榛花消肾安胶囊干预实验性糖尿病大鼠足细胞相关蛋白琢-actinin-4的研究

[目的] 通过实验观察实验性糖尿病（DM）大鼠的肾脏及足细胞相关蛋白α-actinin-4的表达,表明“榛花消肾安胶囊”治疗糖尿病肾病的有效性。[方法] 建立链脲佐菌素（STZ）诱导的实验性糖尿病大鼠模型分为DM模型组、对照组、中药组、西药组,中药组给予榛花消肾安胶囊,西药组给予厄贝沙坦片;检测空腹血糖、24 h尿微量白蛋白、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）,应用光学显微镜和透射电镜及免疫组化方法观察足细胞骨架蛋白α-actinin-4的表达;应用实时定量聚合酶链反应（PCR）技术检测α-actinin-4 m RNA表达。[结果] 中药干预之后中药高、中、低剂量组及西药对照组尿量较DM模型组明显减少（P<0.01）;中药各剂量组与西药对照组大鼠血糖均明显低于DM模型组（P<0.01）;中药各剂量组和西药对照组大鼠α-actinin-4及mRNA含量均低于DM模型组（P<0.01）。[结论] 榛花消肾安胶囊能够降低实验性DM大鼠血糖、Scr、BUN,减少尿微量白蛋白的排泄,而改善肾功能;能够抑制实验性DM大鼠早期肾脏体积增大,而抑制α-actinin-4蛋白表达及其m RNA的表达。     

“黄芪-丹参”对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化及低氧诱导因子-1α表达的影响

[目的] 通过单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型探讨“黄芪-丹参”对于肾间质纤维化和肾小管上皮细胞转分化（EMT）的作用以及缺氧诱导因子（HIF）-1α表达的影响。[方法] 将大鼠分为假手术组、模型组、芪参低剂量组、芪参中剂量组、芪参高剂量组、氯沙坦组。采用UUO模型并灌胃、取材。Masson染色法观察大鼠肾脏组织病理改变;免疫组化法检测大鼠肾脏组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达;PCR法检测大鼠肾脏组织1型胶原蛋白（Col1）、纤连蛋白（FN）mRNA表达;蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测大鼠肾脏组织HIF-1α蛋白表达。[结果] Masson染色：模型组与假手术组比较,胶原容积升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）;芪参中、高剂量与模型组比较出现下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）;氯沙坦组与模型组比较下降,差异具有统计学意义（P＜0.001）。免疫组化：大鼠模型组与假手术组比较,α-SMA蛋白表达升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）;芪参中、高剂量以及氯沙坦组与模型组比较,α-SMA均下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）。实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测：模型组对比假手术组,Col1、FN表达水平升高（P＜0.001）,药物组与模型组比较Col1、FN表达降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western Blot检测：模型组与假手术组比较,HIF-1α表达升高,差异具有统计学意义（P＜0.001）;芪参中剂量较模型组有下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）。[结论] “黄芪-丹参”药对可以通过抑制细胞外基质的生成以及减轻肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化两个方面延缓肾间质纤维化,其机制可能与抑制HIF-1α表达有关。     

电针人迎、太冲穴对自发性高血压大鼠模型肾脏组织FoxP3和RORγt的影响

[目的] 观察“活血散风”针刺法对高血压前期大鼠肾脏组织叉头转录因子（FoxP3）和维甲酸相关孤独核受体（RORγt）蛋白和mRNA表达的影响。[方法] 将16只4周龄自发性高血压大鼠（SHRs）随机分为模型组（SHR组）和电针组（电针+SHR组）,每组8只,另将8只同周龄WKY大鼠作为空白对照组（WKY组）。电针组给予针刺人迎、太冲治疗,每日1次,连续治疗2周。采用Softron无创血压仪测量干预前、干预1周、干预2周时的收缩压水平,苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠肾脏结构形态,蛋白免疫印迹（Western blot）和聚合酶链反应（PCR）技术检测大鼠肾脏组织FoxP3、RORγt蛋白和mRNA表达情况。[结果] SHR大鼠收缩压水平明显高于WKY组（P<0.05）,干预两周后,电针+SHR组收缩压水平明显低于SHR组（P<0.05）;SHR组肾脏组织RORγt mRNA表达明显高于WKY组（P<0.05）,FoxP3蛋白和mRNA的表达、FoxP3/RORγt比值明显低于WKY组（P<0.05）;电针+SHR组肾脏组织RORγt mRNA表达明显低于SHR组（P<0.05）,FoxP3蛋白表达、FoxP3/RORγt比值明显高于SHR组（P<0.05）;电针干预后SHR大鼠未出现明显的肾脏形态改变。[结论] “活血散风”针刺法可调节FoxP3和RORγt的表达,其对高血压前期大鼠的降压作用可能与调节FoxP3和RORγt的平衡有关。     

