视黄酸联合视网膜细胞共培养对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨胚胎干细胞(ESC)在视黄酸联合视网膜细胞共培养诱导条件下的分化特征。方法 将ESC自液氮中复苏、培养，传1代后进行拟胚体培养。将部分3．5d拟胚体离心重悬后加入含有视黄酸的24孔板中进行诱导，另一部分加入已经培养有视网膜混合细胞的培养瓶中，培养液中同时也加入视黄酸。视网膜混合细胞中仅加入视黄酸未加拟胚体作为对照。倒置相差显微镜下观察细胞在整个诱导过程中形态学的改变并使用免疫细胞化学检测诱导细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、广谱细胞角蛋白、微管相关蛋白-2、视紫质蛋白表达情况。结果 (1)形态学改变仅由视黄酸诱导，诱导细胞呈多种形态；在共培养条件下，绝大多数拟胚体分化出来的细胞形态非常单一，呈透明圆形。部分原贴壁的视网膜细胞出现了明显的网状结构。(2)免疫细胞化学显示两种诱导条件均可见大部分诱导细胞MAP-2阳性，并可见Nestin阳性细胞。共培养诱导尚可见GFAP阳性、Cytokeratin阳性和Rhodopsin阳性的细胞。结论 视黄酸可以诱导大部分细胞成为神经细胞，在视黄酸和与视网膜细胞共培养诱导条件下，可以获得更为纯化的形态一致的神经样细胞，部分诱导细胞表达视网膜细胞的特性。     

视网膜细胞培养上清液对胚胎干细胞定向分化的神经样细胞钠通道动力学的影响

目的探讨不同视网膜细胞上清液对由胚胎干细胞诱导的神经细胞生理机能的影响。方法对拟胚体分别使用视黄酸（A组）、视黄酸+鼠视网膜胶质细胞和神经细胞培养上清液（B组）、视黄酸+人胎儿视网膜胶质细胞培养上清液（C组）进行次级诱导。在诱导后5~21 d，对各组中的细胞分别行细胞膜上的钠离子通道分析。结果诱导后5~21 d时，各组细胞钠电流变化均不明显。A组细胞钠通道呈爆发状的放电现象；B组呈现短促而频繁的状态；C组开放时程较长。三组细胞中，无电流细胞的比例分别为25%、11.4%和23.8%，但组间差异无统计学意义(P＞0.05)。A组Na+电流细胞数目表现为先升高后下降，B组表现为一直上升，C组表现为先下降后趋于平稳。A组细胞通道的开放时间最长，B组最短。三组的开放时间分布均可使用双指数拟和。结论在胚胎干细胞向神经细胞诱导中，视网膜细胞上清液对诱导细胞的生理功能会产生明显影响。(中华眼底病杂志，2007，23：91-93）     

光损伤鼠视网膜片培养上清液诱导MSCs分化为视网膜样细胞的研究

目的：应用大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液,在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成为视网膜样细胞的可能性。

方法：贴壁筛选法分离、培养大鼠MSCs,流式细胞仪对其细胞纯度鉴定。取材大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片,常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织完整性。电镜观察大鼠视网膜片光损伤程度。制备3种诱导分化大鼠MSCs的条件培养液。3种条件培养液均培养诱导至第3代大鼠MSCs 7～8d,用RT-PCR检测视紫红质(Rhodopsin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)等视网膜细胞标志物在诱导后细胞中的表达情况。

结果：HE染色显示大鼠视网膜片取材结构完整,电镜显示大鼠视网膜片光损伤后结构损伤严重。RT-PCR鉴定：条件培养液诱导大鼠MSCs 7～8d,条件培养液Ⅰ组Rhodopsin(0.3915±0.00644)、NSE(0.2019±0.00682)、GFAP(0.1972±0.00211),条件培养液Ⅱ组Rhodopsin(0.0983±0.00319)、NSE(0.1048±0.00323)、GFAP(0.1040±0.00254),条件培养液Ⅲ组Rhodopsin(0.0044±0.00126)、NSE(0.0498±0.00149)、GFAP(0.0467±0.00333),组间差异有统计学意义。

结论：光损伤大鼠视网膜片培养上清液可诱导大鼠MSCs分化为视网膜样细胞,为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。     

