慢性HBV感染者肝脏HBV cccDNA含量相关因素分析

目的探讨慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA含量与血清病毒标志物、HBV DNA及肝脏病理分级的关系,为临床评价抗病毒治疗效果及疗程确定提供理论依据。方法以2007年5月-2008年2月住院的30例慢性HBV感染者为研究对象,应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测患者肝组织中HBV cccDNA、肝组织总HBV DNA（HBV tDNA）和血清HBVDNA,同时用化学发光免疫分析法检测HBsAg、HBeAg定量,分析感染者肝组织内HBV cccDNA与肝组织内HBV DNA、血清HBVDNA、HBsAg及HBeAg定量水平之间的关系,并比较肝组织中HBV cccDNA含量与肝脏病理炎症和纤维化分级的关系。采用Pear-son简单相关和Spearman等级相关法进行相关性分析。结果 30例慢性HBV感染者肝组织中均可检出HBV cccDNA,范围在3.15×103～1.06×107拷贝/mg;肝组织cccDNA定量与肝组织总HBV DNA定量呈正相关（r=0.375,P〈0.05）,与血清HBV DNA无相关性（r=0.174,P〉0.05）;肝组织中HBV cccDNA水平与血清HBsAg定量呈高度正相关（r=0.562,P〈0.001）,而与血清HBeAg定量无相关性（r=0.152,P〉0.05）。肝组织cccDNA定量与肝组织炎症活动度（G）及纤维化程度（S）无相关性（r=0.082,P〉0.05）。结论慢性HBV感染者肝组织内HBV cccDNA成稳定的中等水平复制;血清HBV DNA载量不能直接代表其肝组织中的HBV cccDNA水平;血清HBsAg定量可作为反映肝组织中HBV cccDNA水平的指标。     

慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA、总HBV DNA与血清HBV DNA的相关性及其与临床的关系

目的探讨慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）、肝组织总HBV DNA（HBV tDNA）与血清HBV DNA之间的相关性及其与临床的关系。方法 78例慢性乙型肝炎患者入选本研究。肝组织β- globinDNA、HBV cccDNA和HBV tDNA采用实时荧光定量PCR方法检测,平均每个肝细胞HBV cccDNA和HBV tDNA含量（拷贝/cell）=HBV cccDNA（实测值）/β-globin DNA（实测值）和HBV tDNA（实测值）/β3-globin DNA（实测值）,肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA含量的计算单位定义为log₁₀拷贝/10⁶cell;采用实时荧光定量PCR、ELISA法检测血清HBVDNA和HBV标志物;采用免疫组织化学方法检测肝细胞中HBsAg和HBcAg的表达。统计分析采用pearson相关分析及t检验。结果 （1）肝组织HBV cccDNA与HBV tDNA定量呈正相关（r=0.696,P<0.001）;肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0.304,P<0.01）;肝组织HBV tDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0.341,P<0.01）;（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义和（P均>0.05）;（3）肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义（P>0.05）;（4）HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者,且差异有统计学意义（P<0.05）;HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量与HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者比较差异均无统计学意义（均P>0.05）;（5）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA以及血清HBV DNA三者与肝脏炎症活动度及纤维化程度均无显著相关性（P>0.05）。结论 （1）血清HBV DNA定量结果并不一定能完全反映患者肝组织中HBV cccDNA和HBV tDNA含量,尤其在血清HBV DNA<500拷贝/mL时,肝组织中仍存在HBV cccDNA和HBV tDNA,且含量大小不等。（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性或者HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量均明显高于阴性患者;而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量均没有显著差异;（3）HBeAg（+）/抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）/抗-HBe（+）患者,而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA均没有显著差异;（4）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA及血清HBV DNA与肝脏炎症活动度和纤维化程度均无显著相关性。     

