＵＷ液保存。台盼蓝染色 ,计数细胞存活率。2 .细胞内钙的测定 :(1)将肝细胞悬液分为 2组 ,每组又分为 4个小组(ｎ =5 ) ,第 1组分别为含 0ｍｍｏｌ/ＬＣａＣｌ…     

钙超载对低温保存肝脏细胞的损伤作用

目的探讨钙离子对肝脏的损伤作用.方法应用含胶原酶保存液灌注大鼠肝脏制成不同细胞成活率的肝细胞悬液,低温保存肝脏细胞.应用Fura-2/AM标记测细胞内钙. 结果①低温保存2小时肝细胞 实验1组(细胞成活率为5%)肝细胞内钙值为(1055.0±30.79) nmol/L; 实验2组(细胞成活率为10%)肝细胞内钙值为(853.0±20.42) nmol/L; 实验3组(细胞成活率为30%)肝细胞内钙值为(616.0±13.20) nmol/L; 实验4组(细胞成活率为50%)肝细胞内钙值为(562.0±26.06) nmol/L; 实验5组(细胞成活率为70%～80%)肝细胞内钙值为(318.0±13.01) nmol/L; 实验6组(细胞成活率为90%)肝细胞内钙值为(114.6±6.11) nmol/L.②低温保存24小时肝细胞 实验A组(细胞成活率为10%)肝细胞内钙值为(1704.0±70.11) nmol/L; 实验B组(细胞成活率为50%)肝细胞内钙值为(1125.0±23.22) nmol/L.随着细胞成活率的降低,细胞内钙值逐渐升高; 在同样细胞成活率情况下,随着保存时间延长(2小时与24小时)细胞内钙值增高1倍左右.结论在低温保存过程中,钙超载是造成肝脏细胞缺血再灌注损伤的一个主要因素.     

肝细胞刺激生长因子及三种中药低温保存肝细胞的研究

加入血清较单用ＨａｍＦ１２低温保存肝细胞效果好。若再加入一定量的复方丹参、或清开灵或养气补血方剂提取液（Ｓ液），可使４℃５天冷贮存肝细胞的活细胞率达９０％以上，胞内ＡＬＴ外漏减少，并明显促进再培养肝细胞的增殖。此外，Ｓ液尚可明显提高再培养肝细胞的附壁率。以上药物的保护作用可能与减少脂质过氧化的产生有关。ＨＳＳ对肝细胞也有一定的冷缺血保护作用。     

低温保存-再灌注肝脏肝细胞凋亡与肝细胞糖原含量的关系及bax基因在其中的作用

目的　研究肝脏低温保存 再灌注期间肝细胞糖原含量与肝细胞凋亡之间的关系及bax基因在其中的作用。方法　制备糖原含量显著不同的 4组兔肝脏模型 ,根据给食方法的不同分为A组 (禁食 2 4h ,但自由饮水 )、B组 (标准实验室饮食 )、C组 (标准实验室饮食 +每 6h静脉滴注 2 5 %葡萄糖 3 0ml)及D组 (标准实验室饮食 +每 4h静脉滴注2 5 %葡萄糖 3 0ml) ,检测各组肝脏低温保存 再灌注期间肝细胞凋亡及bax基因蛋白的表达情况。结果　各组肝脏于低温保存 9h后再灌注 60min时 ,肝组织内可见明显的肝实质细胞凋亡现象 ,A、B、C、D 4组的凋亡细胞数量依次减少 ,4组间两两比较差异有统计学意义 ,各组肝细胞bax基因蛋白的表达程度与肝细胞糖原含量有密切的相关性。结论　肝脏低温保存 再灌注过程中 ,肝细胞内糖原能明显拮抗肝实质细胞凋亡的发生 ,其内在机理可能为肝细胞糖原通过抑制bax基因蛋白的表达从而达到拮抗肝实质细胞凋亡的发生。     