光损伤鼠视网膜片培养上清液诱导 MSCs 分化为视网膜样细胞的研究

目的：应用大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液,在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（ mesenchymal stem cells , MSCs）成为视网膜样细胞的可能性。 方法：贴壁筛选法分离、培养大鼠MSCs ,流式细胞仪对其细胞纯度鉴定。取材大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片,常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织完整性。电镜观察大鼠视网膜片光损伤程度。制备3种诱导分化大鼠MSCs的条件培养液。3种条件培养液均培养诱导至第3代大鼠MSCs 7～8d,用RT-PCR检测视紫红质（Rhodopsin）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）、胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein ,GFAP）等视网膜细胞标志物在诱导后细胞中的表达情况。 结果：HE染色显示大鼠视网膜片取材结构完整,电镜显示大鼠视网膜片光损伤后结构损伤严重。 RT-PCR鉴定：条件培养液诱导大鼠MSCs 7～8d,条件培养液Ⅰ组Rhodopsin （0．3915±0．00644）、NSE （0．2019±0．00682）、GFAP （0.1972±0．00211）,条件培养液Ⅱ组Rhodopsin（0．0983±0．00319）、NSE （0．1048±0．00323）、GFAP （0．1040±0.00254）,条件培养液Ⅲ组Rhodopsin（0．0044±0．00126）、NSE（0．0498±0．00149）、GFAP（0．0467±0．00333）,组间差异有统计学意义。 结论：光损伤大鼠视网膜片培养上清液可诱导大鼠MSCs分化为视网膜样细胞,为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。     

人视网膜中神经干细胞样细胞的分离和体外培养

目的 分离培养发育基本成熟的人视网膜中神经干细胞样细胞。方法 取0～3岁猝死婴幼儿视网膜细胞，在干细胞选择性培养基中培养，观察原代和传代细胞的形态和增殖情况，并对其诱导分化。通过免疫细胞化学方法检测Nestin、MAP-2和GFAP的表达。结果 原代细胞可形成悬浮生长的致密球状细胞团，传代后能形成新的细胞球。部分细胞球表达Nestin，传代后阳性率增加。分化后细胞形态多样，每一团细胞相对一致，部分细胞表达MAP-2或GFAP。结论 0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞。     

胚胎干细胞视网膜下移植实验研究初步报告

目的 探讨胚胎干细胞(embronic stem　cell,ESC)在视网膜下间隙分化发育的情况。 方法 ESC经体外悬浮培养4 d形成胚胎体(embryonic body,EB)备作移植。将ESC以及EB联合或不联合视黄酸(retinoic acid,RA)分别移植到SD大鼠玻璃体腔或视网膜下,在视网膜下间隙移植眼,于移植前结扎眼动脉40 s造成缺血再灌注损伤的实验模型。于移植后14～28 d摘除眼球,观察移植物分化发育的情况。 结果 ESC在SD大鼠玻璃体腔内迅速增生,形成非典型性增生团块;EB在缺血再灌注损伤眼视网膜下间隙经RA诱导能定向分化为视网膜感光细胞;而在无RA作用下向多极化分化发育。单独RA视网膜下间隙注射后导致神经视网膜上皮增生变厚。 结论 ESC源性的EB在缺血再灌注眼视网膜下间隙经RA诱导能向视网膜感光细胞分化。（中华眼底病杂志,2000,16：213-284）     

SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨视网膜神经细胞培养的上清液对胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）体外分化的诱导作用。 方法 收集SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液，抽滤后按2∶3比例与DMEM培养液混合，用该混合液进行ES 细胞的诱导分化，每天倒置相差显微镜观察ES细胞的生长及分化情况,对诱导分化后的细胞进行神经丝蛋白(nellcofilament protein，NFP)免疫组织化学检查。 结果 加入了视网膜神经细胞培养上清液的ES细胞生长出类似神经细胞突起样结构，NFP免疫组织化学染色阳性。 结论 SD大鼠视网膜神经细胞培养的上清液具有诱导ES细胞向神经细胞分化的作用。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 134-136)     