恩替卡韦对慢性乙型肝炎患者HBV cccDNA的影响

目的评价恩替卡韦治疗2年对慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者血清及肝细胞内HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）水平的影响。方法选择112例恩替卡韦治疗2年的慢乙肝患者,比较治疗前后血清HBV DNA、HBV cccDNA的变化。同时比较其中12例具备治疗前后肝活检标本患者的肝细胞内HBV cccDNA水平的变化。结果治疗2年后,112例患者中有96例（85．71％）血清HBV DNA低于500 copies／ml,所有患者血清中均检测不到HBV cccDNA。12例患者肝细胞内均可检测到HBV cccDNA,且与治疗前相比元明显下降。结论恩替卡韦治疗可有效抑制HBV复制,但不能清除肝细胞内的HBV cccDNA,停药后仍有病毒反弹的可能。     

荧光定量检测HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者中的应用

目的:研究慢性乙型肝炎患者HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)在外周血的分布、肝组织中含量及探讨抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA的影响。方法:随机选取HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者、重型肝炎患者共125例。使用实时荧光定量PCR法检测血清中cccDNA。选取36例慢性乙型肝炎患者肝组织和外周血样本,酶切后进行荧光定量PCR检测。60例慢性乙型肝炎患者,按1:1随机分配接受拉米夫定或干扰素治疗,所有患者均治疗24周以上;应用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测慢性乙型肝炎患者0周、8周、12周、24周、HBV cccDNA及HBV DNA含量。结果:125例患者中cccDNA阳性率为71.2%,以肝硬化患者阳性率最低。肝硬化患者HBVcccDNA检出阳性率与慢性乙型肝炎患者及重型肝炎患者比较,差异有显著性意义(P0.05)。肝组织中HBV cccDNA与肝组织总HBV DNA及血清HBV DNA存在相关性(P0.05),HBeAg阳性组与阴性组患者比较差异有显著性意义(P0.05)。患者接受抗病毒治疗后血清HBV DNA及HBV cccDNA下降。结论:乙型肝炎肝硬化患者外周血HBV cccDNA阳性率低,慢性乙型肝炎患者中HBeAg(+)组病毒复制较HBeAg(-)组活跃。抗病毒治疗对血清HBV cccDNA有抑制作用;血清HBV cccDNA可作为抗病毒治疗的重要监测指标。     

HBV感染恢复期血清标志物与肝细胞HBV cccDNA检测对照

目的:了解肝组织乙肝病毒共价闭合环状脱氧核糖核酸(HBV cccDNA)与血清HBV复制指标的关系,以探索判定抗HBV的疗程终结点的观察方法。方法:既往HBV感染者、乙型肝炎肝硬化肝癌及慢性乙型肝炎(CHB)患者各13例,将血清HBV DNA、HBV-M及肝组织HBV cccDNA检测结果进行对照。结果:肝硬化肝癌及CHB患者抗-HBe阳性分别为12例和9例,血HBV DNA阳性分别为6例和8例,肝细胞HBV cccDNA均阳性;既往HBV感染13例中,HBsAg阴性,抗-HBs和/或抗HBc阳性各7和6例,有3例肝细胞中HBV cccDNA阳性。抗-HBs阳性的7例肝细胞HBV cccDNA阴性,抗-HBe阳性及抗HBs合并抗-HBe阳性者,肝细胞HBV cccDNA分别为105拷贝/ml和103拷贝/ml,与抗-HBs阳性组对照,t=4.5、4.0(P均<0.01),差异有非常显著性意义。CHB患者核苷类治疗后全应答,肝组织HBV cccDNA仍均为阳性。结论:抗-HBs阳性HBV感染后恢复期血清,肝组织HBV cccDNA阳性比率明显低于CHB抗HBe阳性HBV DNA阴性病例。抗病毒治疗CHB的终点,应是血清抗-HBs阳性的出现。     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与松弛环状DNA对核苷(酸)类药物耐药变异的比较

