MAPK和NF-κB上调脂多糖诱导的小鼠肺微血管内皮细胞Toll-like受体4的表达

目的 观察MAPK和NF-κB在经脂多糖（LPS）诱导的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）Toll-1ike受体4（TLR4）表达增强中的作用。方法 分离培养PMVECs。不同浓度的LPS与PMVECs共培养2h，或与LPS（100μg/L）作用不同时间。用ELISA法检测培养上清液中TNF-α含量。分别用ERK抑制剂PD98059和P38MAPK抑制剂SB203580或NF-κB抑制剂PDTC进行干预。用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TLR4和TNF-α mRNA。用Western-blot检测ERK／P38MAPK和核蛋白NF-κB的表达。结果 在LPS浓度为50～500μg／L时，作用于PMVECs 2h，或LPS100μg/L作用不同时间时，培养上清液中TNF-α含量呈剂量和时间依赖性显著增加（P〈0．01）。PMVECs表达TNF-α及TLR4mRNA增加，6h时达高峰。分别用上述抑制剂均可缓解上述变化，而同时联合使用PD98059和SB203580则进一步增强该抑制作用。上述抑制剂分别缓解LPS诱导的PMVECs表达ERK／P38MAPK和NF-κB蛋白增强。结论 MAPK和NF-κB上调给脂多糖诱导的小鼠PMVECs TLR4的表达。     

乙型肝炎病毒X蛋白通过激活ERKs和NF-κB上调大鼠系膜细胞表达TNF-α

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因转染大鼠系膜细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)高表达的细胞外蛋白调节激酶(ERKs)、核因子κB(NF-κB)、P38 MAPK信号传导机制.方法 将含有HBV X基因的质粒pCI-neo-X导入体外培养的大鼠系膜细胞,分别采用特异性抑制剂U0126阻断ERK1/2通路,Lactacystin阻断NF-κB通路和SB203580阻断P38 MAPK通路,观察培养细胞TNF-α及其mRNA表达,以不加抑制剂作为对照.RT-PCR检测TNF-α mRNA表达,ELISA检测培养上清液中TNF-α表达.Western blot检测乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达.结果 转染pCI-neo-X后,系膜细胞TNF-α mRNA及上清液TNF-α表达均增高,通过阻断ERK1/2或NF-κB通路,细胞TNF-α mRNA及上清液TNF-α表达均下降.而阻断P38 MAPK通路对系膜细胞TNF-α mRNA及上清液TNF-α表达无明显影响.结论 HBx蛋白通过激活ERKs和NF-κB信号通路使系膜细胞高表达TNF-α,而与P38 MAPK通路无关.     

α-硫辛酸降低脂多糖诱导的Raw264.7细胞TNF-α的分泌

目的观察α-硫辛酸(ALA)对脂多糖(LPS)在体外诱导的Raw264.7细胞TNF-α释放及机制。方法用ALA或者ALA联合ERK或NF-κB的抑制剂或者激活剂预处理2 h,再用LPS(1 mg/L)体外刺激巨噬细胞Raw264.7;采用MTT法检测ALA对Raw264.7细胞活力影响,利用ELISA方法对Raw264.7释放在培养上清中的细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)的浓度,及用Western blot方法检测T-p ERK、p ERK和NF-κB的表达。结果 ALA可抑制LPS诱导的Raw264.7细胞TNF-α表达(P0.05),用ALA联合ERK或NF-κB的激活剂预处理后可减弱ALA产生的抑制效果(P0.05)。同时ALA抑制LPS诱导的Raw264.7细胞p ERK和NF-κB的表达(P0.05),用ALA联合ERK或NF-κB的抑制剂预处理后可加强ALA产生的抑制效果(P0.05)。结论 ALA可能通过抑制LPS诱导的Raw264.7细胞的ERK和NF-κB信号通路来抑制TNF-α释放。     

