不同种株利什曼原虫的比较蛋白质组学分析

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质表达状况。方法制备杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白,以pH范围3-10的预制胶条进行双向电泳(2-D),考马斯亮蓝染色,PDQust软件分析凝胶,主要差异蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白均获近700个蛋白点,不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质2-D图谱中,14蛋白点呈恒定差异表达,从中鉴定出10个功能明确的蛋白质,分别具有下列生物功能:糖代谢与磷脂合成(烯醇酶、变旋酶、NADP依耐乙醇脱氢酶、乙醇胺磷酸胞苷酸转移酶),压力反应(细胞内过氧化物酶、锥虫还原蛋白过氧化物酶),细胞膜/细胞骨架(α-微管蛋白、β-微管蛋白),核酸代谢(琥珀酰辅酶A连接酶(GDP形成)、内源性RNA酶L-PSP(pb5)),细胞周期与增殖(延伸因子2)。结论不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质的表达存在不同,为理解不同种株利什曼原虫的毒力、免疫原性和代谢特征提供了新的视角。     

利什曼原虫胞内寄生相关基因的研究

利什曼病是由利什曼原虫无鞭毛体寄生在包括人在内的哺乳动物巨噬细胞而引起的疾病,由杜氏利什曼原虫引起的内脏利什曼病若不治疗则会致命.研究者对寄生在白蛉属消化道内的前鞭毛体和寄生在巨噬细胞内的无鞭毛体胞内高表达基因或蛋白进行研究,筛选出一些特异基因,为利什曼原虫疫苗候选抗原的确定和靶作用药物的确定提供了科学依据.     

利什曼原虫胞内寄生相关基因的研究

利什曼病是由利什曼原虫无鞭毛体寄生在包括人在内的哺乳动物巨噬细胞而引起的疾病,由杜氏利什曼原虫引起的内脏利什曼病若不治疗则会致命.研究者对寄生在白蛉属消化道内的前鞭毛体和寄生在巨噬细胞内的无鞭毛体胞内高表达基因或蛋白进行研究,筛选出一些特异基因,为利什曼原虫疫苗候选抗原的确定和靶作用药物的确定提供了科学依据.     

利什曼原虫胞内寄生相关基因的研究

利什曼病是由利什曼原虫无鞭毛体寄生在包括人在内的哺乳动物巨噬细胞而引起的疾病,由杜氏利什曼原虫引起的内脏利什曼病若不治疗则会致命.研究者对寄生在白蛉属消化道内的前鞭毛体和寄生在巨噬细胞内的无鞭毛体胞内高表达基因或蛋白进行研究,筛选出一些特异基因,为利什曼原虫疫苗候选抗原的确定和靶作用药物的确定提供了科学依据.     

杜氏利什曼原虫23kDa抗原编码基因克隆的表达

将已建立的杜氏利什曼原虫ｃＤＮＡ文库基因,亚克隆于ｐＵＣ１８质粒载体,诱导表达筛选两个克隆,即Ｐ１、Ｐ２,表达的蛋白分子量皆为２３ｋＤａ,Ｐ１克隆表达的２３ｋＤａ蛋白分子,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析显示,可被兔抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体抗血清及内脏利什曼病病人血清识别。     

杜氏利什曼原虫23kDa抗原编码基因克隆的表达

将已建立的杜氏利什曼原虫 c DNA文库基因 ,亚克隆于 p UC18质粒载体 ,诱导表达筛选两个克隆 ,即 P1、P2 ,表达的蛋白分子量皆为 2 3k Da,P1克隆表达的 2 3k Da蛋白分子 ,经 Western blot分析显示 ,可被兔抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体抗血清及内脏利什曼病病人血清识别     

杜氏利什曼原虫39kDa抗原基因结构的初步研究

目的 :探讨杜氏利什曼原虫 39k Da抗原基因的结构。方法 :将表达杜氏利什曼原虫 39k Da抗原肽段的重组噬菌体中插入 DNA片段亚克隆人质粒载体 p UC18中 ,并对插入片段进行限制性内切酶谱分析。结果 :插入片段大小近 1.3kb,其 3 端含有单一的 kpn I、Xba I、Hinc 和 Pst 识别位点 ,表明该片段为一非重复序列结构。     

微小牛蜱Bm86基因的原核表达与表达条件的优化

根据微小牛蜱Bm86基因序列设计引物,在重组质粒pMD18-T-Bm86中克隆,并将其定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）株,用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在不同时间进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测结果表明,37 ℃条件下经1 mmol/L IPTG诱导8 h后,目的重组蛋白表达量最大,表达相对分子质量（Mr）约为94 000的包涵体蛋白,与预期大小一致,目的蛋白约占蛋白总量的29%。蛋白质印迹（Western blotting）分析表明,该重组蛋白可被兔抗微小牛蜱全蜱阳性血清所识别。     

日本血吸虫SjPP基因重组杆状病毒的构建和在昆虫细胞中的表达

目的 在昆虫细胞中表达获得可溶性的日本血吸虫SjPP重组蛋白。 方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,通过RT-PCR扩增出SjPP基因的编码区序列,将其定向克隆到供体质粒pFastBac HT-B中,构建重组杆状病毒供体质粒pFastBac-SjPP,转化入大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组杆粒Bacmid-SjPP,用阳离子脂质体法转染粉纹夜蛾（TN5B1-4）细胞。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白表达情况。 结果 构建了含日本血吸虫SjPP基因的重组杆粒Bacmid-SjPP,转染TN5B1-4细胞后,获得有感染力的重组杆状病毒,并在TN5B1-4细胞中成功表达SjPP蛋白。该重组蛋白可被抗SjPP蛋白的兔血清识别。 结论 成功构建SjPP基因重组杆状病毒,并在TN5B1-4细胞中表达,该蛋白具有良好的抗原性。     