目的 了解肝细胞内HBV共价闭合环状DNA( HBV cccDNA)核苷(酸)类药物耐药变异的情况,并比较其与松弛环状DNA(rcDNA)耐药变异的异同.方法 取40例慢性HBV感染肝移植患者的部分肝组织,采用十二烷基硫酸钠-蛋白质沉淀法结合DNA提取试剂盒分离提取肝内的HBV cccDNA和rcDNA.将抽提产物用不降解质粒的ATP依赖DNA酶酶切纯化后,用跨HBV基因组双链缺口并涵盖常见核苷类耐药位点(rt169～rt250)的引物行单轮PCR或套式PCR选择性扩增cccDNA.另用不跨双缺口的引物PCR扩增肝组织内的HBV rcDNA和患者肝移植术前的血清HBV rcDNA.用直接测序法对上述扩增产物进行基因测序并分析核苷(酸)类药物耐药位点的检出情况.结果 40例患者中,31例肝组织内检测到HBV cccDNA,35例肝组织检测到HBV rcDNA,21例肝移植术前血清中检测到HBV rcDNA.测序结果显示,2例肝组织内cccDNA、rcDNA和血清rcDNA均检测到rtM204Ⅰ变异;有2例患者肝内cccDNA、rcDNA分别存在rtM204Ⅰ、rtQ215H变异,而血清rcDNA未检测到相应变异;3例血清中分别存在rtM204V、rtM204V、rtV173L+ rtL180M+rtM204V变异,而肝内cccDNA和rcDNA未检测到相应变异.结论 慢性HBV感染者肝细胞内cccDNA可出现核苷(酸)类药物耐药变异,且肝组织内的cccDNA、rcDNA耐药变异株与血清中的rcDNA耐药变异株不完全一致.     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞及肝组织中HBV cccDNA定量检测

目的优化HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)特异性定量检测方法,并观察HBV cccDNA在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中的分布情况。方法标本抽提核酸后,以不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)进行酶切,再以跨双缺口的特异性引物进行荧光PCR定量检测HBV cccDNA;用10份HBV高滴度(10~7拷贝/mL)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证此检测方法的特异度和灵敏度;取慢性乙型肝炎患者PBMC和肝组织穿刺标本各50份,检测其总HBV DNA和cccDNA。结果10份血清标本均无假阳性cccDNA检测结果,灵敏度可达到10~3拷贝/mL。所有PBMC中cccDNA检测均阴性;所有肝组织中总HBV DNA和cccDNA检测均阳性,总HBV DNA含量为3．19×10~2～6．69×10~7拷贝/μg人基因组DNA,cccDNA含量为7．32×10~0～6．51×10~6拷贝/μg人基因组DNA,同一患者肝组织中总HBV DNA含量是cccDNA含量的10．7倍至9．2×10~5倍。结论本方法特异度和灵敏度高。PBMC不能支持HBV的复制。在慢性乙型肝炎患者的肝组织中均可检测到cccDNA,但其水平并非与细胞内总HBV DNA水平正相关。     

恩替卡韦、干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者肝组织内HBV cccDNA变化差异及相关性分析

目的定量检测肝组织内HBV cccDNA、总HBV DNA及血清总HBV DNA,分析干扰素、恩替卡韦治疗对肝组织内HBV cccDNA的影响。方法从慢性乙型肝炎抗病毒治疗研究中选择40例HBe Ag阳性病例,其中24例接受恩替卡韦治疗,16例接受干扰素治疗,收集患者治疗前后血清总HBV DNA、生化学及病毒学数据,并收集治疗前后肝穿刺活检标本,定量检测肝组织内HBV cccDNA、总HBV DNA。均值比较采用t检验,目标变量与观察变量之间的相关分析采用偏相关分析。结果肝组织内HBV cccDNA(log10拷贝/ml)在恩替卡韦组基线为5.08±1.15,治疗后为3.80±0.85;在干扰素组基线为6.84±0.93,治疗后为6.02±1.27,两组基线值比较,差异无统计学意义(P=0.050);治疗后恩替卡韦组明显低于干扰素组(P=0.004)。肝组织内总HBV DNA(log10拷贝/ml)在恩替卡韦组基线为6.42±0.80,治疗后为4.83±1.08;在干扰素组基线为6.84±0.93,治疗后为6.02±1.27,两组基线值比较,差异无统计学意义(P=0.134);治疗后恩替卡韦组明显低于干扰素组(P=0.003)。肝组织内HBV cccDNA下降百分率与治疗后HBe Ag有显著相关性(R2=0.183)。恩替卡韦及干扰素对HBV复制指数的影响差异无统计学意义(P=0.210)。结论 HBe Ag阳性的慢性乙型肝炎患者,恩替卡韦和干扰素治疗均能显著降低肝组织内HBV cccDNA含量,恩替卡韦效果更好。     

