移动单孢菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达

目的克隆与表达移动单孢菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术从移动单孢的基因组DNA中扩增出PDCzm基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达。结果扩增出DNA碱基对数目约1.7 kb的PDCzm基因,成功构建其表达质粒pZM 22 b,对转化菌株的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的37.9%。结论成功构建高效表达PDCzm基因的工程菌株,为实现利用PDCzm进行的生物转化奠定了基础。     

内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

阿尔采末病Aβ多肽基因的高效表达及纯化研究

目的　通过对Aβ多肽基因进行重组克隆 ,构建质粒和高效表达的菌株 ,并研究表达产物快速高效的纯化回收方法。方法　采用IMPACT TWIN表达系统构建Intein Aβ重组基因表达质粒 ,将该质粒转化至BL2 1(DE3) ,筛选高效表达菌株 ;表达产物经ChitinBeads亲和层析柱分离纯化 ;SDS PAGE电泳 ,毛细管区带电泳及免疫印迹法等鉴定。结果　重组的Intein Aβ基因在BL2 1中获得高效表达 ,筛选出稳定高效表达的BL2 1(DE3)细胞株 ;融合蛋白表达量可达全菌蛋白的 6 0 % ;表达产物经ChitinBeads亲和层析纯化后 ,其纯度可达 98%以上 ,并具有与Aβ多肽相同的分子量及免疫学活性。结论　Aβ多肽基因在IMPACT TWIN系统中可获得高效表达 ,利用ChitinBeads亲和层析方法可将表达的Aβ多肽进行快速、简便、无酶化的高效分离纯化。     

一种用于筛选启动子元件库的酵母检测载体的构建及初步应用

天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red。为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

人PPARγ_1LBD融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化

目的制备高纯度的人PPARγ1LBD融合蛋白,为筛选其配体奠定基础。方法以人脂肪组织总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出人PPARγ1LBD基因的cDNA片段,将其插入表达载体pMAL-p2X的麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)编码基因malE的下游,转化宿主菌E.coli.TB1。并对重组质粒在大肠杆菌TB1中的表达条件进行了优化。结果经BamHⅠ和HindⅢ双酶切,获得分子量为909bpDNA条带;当诱导剂IPTG浓度为0.4mmol.L-1,30℃振荡诱导培养6h时,重组菌TB1高效表达MBP-PPARγ1LBD融合蛋白,表达量可达胞质总蛋白的38.54%。结论成功构建了能在TB1中高效表达人PPARγ1LBD融合蛋白的重组质粒,获得了具有高生物活性的融合蛋白。     

人胎盘TRAIL基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增了可溶性TRAIL(凋亡素配体2)基因片段.序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同.将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c(+)上,构建表达质粒pET-28c(+)TRAIL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得表达菌株BL-pET-28c(+)TRAIL.表达菌经1 mmol/L的IPTG诱导表达4h后,产生大量的重组人TRAIL蛋白,SDS-PAGE扫描计算机灰度分析表明,表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40%以上.     

内源性血管生成抑制因子A rresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并进行表达,抑制新生血管的药理学实验中发现,该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli JM109进行原核表达,大量表达提取Arresten蛋白,用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定。结果成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E.coliJM109菌株中2~8 h均可获得表达,其中诱导4 h表达效率最高,Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,活性功能明显强于血管抑素。结论成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr,并可在E.coli JM109菌株中获得表达,Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用。     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

人胎盘TRAIL基因的克隆和大肠杆菌中的表达

从人胎盘中提取总RNA，利用RT－PCR技术扩增了可溶性TRAIL（凋亡素配体2）基因片段。序列分析表明该基因序列与国外发表的可溶性TRAIL基因片段的序列完全相同。将该基因片段插入到含T7启动子的质粒pET-28c( )上，构建表达质粒pET-28c( )TRAIL，转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选获得表达菌株BL－pET-28c( )TRAIL。表达菌经1mmol/L的IPTG诱导表达4h后，产生大量的重组人TRAIL蛋白，SDS－PAGE扫描计算机灰度分析表明，表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白的40％ 以上。     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的克隆大鼠肝再生增强因子 (ALR)编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT_PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片断亚克隆到pBV221质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的ALRcDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 ,并获得了原核细胞高效表达     

重组腺相关病毒介导红荧光蛋白在骨髓间充质干细胞的表达

目的构建表达红荧光(DsRed)重组腺相关病毒,研究腺相关病毒对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的转染效率。方法DsRed目的基因经酶切插入载体质粒pAAV-MCS,构建重组质粒pAAV-DsRed。磷酸钙法转染AAV-293细胞获取重组腺相关病毒。将AAV-DsRed体外转染原代培养的兔BMSCs,分析其转染效率。结果成功构建重组质粒pAAV-DsRed,获得腺相关病毒AAV-DsRed,并感染兔BMSCs。结论腺相关病毒能够转染BMSCs并表达外源基因,具有应用于临床治疗的潜力。     