隐孢子虫和羊隐孢子虫病的研究进展

隐孢子虫病是一种全球性的人兽共患病。羊隐孢子虫病在世界各地均有报道,严重威胁着人类和动物的健康。本文对羊隐孢子虫病的病原分类、流行病学、临床症状和病理变化进行综述。     

亚洲带绦虫烯醇化酶基因的原核表达、鉴定与组织定位

目的 表达亚洲带绦虫（Taenia asiatica,Ta）成虫烯醇化酶（enolase,ENO）基因,并对其进行组织定位和免疫反应性分析。 方法 通过大规模测序从亚洲带绦虫cDNA文库中确定ENO基因,PCR扩增目的片段,将其克隆至表达质粒pET-30a（+）,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）观察重组蛋白的表达情况,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化重组蛋白,蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组蛋白的免疫反应性。将重组蛋白免疫SD大鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体水平,间接免疫荧光检测确定ENO在亚洲带绦虫成虫组织中的定位。 结果 PCR、双酶切和DNA测序结果均表明,重组质粒pET-30a（+）-TaENO构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白TaENO的相对分子质量（Mr）为47 000。经亲和层析获高纯度的蛋白,蛋白浓度为0.37 mg/ml。重组蛋白TaENO能被SD大鼠抗血清、感染亚洲带绦虫的猪血清和患者血清识别。间接免疫荧光检测结果显示,TaENO主要定位于成虫的表膜。 结论 纯化后的亚洲带绦虫成虫烯醇化酶重组蛋白具有较强的免疫反应性,烯醇化酶主要定位于成虫表膜。     

雄性激素抑制感染杜氏利什曼原虫的巨噬细胞的凋亡

目的：研究雄性激素对Ｃ５７ＢＬ／６ｊ雌性小鼠骨髓巨噬细胞凋亡的影响。方法：溴化丙锭染色及透射电镜观察凋亡特征性形态学变化。来自雄性激素和油处理过的小鼠骨髓巨噬细胞分别用杜氏利什曼原虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｄｏｎｏｖａｎｉ）攻击２４ｈ后,检测特征性的ＤＮＡ凋亡梯形。结果：在培养基中去掉Ｍ－ＣＳＦ后可以诱导骨髓巨噬细胞的凋亡。ＤＮＡ片段电泳提示：①在雄性激素和油处理组间凋亡细胞的量没有区别,然而②经杜氏利什曼原虫攻击后,雄性激素处理组的凋亡细胞数明显低于油处理组。结论：雄性激素可以抑制感染了杜氏利什曼原虫的巨噬细胞的凋亡,不感染利什曼原虫时,这种抑制作用并不出现。雄性激素对骨髓巨噬细胞凋亡的抑制作用可能在雄性激素诱导的免疫抑制作用中发挥着重要的作用     

按蚊TEP1基因与硝喹诱导疟原虫卵囊黑化反应的相关性

目的 对斯氏按蚊TEP1基因与抗疟药硝喹诱导约氏疟原虫卵囊黑化反应的相关性进行初步研究。 方法 斯氏按蚊吸血感染约氏疟原虫后,随机分为两组（各300只）,A组喂饲含0.1%硝喹蔗糖水,B组喂饲10％蔗糖水。另设正常对照组（C组）,常规蔗糖水饲养。分别于用药后第1、2、3和4天,取各组雌蚊的血淋巴（各50只）,提取cDNA模板,设计引物,克隆斯氏按蚊TEP1基因,用荧光定量PCR检测TEP1基因在抗疟药硝喹诱导下的变化;同时解剖各组雌蚊（各25只）,光镜观察约氏疟原虫卵囊的黑化情况,分析TEP1基因与抗疟药诱导的黑化反应的关系。结果 成功克隆TEP1基因,推测其氨基酸序列含有TEP分子高度保守的硫酯序列区（GCGEQ）。荧光定量PCR检测结果显示,抗疟药硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因表达上调,于诱导后第3天,A组的TEP1基因相对表达量为2.423,是B组（1.036）的2.5倍,两者差异有统计学意义（P<0.05）。相同时点,光镜观察显示,A组蚊经硝喹诱导后的约氏疟原虫卵囊出现黑化现象,黑化率约14.0％,而B组则未发现有黑化现象。 结论 抗疟药物硝喹可诱导斯氏按蚊TEP1基因上调,该基因与约氏疟原虫卵囊黑化相关。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的 克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因。 方法 PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L.d.SC10H2与四川南坪犬株L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因，将该基因导入pcDNA3.1（+），构建真核表达重组质粒，转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达；RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达。 结果 2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因，同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting，在相对分子质量（Mr）约20 000处检测到阳性杂交信号，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。 结论 获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L.d.SC10H2和L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因序列，并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1( ),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒构建

目的 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。方法 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒载体pcDNA3.1（＋）,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。结果 扩增出大小约550bp的无鞭毛体蛋白基因;重组质粒pcDNA3.1-amastin经鉴定正确。结论 成功构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。