纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达纯化及抗体制备

目的实现纳豆激酶(NK)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达,以纯化产物为抗原制备兔抗NK血清。为建立双抗夹心酶联免疫吸附反应法测定生物体内NK含量,进一步研究NK在体内代谢与功能奠定基础。方法将NK基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A中,鉴定后的重组质粒用SalⅠ酶切线性化后电转化到毕赤酵母宿主菌GS115中,甲醇诱导表达,经盐析和Millipore超滤膜过滤分离纯化表达产物。纤维蛋白法检测纯化产物的活性,并以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔制备兔抗NK血清。结果SDS-PAGE结果显示NK成功表达,其相对分子质量(Mr)约为27 000,纤维蛋白平板实验显示表达产物具有较好的纤溶活性。酶联免疫法测得多克隆抗体效价约为1∶8 000,Western blot结果显示在Mr27 000附近有1条特异带出现。结论NK在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达,表达产物具有较好的纤溶活性和免疫原性。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

重组人β淀粉样蛋白1-42小规模发酵及小量纯化工艺的摸索

目的研究重组人β淀粉样蛋白1-42(rh Aβ1-42)在5 L摇瓶中的高密度发酵实验,以及小量纯化工艺的方法。方法分别从甲醇浓度、p H、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生rh Aβ1-42的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀目的蛋白、透析、脱盐和阴离子交换层析,对rh Aβ1-42小量精确的纯化方法进行了研究。结果确定rh Aβ1-42在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在p H 6.0的条件下,以0.5%甲醇诱导72 h,经过硫酸铵沉淀目的蛋白、透析、脱盐和阴离子交换层析,rh Aβ1-42纯度可达94%以上。结论确定了rh Aβ1-42在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,建立了小量纯化rh Aβ1-42的新方法。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性，作为真核表达系统，具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高，营养要求低等优点；在该表达系统中，主要有3种表达宿主菌，其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体，其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂；巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。     

生物技术文摘

B35-10 表达于甲醇营养型巴斯德毕赤氏酵母中的重组雪花莲凝集素(GNA)的大规模生产和纯化Baumgartner P等[BiotechnolLett, 2003, 25: 1281]将雪花莲凝集素(GNA)的编码基因在甲醇营养型巴斯德毕赤氏酵母中进行表达并分泌出产物。筛选出巴斯德毕赤氏酵母的转化子并开发了一个在克级水平上生产和纯化重组GNA的工艺。在200L规模上,GNA的分泌浓度接近80mg/L,采用疏水色谱将GNA纯化至95%同质性。重组蛋白在结构和生物学活性方面与在植物中合成的蛋白相近。[袁 宁摘 朱春宝校]B35-11 从Citrobacter braakii分离和鉴定有改良特性…     

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

毕赤酵母表达重组人干扰素α2a发酵诱导时机的研究

目的 对研究毕赤酵母表达重组人干扰素α2a发酵诱导时机.方法 在相同培养条件下,在OD600分别为150、250、300的菌体密度下进行诱导.结果与结论 在OD600为250左右时为诱导的最佳时机,诱导48h时菌体生物量(OD600)达395、重组人干扰素α2a蛋白表达达700～900mg·L-1.其结果为毕赤酵母表达重组人干扰素α2a的工业化生产奠定了良好的基础.     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化

目的研究重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白(Tα1-HSA)基因工程菌在30 L发酵罐中高密度发酵表达Tα1-HSA融合蛋白的发酵工艺及产物的分离纯化方法。方法采用两步发酵法进行重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌的高密度发酵。发酵液经超滤浓缩,阴离子交换色谱,亲和色谱,凝胶过滤色谱等步骤进行分离纯化。结果发酵结束后,菌体细胞湿重达到350 g/L,发酵液中蛋白产量达到2.0 g/L。发酵液经分离纯化后获得了纯度较高的重组Tα1-HSA融合蛋白,HPLC分析纯度达97.5%。结论重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌高密度发酵的成功及分离纯化方法的建立为Tα1-HSA的进一步研究和开发奠定了基础。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。     

毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。     

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

重组人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在毕赤酵母中表达条件的优化

采用单因子和正交试验对毕赤酵母重组菌株产生人凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(rhLOX-1)的发酵过程进行了优化,确定了最佳发酵条件:0.8%甲醇,1.8%酪蛋白水解物,初始pH 7.0,3×接种量。在此培养条件下,rhLOX-1在毕赤酵母重组菌株中的表达量可超过100 mg/L,比对照提高了1倍以上。本研究为大规模发酵制备rhLOX-1蛋白奠定了基础,更好地满足了LOX-1的理论研究及新药筛选的需要。     

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外     

IL-1Ra-HSA融合蛋白的构建、生物学活性和药动学分析

为了延长白细胞介素受体-1拮抗剂(IL-1Ra)的血浆半衰期及组织特异性以达到更好的疗效,构建了通过连接肽相连的重组人IL-1Ra和人血清白蛋白的融合蛋白(IL-1Ra-HSA)的表达载体,并在毕赤酵母中获得了融合蛋白的高效分泌表达,表达产物经鉴定和纯化制备后,进行了生物学活性和药动学分析。结果表明,融合蛋白保留了IL-1Ra的拮抗剂活性,能特异性结合人黑色素细胞A375.S2的IL-1受体,有效抑制IL-1β诱导人黑色素细胞A375.S2的凋亡;同时,HSA的融合延长了IL-1Ra血浆半衰期(30倍),显著提高了IL-1Ra在炎症关节的摄取和保留时间,降低了IL-1Ra在其他组织如肝、肾、脾、肺的分布,表明融合蛋白在类风湿关节炎及其他与IL-1功能失调的免疫炎症性疾病的治疗上具有更好的应用前景。     

组织因子途径抑制因子重组蛋白表达和纯化方法的优化

目的:对组织因子途径抑制因子(TFPI)的表达条件和纯化方法进行优化,降低重组蛋白制备成本.方法:应用巴斯德毕赤酵母表达系统进行TFPI重组蛋白的表达.采用不同浓度甲醇进行重组蛋白表达诱导,观察不同pH对重组蛋白活性的影响,应用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析相结合的方法纯化重组蛋白.结果:重组蛋白的表达量达到1.5 mg/L培养基.上述蛋白纯化方法所得回收率为43.1%,蛋白纯度大于95%,蛋白活性保持良好.结论:优化后的蛋白表达量比优化前得到明显提高,本研究采用的纯化方法操作简单、耗时短、成本低且回收率较高.     

重组毕赤酵母生产干扰素α-2b的研究

目的为探求生产干扰素-α2b的方法。方法采用重组毕赤酵母发酵,纯化生产干扰素-α2b。结果重组毕赤酵母生产干扰素α-2b,产量高达70mg/L(发酵液),目标蛋白干扰素α-2b不需要复性,在纯化过程中,不需要价格昂贵的单抗柱,即可从发酵液中提取获得纯度达96%以上的目标蛋白,蛋白质比活性大于1.0×109IU/mg。结论PichiaPastoris高效酵母分泌表达系统取代大肠杆菌表达系统生产干扰素-α2b。结论采用重组毕赤酵母生产干扰素-α2b,能提高蛋白质比活性,简化生产工艺,降低生产成本。     

人组织因子的密码子优化及其在毕赤酵母中的高水平发酵制备

优化人组织因子编码序列利用毕赤酵母表达系统高水平发酵制备重组人组织因子。将人组织因子胞外活性区(hTF219)编码序列进行密码子偏爱性、GC含量及富AT区的优化,优化序列电转入毕赤酵母表达系统;利用博莱霉素(Zeocin)梯度抗性平板筛选出高表达转化子;在1L发酵罐中采用混合碳源连续补料方式发酵制备重组蛋白。替换hTF219编码cDNA的165个碱基,获得的优化序列与原始序列的相似性为75%;在Zeocin浓度为500μg/mL的YPD平板上筛选得到高表达转化子tfPP-502,该重组菌株以组成型方式分泌表达重组人组织因子,在1L发酵罐中发酵110 h胞外总蛋白含量为6.27 g/L,目的蛋白占比约80%。在毕赤酵母表达系统中实现了重组人组织因子的高水平发酵制备获得的重组菌株可用于重组人组织因子的大规模发酵制备。