没食子酸通过拮抗脂多糖诱导的TLR4/NF-κB活化抑制RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的观察没食子酸对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)通路的影响。方法将巨噬细胞分为空白对照组、LPS组、LPS联合没食子酸组、LPS联合NF-κB抑制剂吡咯二硫代甲酸(PDTC)组和LPS联合地塞米松(DM)组。处理后的细胞培养24 h,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6水平,实时定量PCR检测TLR4、NF-κB mNRA水平,Western blot法检测p65、p-p65、TLR4、磷酸化的NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的蛋白表达水平。结果 LPS诱导RAW264.7巨噬细胞后TNF-α、IL-1、IL-6水平升高,没食子酸可降低LPS诱导引起的TNF-α、IL-1和IL-6表达水平升高。LPS刺激后TLR4 mRNA及蛋白表达增加,NF-κB活化,没食子酸可拮抗以上作用,阻止NF-κB活化。结论没食子酸可通过TLR4/NF-κB通路抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性反应。     

青蒿琥酯对小鼠巨噬细胞RAW264.7中TLR4介导的炎症通路的抑制作用

目的观察青蒿琥酯(artesunate,AS)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠RAW264.7细胞Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)介导炎症通路活化的影响,以探讨AS的抗炎作用机制。方法采用免疫荧光观察胞内TLR4表达和分布;免疫印迹检测TLR4及下游炎症通路关键分子的表达和活化;酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-6浓度。结果 AS对LPS诱导的TLR4表达及其在细胞中的聚集均有抑制作用;AS同时抑制TLR4衔接蛋白髓分化因子88和含TIR结构域干扰素诱导衔接蛋白表达,也抑制依赖于二者活化的肿瘤坏死因子受体相关因子6表达;对下游MAPK通路,AS抑制p38表达和磷酸化、JNK磷酸化,但对ERK1/2无显著影响;对下游NF-κB通路,AS下调抑制性-κBα(inhibitory-κBα,IκBα)的磷酸化,进而减少NF-κB亚基p50和p65活化入核的数量;最后,AS能够抑制LPS诱导的TNF-α和IL-6释放。结论 AS通过抑制LPS诱导的TLR4通路活化,减少致炎细胞因子的释放,从而发挥其抗炎作用。     

BRAP对LPS诱导的人气道上皮细胞系黏液高分泌的影响

目的探讨蛙皮素受体激活蛋白(BRAP)对脂多糖(LPS)诱导的气道黏液高分泌的影响及相关作用机制。方法体外培养人气道上皮HBE16细胞,转染已构建好的p EGFP-N1-BRAP,以空质粒载体作为对照,给予LPS刺激,同时分别以ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125、P38抑制剂SB203580干预。观察细胞内活性氧(ROS)含量、黏蛋白(MUC)5AC表达和核因子-κB(NF-κB)活性以及细胞活力的变化。结果转染p EGFP-N1-BRAP后ROS明显减少(P0.01);同单纯LPS刺激相比,MUC5AC蛋白含量和mRNA水平在转染p EGFP-N1-BRAP后明显降低(P0.01),NF-κB活性亦呈相同趋势(P0.05);在U0126组,MUC5AC的表达较转染重组质粒组显著降低(P0.01),NF-κB活性也显著下调(P0.05)。结论 BRAP可以通过ROS/ERK/MAPK信号通路阻止胞质内NF-κB的活化,从而下调MUC5AC的生成。     

PPARγ配体4i通过抑制NF-κB和MAPK信号通路抑制小鼠巨噬细胞炎性细胞因子的产生

目的探讨新型过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)配体4i的体外抗炎作用及机制。方法取对数生长期RAW264. 7小鼠腹腔巨噬细胞,经100 ng/m L脂多糖(LPS)诱导,采用ELISA检测10μmol/L 4i对巨噬细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)分泌的影响;采用Western blot法检测4i对核因子κBp65(NF-κBp65)、核因子κB抑制蛋白α(IκBα)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)活性的影响,加入不可逆的PPARγ拮抗剂GW9662(5μmol/L)探讨PPARγ在NF-κB和MAPK相关蛋白表达中的作用;采用SYBYL 8. 1软件进行分子对接分析探讨4i与PPARγ蛋白的结合特性。结果 4i显著抑制TNF-α和IL-6的产生呈时间依赖性;不同程度抑制NF-κBp65、IκBα、JNK、ERK1/2和p38MAPK蛋白的磷酸化水平,且抑制作用被GW9662所逆转; 4i能与PPARγ受体较好地结合。结论4i通过激活PPARγ抑制NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白的活化,抑制TNF-α、IL-6等的产生,发挥抗炎作用。     