丹参对大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用

目的　研究丹参对大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用。方法　采用大鼠肝脏离体非循环灌注模型 ,观察乳酸林格液 (LR液 )中加入不同剂量丹参后保存大鼠肝脏 1 2h的效果。结果　丹参组 ( 60 0mg/g)肝组织ATP含量 ( 6.0 8± 0 .67) μmol/g及分泌胆汁量 ( 1 0 5.6± 1 2 .4) μl/h明显高于对照组 ( 2 .52± 0 .31 ) μmol/g及 ( 57.4± 8.2 ) μl/h(P <0 .0 5) ,丹参组 ( 60 0mg/g)肝组织 2 ,3 二羟苯甲酸 ( 2 ,3 DHBA) ( 0 .1 54± 0 .0 1 3)nmol/g、2 ,5 DHBA( 1 .354± 0 .0 68)nmol/g及流出液天门冬氨酸转氨酶 (AST) ( 38.4± 3.7)U/L明显低于对照组 ( 0 .2 4 5± 0 .0 2 1 )nmol/g、( 2 .1 0 5± 0 .0 97)nmol/g及( 76.4± 9.2 )U/L ,差异有显著性 (P <0 .0 5)。结论　丹参可明显提高供体肝脏的保存效果 ,其作用机理可能主要与改善低温保存肝脏的能量代谢及抗氧自由基的作用有关     

低温保存人肝细胞Na+/H+交换与细胞内钙和细胞活力的关系

我们通过阻滞Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋交换，观察低温保存肝细胞Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋通道的特点及其对细胞内Ｃａ＾２＋和细胞存活率的影响，现将结果报道如下。     

阿霉素预处理对大鼠肝脏低温保存损伤的保护作用

我们采用大鼠肝脏非循环灌注模型。探讨应用抗癌药阿霉素预处理(DPc)是否可以模拟缺血预处理的延迟保护作用，旨在减轻肝脏缺血一再灌注(I／R)损伤，为临床提供一种安全有效的预处理方法。     

人胎肝细胞分离与培养技术的研究

目的探讨分离及培养人胎肝细胞的最佳方法。方法比较两种灌流消化法对分离人胎肝细胞的效果，观察不同条件对体外培养人胎细胞生长及生存时间的影响。结果经腹主动脉及脐静脉双灌流消化法分离人胎肝细胞效果明显优于单纯经脐静脉灌流消化法，前者肝细胞获得率为(5.97±1.81)×108/kg体重，后者肝细胞获得率为(4.12±2.31)×108/kg体重(P＜0.05)。促肝细胞生长素对体外培养的人胎肝细胞生长和生存时间无明显影响，均在培养第10～14天开始变性、坏死。鼠尾胶可延长体外培养人胎肝细胞的生存时间达20～28 d。与球体细胞培养方法相结合，人胎肝细胞在体外生存时间延长至30～38 d。结论人胎肝细胞的分离应首选经腹主动脉及脐静脉双灌流消化法。人胎肝细胞在体外生存时间受培养条件的影响。     

Membrane stabilizing effects of calcium and taxol during the cold storage of isolated rat hepatocytes.

BACKGROUND: Calcium plays an important role in liver preservation and preservation induces depletion of cellular Ca. This may affect hepatocyte cytoskeleton integrity necessary for maintaining cell shape and organ viability. We tested the effects of a microtubular stabilizer (Taxol) in liver cell preservation. METHODS: Isolated rat hepatocytes were preincubated with or without a microtubule stabilizing agent, 100 microM Taxol, at 37 degrees C for 20 min, then stored in the University of Wisconsin (UW) solution +/-1.5 mM CaC12 at 4 degrees C for up to 48 hr. After storage, the cells were rewarmed in Krebs-Henseleit buffer with air at 37 degrees C for 1 hr. Morphological changes in the plasma membrane (scanning electron microscopy) and cell viability (percentage of lactate dehydrogenase [LDH] release) before and after rewarming were studied. RESULTS: Hepatocytes showed time-dependent increase in bleb formation (cytoskeleton disruption) during cold storage. Rewarming the cells caused even greater bleb formation and increased LDH release (cell death). Pretreatment of cells with Taxol and cold storage in the UW solution with 1.5 mM Ca suppressed both bleb formation and LDH release in 48-hr coldstored cells. CONCLUSIONS: Cold storage of hepatocytes leads to reperfusion injury and cell death. This can be suppressed with Taxol and Ca. This suggests that hypothermia induces changes in cellular Ca and a disruption of the microtubules, leading to loss of cell viability. Improved liver preservation may require suppression of Ca-dependent disruption of the cytoskeleton system of liver cells.     