永生化胚胎视网膜干细胞的体外诱导分化

目的：研究R71882永生化视网膜干细胞系细胞的体外诱导分化。方法：对R71882细胞系细胞进行体外培养扩增，利用含有表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等生长因子的DMEM／F12培养液对第43代细胞进行体外诱导分化，免疫荧光细胞化学鉴定诱导后细胞的抗原表达。结果：诱导后的R71882细胞系细胞增殖速度减慢，细胞表达微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)、胶质源性纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)、蛋白激酶C-α(protein kinase C-α，PKC-α)、Thy1．1及Calretinin，同时部分细胞仍表达巢蛋白(Nestin)，但未见视紫红质(Rhodopsin)表达。结论：R71882细胞是一种多能视网膜干细胞。在EGF及bFGF等多种生长因子的共同作用下，该细胞系中部分细胞仍能表达未分化细胞标记物Nestin，部分细胞开始向神经元、神经胶质细胞及双极细胞、神经节细胞和无长突细胞等视网膜终末细胞方向分化。     

大鼠胚胎视网膜干细胞的分离培养

目的分离培养大鼠胚胎视网膜干细胞。方法从胎龄第16d的SD大鼠视网膜神经上皮分离视网膜细胞并进行悬浮培养,观察细胞增殖以及自发分化情况,采用免疫细胞化学方法检测Nestin、β-Tubulin、GFAP和Recoverin的表达。结果原代细胞可形成悬浮生长的神经球,传代后能形成新的细胞球。原代及传代细胞大部分表达神经干细胞标记物Nestin,分化后的细胞部分表达神经元标记物β-Tubulin或神经胶质细胞标记物GFAP,少数细胞表达光感受器细胞标记物Recoverin。结论分离培养的SD胚鼠视网膜神经干细胞可以在体外扩增并具有多分化潜能。     

大鼠视网膜干细胞与神经干细胞体外增殖、分化特点比较

目的 通过对大鼠视网膜干细胞和神经干细胞体外增殖、分化特点进行比较,进一步明确视网膜于细胞自我更新及向神经细胞方向分化的能力.方法 实验研究.分离出生10 d大鼠睫状体区组织及新生大鼠脑组织,分别应用酶消化法将两种组织制成单细胞悬液,放入含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,观察并比较视网膜干细胞及神经干细胞体外增殖的特点.分别取第2代细胞,应用免疫细胞化学染色法检测干细胞特异性抗原神经巢蛋白（nestin）及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷（BrdU）的表达.同时,应用含50 ml/L的胎牛血清及1×N2添加剂的培养基促进其分化,观察两种细胞向神经细胞方向分化的特点：分别应用免疫细胞化学染色法对分化后的细胞nestin、神经无标志物神经元特异性烯醇酶（NSE）、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）进行检测,并应用卡方检验对两种干细胞分化后的NSE及GFAP阳性细胞数比例进行比较.结果 两种细胞原代培养48 h后均可见小的球状细胞团悬浮生长,折光性强.原代培养约7 d后传代,传代后细胞能重新形成球状细胞团,应用免疫细胞化学染色方法均可检测到细胞内nestin及BrdU的阳性表达,视网膜干细胞体外增殖的能力较神经干细胞弱.两种细胞均可在血清诱导条件下转变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞.诱导第7天进行免疫细胞化学染色,检测出两种干细胞表达nestin阳性细胞数比例分别为（9.5±3.5）%及（9.1±0.7）%.视网膜干细胞分化后NSE及GFAP的阳性细胞数比例分别为（11.2±2.8）%及（18.9＋2.1）%,低于神经干细胞分化后两种标志物阳性细胞数比例[（34.1±63）%及（41.9±3.3）%],NSE、GFAP在两组表达的差异均有统计学意义（x2=103.23,P＜0.05;x2=74.36,P＜0.05）.结论 来源于睫状体区的大鼠视网膜干细胞形态、体外增殖及可分化特性与神经干细胞相似,但其增殖及分化为神经细胞的能力较神经干细胞弱.     