肺炎克雷伯菌黏附素FimH蛋白通过TLR4/NF-κB途径诱导巨噬细胞分泌炎症因子

目的初步探讨肺炎克雷伯菌黏附素FimH蛋白诱导巨噬细胞分泌炎症因子及其作用机制,为阐明肺炎克雷伯菌的致病机制提供实验证据。方法使用肺炎克雷伯菌FimH蛋白刺激巨噬细胞,然后用ELISA法检测IL-1β、TNF-α和IL-6的含量,用Western blot检测iκB-α的表达量。分别用TAK-242、PDTC、SB203580和SP600125预处理巨噬细胞,抑制TLR4、NF-κB、p38和c-Jun活性,再使用ELISA法检测FimH蛋白刺激后IL-1β、TNF-α和IL-6的表达。结果使用FimH蛋白刺激人源性巨噬细胞,IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌量明显高于对照。FimH蛋白刺激会够降低细胞中iκB-α的含量。当使用TAK-242抑制TLR4的活性后,FimH蛋白诱导的IL-1β、TNF-α和IL-6表达量下降。使用PDTC和SB203580分别抑制NF-κB和p38的活性,也发现FimH蛋白诱导炎症因子能力下降。但是抑制c-Jun的活性不影响FimH蛋白诱导IL-1β、TNF-α和IL-6的表达。结论肺炎克雷伯菌FimH蛋白能够通过TLR4/NF-κB途径诱导巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6。     

法舒地尔(Fasudil)抑制脂多糖诱导的小鼠星形胶质细胞活化和炎性反应及其机制

目的探讨法舒地尔(Fasudil)对脂多糖(LPS)诱导的星形胶质细胞活化和炎症反应及Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法体外培养新生C57BL/6小鼠大脑皮质星形胶质细胞,细胞分为PBS对照组、1μg/m L LPS刺激组、1μg/m L LPS联合15μg/m L盐酸法舒地尔处理组,Griess法检测培养细胞上清液一氧化氮(NO)的水平,ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10和IL-4的水平,免疫荧光细胞化学染色检测星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)及TLR4的表达,Western blot法检测GFAP、TLR4和磷酸化的NF-κBp65(p-NF-κBp65)蛋白水平。结果与PBS组比较,LPS组NO、TNF-α和IL-6水平显著升高,IL-10和IL-4水平降低;法舒地尔能抑制LPS诱导的NO、TNF-α和IL-6的分泌,增加IL-10和IL-4的分泌。法舒地尔处理组星形胶质细胞GFAP表达显著降低,同时TLR4和NF-κB蛋白的水平也降低。结论法舒地尔阻断TLR4/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的星形胶质细胞活化及炎性反应。     

三百棒通过调控TLR4/NF-κB信号通路对脂多糖诱导的RAW264.7细胞极化的影响

目的：探讨三百棒醇提物(TAAE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7极化趋向以及其对炎症反应的影响。方法：用LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型。CCK-8法检测细胞活力;ELISA检测细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)的水平;Griess法检测细胞培养上清液中一氧化氮(NO)的分泌情况;荧光染色双标法观察巨噬细胞的极化状态;免疫荧光染色检测NF-κB定位及表达;Transwell检测TAAE对RAW264.7细胞迁移和趋化性的影响;RT-qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB和TLR4的mRNA水平;Western blot检测iNOS、COX-2、TLR4、NF-κB、p-NF-κB、IκBα和p-IκBα蛋白水平。使用TLR4通路抑制剂TAK-242进一步验证TAAE对TLR4/NF-κB信号通路的影响。结果：与模型组相比较,TAAE降低LPS诱导的炎症模型RAW264.7细胞中M1型促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)及NO水平,促使M2型抑炎因子(IL-10和Arg-1)分泌...     