钙通道阻滞剂对低温保存大鼠肝脏的保护作用

目的：研究钙通道阻滞剂是否减轻低温保存下肝细胞的钙超载并起到保护肝脏的作用。方法：低温保存大鼠肝细胞于不同时限,按保存液的不同成分分组：（1）对照组：DMEM液;（2）实验Ⅰ组：DMEM液＋Verapamil(维拉帕米）;（3）实验Ⅱ组：DMEM液＋Nifedipine(硝苯地平）;（4）实验Ⅲ组：DMEM液＋Diltiazem(硫氮卓酮）。用Fura-2法测定低温保存下的大鼠肝细胞内钙和肝功能,并在光镜和电镜下观察肝脏的结构。结果：细胞内钙及肝功能测定,各实验组与对照组差异显著;组织学观察,保存0－48h各实验组损伤明显低于对照组。结论钙通道阻滞剂对低温保存肝脏有保护作用,且三类药物中帕米作用最强,硝苯地平和硫氮卓酮次之。     

原代猪肝细胞培养体系及培养模式的初步探讨

目的探索一高密度、高效率的原代猪肝细胞培养方法,为生物人工肝的生物材料提供一种有效的培养模式.方法采用改良Seglen二步胶原酶灌注法分离肝细胞,分别将5×106的肝细胞加入胎牛血清、猪门静脉血清的培养体系中进行方瓶静止培养及聚球培养.结果肝细胞在接种后呈明显的Cytodex-3聚集趋势.门静脉血清培养体系中肝细胞的Albumin、Urea合成能力明显高于胎牛血清组.在培养后的前3周门静脉血清培养体系中聚球细胞模式优于微载体静止培养模式.结论与胎牛血清培养体系相比,猪门静脉血清培养体系更适合原代猪肝细胞高密度培养.聚球培养是一种较为理想的原代猪肝细胞培养模式.     

Improvement of the cold storage of isolated human hepatocytes

Increasing amounts of human hepatocytes are needed for clinical applications and different fields of research, such as cell transplantation, bioartificial liver support, and pharmacological testing. This demand calls for adequate storage options for isolated human liver cells. As cryopreservation results in severe cryoinjury, short-term storage is currently performed at 2-8°C in preservation solutions developed for the storage of solid organs. However, besides slowing down cell metabolism, cold also induces cell injury, which is, in many cell types, iron dependent and not counteracted by current storage solutions. In this study, we aimed to characterize storage injury to human hepatocytes and develop a customized solution for cold storage of these cells. Human hepatocytes were isolated from material obtained from partial liver resections, seeded in monolayer cultures, and, after a preculture period, stored in the cold in classical and new solutions followed by rewarming in cell culture medium. Human hepatocytes displayed cold-induced injury, resulting in >80% cell death (LDH release) after 1 week of cold storage in University of Wisconsin solution or cell culture medium and 3 h of rewarming. Cold-induced injury could be significantly reduced by the addition of the iron chelators deferoxamine and LK 614. Experiments with modified solutions based on the new organ preservation solution Custodiol-N showed that ion-rich variants were better than ion-poor variants, chloride-rich solutions better than chloride-poor solutions, potassium as main cation superior to sodium, and pH 7.0 superior to pH 7.4. LDH release after 2 weeks of cold storage in the thus optimized solution was below 20%, greatly improving cold storage of human hepatocytes. The results were confirmed by the assessment of hepatocellular mitochondrial membrane potential and functional parameters (resazurin reduction, glucagon-stimulated glucose liberation) and thus suggest the use of a customized hepatocyte storage solution for the cold storage of these cells.     

维拉帕米和Na+-K+通道阻滞剂对低温保存成人肝细胞能量代谢的影响

目的：研究维拉帕米及Na^ -K^ 通道阻滞剂四乙基胺,奎尼丁和阿米洛利对低温保存成人肝细胞能量代谢的影响和对细胞的保护作用。方法：用胶原酶消化法制备成人肝细胞,置于分别加入维拉帕米,四乙基胺＋奎尼丁＋阿米洛利,四乙基胺＋奎尼丁＋阿米洛利＋维拉帕米的保存液中保存,高效液相色谱仪检测各组肝细胞中ATP,ADP及AMP的含量,结果：在维拉帕米实验组,ATP水平在实验过程中始终高于低温保存对照组,前4个小时ADP平衡升高,以后逐渐减低,AMP呈缓慢升高趋势,至12h达峰值;总腺苷酸含量总体呈下降趋势,但平台期延长,下降缓慢,能量转换率的变化与总腺苷酸含量相似,在加用维拉帕米和Na^ -K^ 通道阻滞剂的联合用药组,ATP缓慢降低到初期的50％以下,ADP初期缓慢上升,4h后逐渐下降,AMP呈缓慢上升趋势;总腺苷酸含量和能量转换率均较维拉帕米组高,提示细胞的活性保持良好。结论：在低温存存成人肝细胞时加入维拉帕米和Na^ -K^ 通道阻滞剂可降低肝细胞的能量消耗,它们对细胞的保护具有协同作用。     