Revisiting nestin expression in retinal progenitor cells in vitro and after transplantation in vivo

The purpose of this study is to characterize the co-expression of nestin--a neuroectodermal stem cell and a reactive glial marker-with various mature retinal cell markers in retinal progenitor cells (RPCs) expanded in vitro, followed either by in vitro induction or subretinal transplantation. Rat RPCs derived from embryonic day (E) 17 rat retina were expanded in serum free defined culture, and induced to differentiate by all-trans retinoic acid (RA). Following induction, cells were stained for nestin in combination with retinal neuronal and glial markers. Cultured cells were collected for quantitative RT-PCR gene expression analysis prior to and after induction. In a second series, passage 2 RPCs were transplanted into the subretinal space of S334ter-3 retinal degeneration rats at postnatal day 28. After 1-4 weeks, sections through the transplant were double immunostained for nestin and various retinal specific neuronal markers. The cultured RPCs treated with RA exhibited nestin co-expression with various retinal specific markers, including protein kinase C alpha (PKC), neurofilament 200 (NF200), cellular retinaldehyde binding protein (CRALBP), and rhodopsin. Following RA induction, quantitative RT-PCR analysis demonstrated downregulation of nestin, PAX-6, thy1.1, and PKCalpha, and upregulation of rhodopsin, glial fibrillary acidic protein (GFAP), and CrX. No nestin coexpression was observed with any of the retinal specific neuronal markers in RPC transplants in vivo except for some nestin-immunoreactivity overlapping with GFAP positive cells in the host retina. The role of nestin as a unique neural stem/progenitor cell marker should be reconsidered. Nestin expression during RPC maturation appears to be different in vitro versus in vivo.     

胚胎干细胞定向诱导为结膜上皮样细胞的实验研究

目的：研究体外诱导小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化为结膜上皮细胞的可能性及条件，为构建组织工程化结膜提供新型的种子细胞奠定基础。方法：以人结膜上皮细胞作为诱导条件，采用分层共培养的方法诱导小鼠ESC，倒置相差显微镜观察共培养后形态的改变；免疫组织化学法检测诱导后的细胞角蛋白3／12(CK3/K12)、角蛋白13(CKl3)、MUC4和MUC5AC的表达。结果：采用人结膜上皮细胞作为诱导条件，ESC在诱导72h后可见部分细胞显示典型上皮祥细胞形态，免疫组化检测CKl3、MUC4表达阳性，CK3/K12，MUC5AC表达阴性。结论：采用分层共培养的方法，用人结膜上皮细胞作诱导剂可以诱导小鼠ESC向结膜上皮样细胞分化。眼科学报2003；19：117-121     

蛋白激酶Cα在小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经样细胞中的表达变化

目的研究小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)定向诱导分化为神经样细胞过程中蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)的表达变化,探讨可能涉及ESC定向分化的信号机制.方法ES-D3细胞株用不含小鼠白血病抑制因子(mouseleukemiainhibitoryfactor,mLIF)的ESC培养液培养4 d,形成胚胎体(embryoid bodies,Ebs),再分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,经5×10-7 mol/L维甲酸(retinoic acid,RA)诱导后,用神经特异性烯醇化酶(NSE)和NF-200来鉴定分化细胞的类型,在诱导后第1、3、5、7和14天用Western印迹和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测PKCα亚型的表达变化.结果诱导前免疫组化发现PKCα在ES-D3细胞有广泛的棕黄色的阳性表达,以细胞浆和细胞膜最明显;Western印迹发现PKCα出现一条蛋白印迹条带,分子量约为84kD;诱导后第3天,NSE和NF-200开始表达,第7天达到高峰;诱导后Western印迹和RT-PCR方法都显示PKCα表达量急剧下降,以后逐渐升高,至第14天基本恢复至正常水平.结论在RA诱导ESC定向分化为神经样细胞过程中,PKCα有独特的时空表达特点,它可能对ESC的分化有非常重要的调控作用.     

Loss of photoreceptor potential from retinal progenitor cell cultures, despite improvements in survival