HBV cccDNA的检测及其意义

乙型肝炎病毒cccDNA在感染者肝内长期存在,并作为HBV复制的模板,成为根治乙型肝炎病毒感染的困难所在。因此,准确地检测肝内和/或血清HBV cccDNA的量对病情判断、疗效评估和预后均有重要的意义。本文就近年发展的检测HBV cccDNA的方法学作一介绍。     

应用滚环扩增技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究

目的 应用滚环扩增(RCA)技术检测HBV共价闭合环状DNA(cccDNA),观察该方法的特异性和敏感性.方法 以HBV全基因质粒为模板,经酶切、连接、浓缩、胶回收纯化等步骤,构建和制备HBV cccDNA标准品.抽提7例慢性乙型肝炎患者肝组织总DNA,进行滚环扩增.用HBV cccDNA标准品、3.2 kb线性HBV DNA、健康肝组织总DNA及15例慢性乙型肝炎患者血清总DNA作为对照,验证此方法的特异性.将HBV cccDNA标准品进行系列稀释,了解该方法的敏感性.结果 成功构建了HBV cccDNA,并可用RCA方法进行扩增.RCA方法可从2 mg的慢性乙型肝炎患者肝组织中检测到HBV cccDNA,并可检测低至1×102拷贝/μL的HBV cccDNA.RCA方法不能检测3.2 kb线性HBV DNA,在健康肝组织及15例慢性乙型肝炎患者血清中亦检测不到HBV cccDNA.结论 RCA方法操作较方便,具有很高的特异性和敏感性.     

54例慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与血清HBsAg定量检测结果分析

目的 检测慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)和血清HBsAg,分析两种定量指标之间及其与血清HBV DNA载量的相关性.方法 应用PSAD消化+滚环扩增+跨缺口实时荧光PCR方法,定量检测54例慢性乙型肝炎患者甲醛固定石蜡包埋肝组织HBV cccDNA水平;用化学发光试剂定量检测患者血清HBsAg.用Pearson检验及直线回归分析方法 对数据进行分析.结果 患者肝组织HBV cccDNA与血清HBsAg定量水平之间呈正相关(r=0.459,P＜0.01),但与血清HBV DNA载量相关性无统计学意义;血清HBsAg定量水平与血清HBV DNA载量呈正相关(r=0.328,P＜ 0.05),与病毒复制效率呈负相关(r=-0.373,P＜0.05).结论 慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA载量与血清HBsAg定量水平相关,结合血清HBVDNA定量检测,可以更全面的反映HBV的复制水平,评价抗病毒疗效.     

血清HBV RNA在临床应用中尚未解决的关键科学问题

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染导致的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)难以完全治愈,其根本原因是肝内共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)持续稳定存在。血清HBV RNA作为cccDNA的下游转录产物,近年越来越多研究表明可用于监测CHB患者的疾病进展和预测预后。为了更好地了解血清HBV RNA,本文梳理了当前尚未解决的三个关键科学问题,包括血清HBV RNA的检测方法学、血清HBV RNA反映cccDNA状态的能力以及HBV RNA与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生、发展的关系,旨在进一步挖掘血清HBV RNA的临床价值。     

HBsAg阳性慢性肝病患者肝组织HBV DNA分子状态与血清HBV标志物关系的研究

采用分子杂交技术对28例慢性肝病患者进行肝组织和血清HBV对比研究,结果表明:①肝组织HBV DNA阳性率显著高于血清HBV DNA阳性率,②血清DNA-P反映乙肝病毒的早期复制;③血清HBeAg阴性、Anti-HBe阳性时肝组织内可发现游离型HBV DNA及小片段DNA,表明肝内HBV正处于活跃复制状态,从分子水平证实了Anti-HBe阳性时部分患者可有传染性,需积极有效治疗:④慢迁肝和慢活肝中发现整合型HBV DNA较少,提示慢活肝经治疗后有希望达到从肝内清除乙肝病毒的目的。另外,也提示乙肝病毒在肝内的复制状态与病理损伤无直接关系。     