TLR4-TRPC6在LPS致16HBE细胞内NF-κB P65表达和核转位的作用

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和瞬时受体电位通道蛋白6(TRPC6)信号通路在细菌脂多糖(LPS)诱导气道上皮细胞16HBE内NF-κB P65表达和核转位的作用,为气道炎症的发生机制提供实验依据。方法:用LPS(1mg/L)作用16HBE细胞0、0.5、2、6、12和24 h后,分别使用RT-PCR和Western blot法检测核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB) P65的mRNA和蛋白表达情况,并用免疫细胞化学染色法检测NF-κB P65的核转位。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测TLR4抑制剂CLI-095(5μmol/L)对LPS(1mg/L)诱导16HBE细胞NF-κB P65表达以及核转位的影响。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测TRPC6激动剂Hyp9(10μmol/L)对LPS(1mg/L)诱导16HBE细胞内NF-κB P65表达以及核转位的影响。结果:LPS上调16HBE细胞NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。TLR4抑制剂CLI-095抑制LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。TRPC6激动剂Hyp9加重LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。结论:LPS通过TLR4-TRPC6信号通路诱导16HBE细胞内NF-κB P65表达和核转位。     

TLR4/MAPKs信号通路在ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞分泌MCP-1中的作用

目的:探讨Toll样受体4/丝裂原活化蛋白激酶(TLR4/MAPKs)信号通路在氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞分泌单核细胞趋化因子-1(MCP-1)中的作用。方法:在ox-LDL刺激下采用逆转录聚合酶链技术(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血管平滑肌细胞MCP-1的表达,用Western blotting检测细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化水平的变化。同时,分别应用TLR4中和抗体(TLR4单克隆抗体、TLR4阻断剂)、PD98059(ERK1/2特异性抑制剂)、SB23015(p38MAPK特异性抑制剂)、SP600125(JNK特异性抑制剂),观察其对ox-LDL诱导的MCP-1的表达和ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平的影响。结果:ox-LDL刺激血管平滑肌细胞上调MCP-1mRNA和其蛋白的表达(P0.05);用TLR4中和抗体、PD98059、SB23015预孵育后MCP-1mRNA和其蛋白的表达较单独ox-LDL刺激情况下降低(P0.05),而用SP600125预孵育后降低不明显(P0.05);TLR4调节了ERK1/2和p38MAPKs的磷酸化水平。结论:ox-LDL是TLR4的内源性配体;ox-LDL通过或部分通过TLR4/ERK1/2和TLR4/p38MAPK信号通路介导血管平滑肌细胞MCP-1的表达。     

姜黄素降低Ⅲ型CP/CPPS模型鼠炎性反应因子的表达

目的研究姜黄素对Ⅲ型慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征(CP/CPPS)模型鼠炎性反应因子表达的影响。方法将大鼠随机分为假手术组(sham)、CP/CPPS模型组(model)、姜黄素50及100 mg治疗组(cur-50 mg,cur-100 mg)和p38抑制剂组(SB203580),连续腹腔给药12 d后,real-time PCR检测前列腺组织中TNF-α、p38、COX-2的mRNA表达;免疫组化检测TNF-α,COX-2的蛋白表达;Western blot检测p38、p-p38和NF-κB蛋白的表达。结果 CP/CPPS模型组的NF-κB、p-p38、TNF-α和COX-2蛋白,TNF-α、COX-2和p38的mRNA表达较假手术组升高(P0.01);cur-100 mg组和SB203580组可显著缓解模型组的变化(P0.01);cur-100 mg组中的COX-2蛋白和mRNA均比SB203580组明显下降(P0.05);相较模型组,姜黄素2个组、SB203580组p-p38与NF-κB的表达呈正相关(P0.01)。结论姜黄素能够降低CP/CPPS模型鼠NF-κB、TNF-α和COX-2及p-p38等炎性反应因子的表达。     