Retinal degeneration (RD) results from photoreceptor apoptosis. Cell transplantation, one potential therapeutic approach, requires expandable stem cells that can form mature photoreceptors when differentiated. Freshly dissociated primary retinal cells from postnatal day 2-6 (PN2-6) mouse retina can give rise, post-transplantation, to photoreceptors in adult recipients. Unfortunately, incorporation rates are low; moreover, photoreceptor potential is lost if the same PN2-6 cells are cultured prior to transplantation. We investigated the identity of the cells forming photoreceptors post-transplantation, using FACS sorted primary postnatal day (PN) 3-5 Rho-eGFP retinal cells. Higher integration rates were achieved for cells that were expressing Rho-eGFP at PN3-5, indicating that post-mitotic photoreceptor precursors already expressing rhodopsin form the majority of integrating rods. We then investigated improvement of cell culture protocols for retinal progenitor cells (RPCs) derived from PN3-5 retinal cells in vitro. We succeeded in improving RPC survival and growth rates 25-fold, by modifying retinal dissociation, replacing N2 supplement with B27 supplement minus retinoic acid (B27 − RA) and coating flasks with fibronectin. However, levels of rhodopsin and similar photoreceptor-specific markers still diminished rapidly during growth in vitro, and did not re-appear after in vitro differentiation. Similarly, transplanted RPCs, whether proliferating or differentiated, did not form photoreceptors in vivo. Cultured RPCs upregulate genes such as Sox2 and nestin, markers of more primitive neural stem cells. Use of these cells for RD treatment will require identification of triggers that favour terminal photoreceptor differentiation and survival in vitro prior to transplantation.     

大鼠尾芽胚视杯干细胞的分布与特征

目的探索视杯干细胞在大鼠尾芽胚(第12.5天胚龄)的分布与特征。方法采用免疫组织化学技术，检测视杯干细胞在大鼠尾芽胚(第12.5天胚龄)视杯组织中的分布；分离视杯细胞，体外无血清培养，应用免疫细胞化学技术分析其增生能力以及血清诱导分化前后CHX10和多种成熟视网膜细胞特异性标记蛋白的表达，以了解这一发育时期视杯组织的分化特点。结果大鼠尾芽胚(第12.5天胚龄)的视杯干细胞主要分布在视杯的内外层和边缘层，不表达成熟视网膜细胞特异性标记蛋白。从尾芽胚视杯中分离出的细胞具有单细胞克隆能力，CHX10表达阳性，血清诱导后表达多种成熟视网膜细胞特异性标记蛋白：Thy1.1、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、蛋白激酶C(PKC)α和rhodopsin。结论大鼠尾芽胚(第12.5天胚龄)视杯主要由未分化的细胞组成，视杯干细胞的分布集中在视杯内层和边缘层。体外培养的视杯干细胞增生能力强，经诱导分化后表达多种成熟视网膜细胞特异性标记蛋白。(中华眼底病杂志,2005,21:159-162)     

The Preliminary Experimental Study of Induced Differentiation of Embryonic Stem Cells into Corneal Epithelial Cells

Purpose: To study preliminarily induced differentiation of embryonic stem cells into corneal epithelial cells in vitro.Methods: Murine embryonic stem cells were co-cultured with Rabbit limbal corneal epithelial cells in Transwell system to induce differentiation. Mophological and immunohistochemical examination were implemented.Results: The induced cells from embryonic stem cells have an epithelial appearance. The cells formed a network and were confluent into film gradually after being co-cultured with rabbit limbal corneal epithelial cells for 24 ~ 96 hours. The cells ranged mosaic structure and localized together with clear rim. Most of the cells showed polygonal appearance. Transmission electron microscope showed lots of microvilli on the surface of induced cells and tight junctions between them. These epithelial-like cells expressed the corneal epithelial cell specific marker cytokeratin3/cytokeratin12. Conclusion: The potential mechanism of the differentiation of murine embryonic stem cel     

Therapeutic effects of mesenchymal stem cells administered at later phase of recurrent experimental autoimmune uveitis

AIM: To test the therapeutic effects of delayed treatment of mesenchymal stem cells (MSCs) in recurrent experimental autoimmune uveitis (rEAU). METHODS: The efficacy of different regimens of MSC administration in rEAU were tested by evaluation of clinical and pathological intraocular inflammation, as well as retinal structural and functional integrity using optical coherence tomography (OCT) and electroretinogram (ERG). The retinal sections were also immunostained with antibodies to glial fibrillary acidic protein (GFAP) and rhodopsin (RHO). RESULTS: Delayed treatment of MSCs effectively alleviated the severity of intraocular inflammation with relative intact of outer retinal structure and function. Moreover, double therapies with longer interval led to an even better clinical evaluation, as well as a trend of decrease in relapse and amelioration of retinal function. MSC therapies also effectively reduced GFAP expression and increased RHO expression in the retina. CONCLUSION: MSC administration can effectively treat developed diseases of rEAU, and multiple therapies can provide additional therapeutic benefits.