胎牛血清在体外培养肝细胞极性形成的作用

目的观察胎牛血清在体外培养肝细胞极性形成的作用。方法分别利用含胎牛血清和不含胎牛血清培养液培养成鼠肝细胞,并观察血清对肝细胞形态、特异性膜区域蛋白分布以及蛋白分泌的影响,以确定胎牛血清在体外肝细胞极性形成的作用。结果不含血清组,肝细胞形成肝板样结构,肝细胞膜区域蛋白特异性分布,肝细胞保持稳定的蛋白分泌并持续增长达2周之久。而含血清组肝细胞培养3d后,分化良好的小管样结构消失,肝细胞膜区域蛋白失去特异性分布,蛋白分泌逐渐减少。结论胎牛血清可阻止肝细胞极性的形成,对于肝细胞移植及生物人工肝支持具有重要意义。     

Significance of runaway calcium homeostasis in cultured cardiomyocytes in development of hypoxia,burnt serum—induced injury

ＴＢｕｒｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００３８，Ｃｈｉｎａ（ＣｈｉＬＸ，ＹａｎｇＺＣ，ＷａｎｇＸａｎｄＬｉＡ）Ｔｈｉｓｓｔ...     

丹仙康骨胶囊对培养成骨细胞影响的观察

目的：为了解补肾活血中药丹仙康骨胶囊对体外培养成骨细胞的作用。方法：应用透射电镜、MTT、对硝基苯磷酸盐法(PNPP)及骨钙素(BGP)含量放免测定法，观察丹仙康骨胶囊对成骨细胞超微结构、增殖与分化作用的影响。结果：丹仙康骨胶囊刺激(20mg／ml)的成骨细胞，ALP活性提高及骨钙素含量增多；透射电镜观察其细胞线粒体致密、游离核糖体增多、内质网丰富扩大增粗呈中等电子密度，而糖原溶解与脂肪空泡均较少。结论：丹仙康骨胶囊具有促进成骨细胞的代谢、增殖和分化的作用。     

细胞实验时异氟醚鼓泡给药法的可靠性

目的 评价细胞实验时异氟醚鼓泡给药法的可靠性.方法 取直径8.6 cm的大培养皿100个,每个大培养皿内置3个直径3.5 cm用于细胞培养的小培养皿,大培养皿置于37℃、5%CO2培养箱中.使用ABV-A麻醉机给药,氧气:氮气比为1:4,混合异氟醚后(鼓泡气),经人工鼻过滤,接21 G针头置于大培养皿中央底部持续鼓泡,气体流量与培养液容积比例为0.25 1L/min:80 ml.按鼓泡气异氟醚浓度将大培养皿随机分为10组(n=10),Ⅰ组～Ⅷ组鼓泡气异氟醚浓度分别为0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、2.0%、2.4%、3.2%和4.0%;Ⅸ组鼓泡气内未混合异氟醚;Ⅹ组未通人气体.Ⅰ组～Ⅷ组分别于鼓泡通气5、10、15、30、60和120 min时(T1～6)于小培养皿的底部取细胞培养液7 ml,采用气相色谱法测定异氟醚浓度.结果 与T3时比较,Ⅰ组～Ⅷ组T1,2时异氟醚浓度降低(P<0.05),T4～6时差异无统计学意义(P>0.05);异氟醚浓度(Y)与鼓泡气异氟醚浓度(X)直线回归方程为Y=1.5 652X-0.1 252.结论 细胞实验时鼓泡给药法可提供稳定、可靠的异氟醚浓度.     

肌细胞生成素在分化培养人体肌卫星细胞表达的研究

目的 研究肌细胞生成素(myogenin)在人体肌卫星细胞分化培养中的表达规律，探索肌细胞生成素在肌卫星细胞分化中的作用。方法 取6例正常成人的骨骼肌，消化、分离肌卫星细胞，肌卫星细胞生长培养后进行分化培养。在分化培养过程中，观察肌卫星细胞形态，计算其融合率，应用半定量RT—PCR技术检测细胞总RNA中肌细胞生成素mRNA的表达量。结果 在肌卫星细胞分化培养过程中，肌细胞生成素mRNA的表达增加，其规律与肌卫星细胞分化、融合相一致。结论 肌细胞生成素参与人体肌卫星细胞分化过程。