莫西沙星对脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎性反应的影响

目的探讨莫西沙星(MXF)能否调节脂多糖(LPS)诱导的体外巨噬细胞的炎性反应。方法 Real-time PCR和Western blot检测巨噬细胞TLR4、SPHK1、NF-κB mRNA及蛋白的表达。ELISA检测各组细胞上清液TNF-α和IL-1的分泌。结果低及中等浓度(8,16 mg/L)的MXF可抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TLR4、SPHK1和NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达,TNF-α和IL-1分泌量的升高,而高浓度(64 mg/L)则起促进炎性反应的作用。结论低中浓度MXF可抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的炎性反应,而高浓度则相反。     

羧胺三唑抑制大鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达和NF-κB活化

目的探讨羧胺三唑(CAI)对多种炎性相关因子的体外调节作用及机制。方法利用MTT法观察5~40μmol/L的CAI对细胞活力的影响。将上述浓度的CAI加入巨噬细胞中共同培养18 h,同时加入脂多糖(LPS)诱导上述细胞活化。分别用硝酸还原法和TNF-αELISA检测试剂盒测定培养基上清中NO的含量和TNF-α的水平,用Western blot法测定iNOS蛋白的表达和NF-κB活化。结果浓度在5~40μmol/L范围内的CAI对正常大鼠腹腔巨噬细胞的细胞活力没有影响,但20和40μmol/L的CAI能够剂量依赖性地降低LPS诱导的NO释放(P<0.01和P<0.001)以及TNF-α分泌(P<0.05和P<0.01),且明显抑制LPS引起的iNOS蛋白表达和NF-κB活化。结论CAI对与炎性反应相关的调控因子iNOS蛋白表达和NF-κB活化具有抑制作用,该机制与抑制IκBα磷酸化和降解相关。     

小窝蛋白1 对气道上皮细胞黏液高分泌的影响

目的:探讨小窝蛋白1(Cav-1)对脂多糖(LPS)诱导的气道黏液高分泌的影响。方法:体外培养人气道上皮细胞(16HBE),用LPS刺激细胞构建黏液高分泌模型,以Toll样受体4(TLR4)抑制剂E5564、核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂PDTC、转染Cav-1质粒和siRNA为干预因素,将细胞随机分为对照组、LPS刺激组、LPS+Cav-1质粒组、LPS+Cav-1 siRNA组、LPS+阴性siRNA组、LPS+空质粒组、LPS+E5564组及LPS+PDTC组。四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测各组细胞的活力;RT-PCR检测黏蛋白(MUC)5AC的转录水平;Western blot检测Cav-1、TLR4、磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的相对含量;ELISA检测MUC5AC的分泌水平;激光共聚焦技术检测细胞内MUC5AC蛋白的分布和含量。结果:LPS刺激组细胞内TLR4、p-IκBα、NF-κB、MUC5AC转录及蛋白水平显著高于对照组(P值均0.05),过表达Cav-1可进一步增加上述指标的表达量,而下调Cav-1及给予E5564、PDTC可以抑制LPS引起的上述效应(P0.05)。结论:Cav-1可通过上调TLR4/NF-κB信号通路而加重LPS诱导的MUC5AC的表达量。     

金雀异黄素对脂多糖诱导的巨噬细胞MAPK和TLR信号转导通路的影响

目的研究金雀异黄素对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路和Toll样受体(TLR)通路的影响。方法用100 ng/mL脂多糖和金雀异黄素分别处理RAW264.7巨噬细胞不同时间后,采用Western blot法检测对MAPK信号通路蛋白磷酸化的影响;采用RT2 ProfilerTMPCR芯片检测金雀异黄素对LPS诱导的TLR信号转导通路基因表达的影响。结果 LPS能够显著诱导蛋白p38和p42/44磷酸化,激活MAPK信号通路,金雀异黄素能够加强其作用,同时,LPS能够显著诱导TLR信号转导通路的细胞因子基因表达,包括IFN-β、IL-10、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、集落刺激因子2(CSF-2)、CSF-3、趋化因子CCL2和CXCL10、环氧合酶2(COX-2)、NF-κB1和IκB-α等,金雀异黄素能够显著降低这些上调基因的表达。结论金雀异黄素能够显著增强LPS激活的MAPK信号通路并抑制TLR信号通路的激活。     