G蛋白竞争性抑制肽基因的克隆、表达及其对心肌肥大的预防作用

目的:克隆和表达G蛋白竞争性抑制肽(GCIP)基因,并研究其抗心肌肥大活性。方法:克隆GCIP基因,采用RTS500 系统表达,镍螯合亲和层析方法纯化;测定其对培养细胞[~3H]亮氨酸掺入量及总蛋白含量的影响,观察其抗心肌肥大的活性。结果:构建了pTVEX2.3MCS-GCIP表达载体,用RTS500系统成功表达了GCIP,RTS表达的GCIP占反应液总蛋白的2.43％,RTS系统表达的GCIP经镍柱纯化后,SDSPAGE显示均能得到一条分子量约8.5kDa的单一的条带,对GCIP的抗心肌肥大作用做了初步研究,结果显示GCIP 100μg/L、1mg/L和 10mg/L组[~3H]Leu掺入量和总蛋白含量已明显减少(P<0.01)。结论:成功构建了GCIP的表达载体pTVEX2.3MCS-GCIP,用RTS500系统表达GCIP蛋白,并经镍柱纯化,其表达量约为100mg/L,表达的GCIP在细胞模型具有抗心肌肥大活性。     

抗癫痫肽/GST融合表达载体的构建及蛋白表达

目的构建抗癫痫肽(anti-epilepsy peptide,AEP)/GST融合表达载体,原核表达GST-AEP融合蛋白。方法从克隆载体质粒pGEM-T/AEP中双酶切,得到AEP片段;通过中间载体puc18,转换酶位点;最后将AEP基因克隆入表达载体pGEX-4T-1质粒中,构建融合表达载体pGEX-4T-1/AEP;转化感受态大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-AEP融合蛋白;SDS-PAGE分析表达产物,确定蛋白质高表达条件;超声裂解法鉴定蛋白质可容性;凝胶薄层扫描确定蛋白质相对表达量。结果经酶切鉴定、测序证明,AEP基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量约为36 000的融合蛋白,该融合蛋白以包涵体形式存在,约占总蛋白质的70%左右。结论pGEX-4T-1/AEP载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

胰腺癌Bx-PC3细胞Survivin基因ShRNA质粒表达载体的构建

目的：构建针对胰腺癌Bx—PC3细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体。方法：以Survivin基因为靶点，通过自行设计并构建包含两段短发夹状RNA（small hairpin RNA，shRNA），携带有各自的U6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，EGFP）基因和Neo基因的pGenesil-1 Survivin shRNA载体，利用脂质体介导的方法转染人胰腺癌Bx—PC3细胞，RT—PCR观察其对Bx—PC3细胞Survivin基因表达的影响。结果：HE1质粒和HE2质粒的酶切鉴定正确，质粒转化菌液HE1、HE2进行测序分析均为插入正确的克隆质粒。胰腺癌Bx—PC3细胞转染成功。转染细胞后SurvivinmRNA的表达有明显抑制。结论：实验构建针对胰腺癌细胞Survivin基因2条shRNA的质粒表达载体成功。     

核心蛋白聚糖原核表达体系的构建

目的通过克隆核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建原核表达体系并表达DCN蛋白。方法利用特异引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增编码DCN分子的外显子序列,与表达载体pET-21a(+)重组,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN的重组质粒。经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)中,用IPTG37℃诱导获得DCN融合蛋白。结果克隆了hDCN基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN重组质粒,获得了稳定的pET-21a(+)-DCN原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白。结论建立了pET-21a(+)-DCN稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN。     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

人肺癌转移相关蛋白1重组慢病毒载体的构建和病毒包装及其鉴定

目的构建人肺癌转移相关蛋白1（LCMR1）重组慢病毒载体,并包装慢病毒颗粒,为进一步研究该基因在人肺癌发生发展中的功能提供实验基础。方法将人肺癌转移相关基因LCMR1扩增后,酶切连接构建人pLVX—IRES—Neo病毒载体,转化DH5a大肠杆菌,挑取阳性克隆测序鉴定,将重组质粒与慢病毒系统一起转染Lenti—X293T病毒包装细胞,并将收集的病毒感染肺癌细胞系95C,即时定量聚合酶链反应（q—PCR）及蛋白质印迹法验证其表达情况。结果DNA测序结果证实成功构建人LCMR1重组慢病毒载体,包装后的病毒浓缩液浓度可达2．5×10^8IFU／ml以上。包装后的病毒颗粒感染95C细胞系,LCMR1的mRNA水平提高9．98倍（P〈0．05）,蛋白水平的表达也明显增强。结论本研究成功构建了pLVX—IRES—LCMR1-Neo慢病毒载体,获得的慢病毒颗粒有效感染肺癌细胞系95C,为研究该基因在肺癌中的功能建立了模型。