HBV核心相关抗原替代共价闭合环状DNA成为一种新的标志物

正【据《Liver Int》2016年12月报道】题:HBV核心相关抗原替代共价闭合环状DNA成为一种新的标志物(作者Wong DK等)HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)是慢性HBV持续感染的重要标志。血清HBV核心相关抗原(HBcrAg)是一种乙型肝炎的新型标志物。来自香港大学的Wong等旨在研究HBcrAg是否能成为肝内cccDNA的替代标志物。分析138例接受核苷类药物治疗乙型肝炎患者的305份肝活组织检查标本及相应的血清。124例患者有2份标本,分别为基线和治疗1年后,43例患者还有第3份标本,即接受治疗6~12年后的肝穿刺标本。检测血     

慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA定量与病情的相关性分析

目的探讨肝组织HBV cccDNA定量对慢性乙型肝炎（乙肝）患者病情的影响。方法应用FQ—PRC法检测42例乙肝患者肝组织HBVcecDNA、肝组织和血清HBV—DNA水平,同时对肝组织行常规病理染色判断肝组织炎症及纤维化程度;SP法检测肝组织中HBsAg、HBcAg表达,化学发光法检测HBV标志物。分析肝组织HBVceeDNA与组织和血清HBV-DNA、肝细胞内HBsAg、HBcAg水平及肝脏炎症、纤维化程度的关系。结果肝组织HBVeecDNA定量与组织及血清HBV—DNA定量呈正相关（r=0．807,P〈0．001;r=0．627,P〈0．001）;与肝组织炎症活动度及纤维化程度无明显相关性：肝组织HBVcccDNA定量与肝细胞内HBsAg表达无明显相关性,而与HB—cAg表达呈正相关（r=0．486,P〈0．05）。结论检测肝组织内HBVceeDNA可更精确反映HBV复制程度;对乙肝诊断、抗病毒治疗及选择停药时机具有重要价值。肝组织HBV cccDNA与血清HBV-DNA定量及HBcAg联合检测可指导抗病毒治疗。     

慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗过程中肝组织HBVcccDNA变化及与血清学指标的相关性

目的观察慢性乙型肝炎(乙肝)患者在阿德福韦酯(ADV)抗病毒治疗过程中肝组织总的乙肝病毒核酸(HBV tDNA)、cccDNA含量变化及与血清HBV DNA、HBsAg的相关性,探讨肝组织HBV tDNA和cccDNA含量改变在抗病毒治疗中的意义。方法 47例慢性乙肝患者口服ADV10 mg/d,每隔12周检测病毒学、血清学和生化学等指标。47例基线患者和24例治疗48周患者行肝组织活检及肝组织HBV tDNA和cccDNA检测。结果 47例慢性乙肝患者ADV治疗48周后,HBV DNA低于检查下限占36.2%(17/47);ALT和AST复常率分别为76.6%(36/47)和85.1%(40/47)。比较基线和48周均取肝活检的24例患者,48周时血清和肝组织中HBV DNA载量均较基线显著下降(P0.01),血清HBV DNA下降值大于肝组织HBV tDNA和肝组织HBV cccDNA(分别为3.21 lg拷贝/ml、1.02 lg拷贝/细胞和0.76 lg拷贝/细胞)。基线时,24例患者肝组织HBV tDNA、cccDNA与血清HBV DNA和HBsAg呈正相关(P0.01);但治疗48周时,各指标间无相关性。结论 ADV治疗慢性乙肝患者可使其肝组织HBV tDNA、cccDNA和血清HBV DNA水平显著下降,但血清HBV DNA下降较肝组织HBV tDNA、cccDNA更为显著。     