青蒿素减轻LPS诱导的肠上皮细胞屏障功能损伤的实验研究

目的:探究青蒿素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠肠上皮IEC-6细胞屏障功能损伤的影响。方法:体外培养IEC-6细胞,随机分为5组:对照组、LPS(100 mg/L)组和LPS+青蒿素(30、50和100μmol/L)组,MTT法检测各组细胞毒性变化,ELISA检测各组细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的变化,电阻仪检测肠上皮细胞跨上皮电阻(TER),酶标仪检测单层细胞对辣根过氧化物酶(HRP)的通透性,RT-qPCR和Western blot检测各组细胞紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-1和occludin)以及TLR4/My D88/NF-κB mRNA和蛋白表达的变化。结果:LPS与青蒿素在本实验浓度范围对IEC-6细胞均无毒性。与对照组相比,LPS处理下,细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/My D88/NF-κB的mRNA和蛋白表达明显增加,ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表达降低。而青蒿素干预下,细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/My D88/NF-κB mRNA和蛋白表达明显降低,ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表达升高(P0.05),均呈现浓度依赖性。结论:青蒿素可能通过抑制TLR4/My D88/NF-κB通路减轻LPS诱导的肠上皮细胞屏障功能损伤。     

Notch1信号通过TRAF6参与TLR4介导的NF-κB激活

目的观察Notch1和TLR4信号交叉调控NF-κB激活并探讨其可能的作用机制。方法体外培养RAW264.7细胞,LPS刺激RAW264.7细胞后检测Notch1信号激活以及Notch1信号抑制剂DAPT对TNF-α、IL-6和IL-1β表达的影响,Western blot检测DAPT对IKKα/β磷酸化以及NF-κB p65活化的影响,并检测DAPT对TLR4信号通路IKKα/β上游信号My D88和TRAF6表达的影响。结果 LPS刺激RAW264.7细胞后能显著提高Notch1信号蛋白NICD和目的蛋白Hes1表达,DAPT能明显抑制NICD和Hes1的表达。LPS诱导TNF-α、IL-6和IL-1β表达和释放能被DAPT抑制但被Notch1信号激动剂jagged1增强。DAPT能够抑制LPS介导的TRAF6表达和IKKα/β磷酸化,促进NF-κB p65核转位,但DAPT对LPS诱导My D88的表达没有明显的影响。结论 Notch1和TLR4信号存在交叉对话,Notch1通过TRAF6调控NF-κB活化参与TLR4介导的免疫应答。     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp0971激活MAPKs和NF-κB诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β

目的:探讨梅毒螺旋体(Tp)膜蛋白Tp0971诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β的分子机制。方法:课题组前期表达的Tp0971重组蛋白为研究对象,将不同浓度的重组Tp0971刺激巨噬细胞,分别采用ELISA和实时定量PCR检测TNF-α和IL-1β的分泌及其mRNA的表达。采用Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs) p38,ERK1/2以及JNK1/2的磷酸化,并用相应的抑制剂处理观察TNF-α和IL-1β的变化。同时采用Western blot观察核转录因子κB(NF-κB)的核转位情况,并采用抑制剂处理观察其在介导TNF-α和IL-1β分泌中的作用。结果:ELISA结果显示,重组Tp0971能在0.5～10μg/ml剂量范围内诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。并能促进其mRNA表达,采用转录抑制剂放线菌素D(Act D)或翻译抑制剂放线菌酮(CHX)处理后,TNF-α和IL-1β的转录和分泌水平显著降低。Tp0971也可诱导p38,ERK1/2以及JNK1/2磷酸化,采用其相应的抑制剂处理后,TNF-α和IL-1β分泌明显减少。Western blot结果也显示Tp0971能诱导NF-κB p65亚基核转位,采用NF-κB抑制剂PDTC处理后,TNF-α和IL-1β分泌水平降低。结论:Tp0971激活MAPKs和NF-κB诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。