肝移植术后肝组织中HBV cccDNA的表达及临床意义

目的探讨肝移植术后患者肝组织内乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的表达及其临床意义。方法应用原位聚合酶链反应及免疫组织化学法检测2004年4月至2007年4月在北京地坛医院肝移植术后出现HBV再感染的25例患者及10例肝移植术后未出现HBV再感染者肝组织中HBV cccDNA及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、前-S1的表达。结果在35例标本中检测到cccDNA阳性的有22例(62.9%),阳性信号为紫蓝色呈块状或颗粒状,定位于细胞核。25例术后出现HBV再感染的患者其HBV cccDNA阳性率显著高于未出现HBV再感染者(84%对10%,P<0.01)。HBV cccDNA和HBcAg均为阳性的有20例,有2例患者肝组织中HBcAg阴性,但HBV cccDNA检测为阳性。肝组织中HBV cccDNA的表达阳性率与HBcAg具有高度一致性(Kappa=0.755,P<0.01)。结论肝移植患者肝组织中HBV cccDNA阳性表达可能与乙型肝炎再感染具有密切关系。     

外周血单核细胞HBV cccDNA水平与乙型肝炎抗病毒疗效

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）,是HBV前基因组RNA复制的原始合成模板,cccDNA的存在是病毒复制及感染得以维持的根源。本研究对10例CHB患者进行外周血单核细胞HBV cccDNA定量分析,同时检测血清HBV DNA水平,探讨外周血HBV DNA阴转、HBeAg脏清学转换与肝组织cccDNA水平的关系,为临床寻求一种简易有效的监测方法。     

慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

目的建立一种灵敏、特异地检测肝组织中HBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法。方法利用HBV cccDNA与rcDNA结构上的差异,设计检测HBV cccDNA的特异性引物及探针,以含HBV基因组全序列的P1.2Ⅱ质粒为检测HBV cccDNA的标准品,建立标准曲线。肝组织标本中提取的DNA分为2等份,1份经质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切,作为检测HBV cccDNA的模板,另1份不酶切作为检测肝组织HBV DNA和β-actin的模板,分别进行肝组织HBV DNA和β-actin的定量测定,并以β-actin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和HBV DNA含量进行标准化。结果肝组织HBV tDNA的线性范围为7.41×10~6~2.66×1011拷贝数/mg(对数值:9.33±1.27),HBV cccDNA的线性范围为7.63×10~4~9.46×10~8拷贝数/mg(对数值:7.55±1.08)。HBV cccDNA含量:13.066±7.387拷贝数/cell,HBV tDNA含量:1 363.9±153.94拷贝数/cell;同一患者肝组织cccDNA含量与HBV tDNA含量比值为0.96%;肝组织HBV cccDNA与肝组织HBV tDNA呈显著正相关关系(r=0.859,P0.01)。结论该实时荧光定量PCR法可以灵敏、特异地检测慢性乙型肝炎患者肝组织中的HBV cccDNA载量。     

乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的检测

目的 检测不同肝脏病变程度的乙型肝炎患者外周血中的HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA),评价其相关的影响因素和临床意义.方法 共观察57例乙型肝炎患者,其中轻度慢性乙型肝炎患者26例,重型乙型肝炎患者31例.患者入院后行PT、肝功能、肝炎病毒血清标志物等常规检测,并进行总HBV DNA和HBV cccDNA检测.Logistic逐步回归分析影响血清HBVcecDNA检出率的相关因素.结果重型乙型肝炎组13份血清标本HBV cccDNA为阳性,轻度慢性乙型肝炎组仅1份血清标本HBV cccDNA为阳性,血清HBV cccDNA的含量为1.25×103～4.88×104拷贝/mL,两组患者血清HBV cccDNA检出率差异有统计学意义(P=0.0014).血清HBV cccDNA检测诊断重型乙型肝炎患者的灵敏度和特异度分别为41.94%和96.15%.Logistic逐步回归分析显示,血清HBV ccvDNA的检出率与PT有关(X<'2>=7.2192,P=0.0072),而与患者的年龄、性别、血清总HBV DNA、TBil和ALT水平无相关性.结论 部分乙型肝炎患者特别是重型肝炎患者外周血中可以检测出HBV cccDNA,血清HBV cccDNA的检出可作为支持重型乙型肝炎诊断的指标之一.