丹参多酚酸盐调控Nrf2/HO-1信号通路对膜性肾病大鼠氧化应激的影响

[目的] 基于血清核转录因子2（Nrf2）/血红蛋白氧合酶-1（HO-1）信号通路探讨丹参多酚酸盐对膜性肾病（MN）大鼠氧化应激的影响。[方法] 80只SD雄性大鼠随机选取20只为正常对照组,其余60只大鼠均采用尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）构建MN模型,MN模型大鼠复制成功后随机分为模型组,盐酸贝那普利组（10 mg/kg）,丹参多酚酸盐分为低、中、高剂量组（16.7、33.3、66.7 mg/kg）。药物灌胃连续 4周,1 次/d,正常组和模型组予以相等体积的生理盐水灌胃。治疗后检测大鼠24 h尿蛋白定量（24 h UTP）。给药结束后,经大鼠腹主动脉取血检测血尿素氮（BUN）,血清肌酐（Scr）,三酰甘油（TG）,总胆固醇（TC）,总蛋白（TP）,白蛋白（ALB）水平;过碘酸-六胺银（PASM）染色观察大鼠肾组织病理形态;免疫荧光检测肾组织免疫球蛋白G（IgG）、补体C3沉积情况;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）表达情况;蛋白免疫印迹法（Western Blot）和实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）观察肾组织Nrf2、HO-1蛋白及Nrf2、HO-1 mRNA表达。[结果] 与正常组相比,模型组大鼠肾小球出现体积增大、基底膜增厚、“钉突”形成,沿毛细血管襻有补体C3、IgG弥漫性沉积,24 h UTP、血清TG、TC水平显著升高（P<0.01）,TP、ALB水平显著降低（P<0.01）,BUN、SCr差异无统计学意义;血清中SOD表达显著降低（P<0.01）,MDA表达显著升高（P<0.01）;肾组织Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达显著降低（P<0.01）。与模型组相比,各治疗组大鼠24 h UTP、血清TG、TC水平显著降低（P<0.05或P<0.01）,TP、ALB 水平显著升高（P<0.01）,但丹参多酚酸盐低剂量组改善不明显;各治疗组肾脏病理损害明显改善;SOD表达水平显著升高（P<0.01）,MDA表达水平明显降低（P<0.01）;Nrf2、HO-1mRNA及蛋白表达显著升高（P<0.05或P<0.01）。[结论] 丹参多酚酸盐可能通过调控Nrf2/HO-1信号通路,缓解肾组织氧化应激,进而保护肾脏及延缓疾病进展。     

加味升降散对糖尿病肾病大鼠肾脏内质网应激和Sirt1/PERK通路的影响

目的 探讨加味升降散减轻糖尿病肾病（DN）大鼠内质网应激,降低尿蛋白的分子机制。方法 将75只SD大鼠随机分为正常组、模型组、加味升降散低、中、高剂量组（4.37、8.73、17.46 g·kg^-1）和厄贝沙坦组（0.014 g·kg^-1）,每组10只。分别给予相应剂量药物或者蒸馏水灌胃,每日1次,连续给药8周。末次给药后检测大鼠血糖（GLU）、24 h尿蛋白（UTP）含量,肾脏组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平;苏木素-伊红（HE）染色、过碘酸-雪夫（PAS）染色和透射电镜观察大鼠肾脏病理学改变;免疫组化法（IHC）检测大鼠肾脏中肾病蛋白（Nephrin）、足细胞裂隙膜蛋白（Podocin）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）和激活转录因子4（ATF4）蛋白表达水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠肾脏中沉默调节蛋白1（Sirt1）、磷酸化（p）-蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）、p-真核翻译起始因子（eIF2α）蛋白表达水平。结果 与正常组比较,模型组大鼠肾脏病理损伤较重,GLU、UTP水平明显升高（P<0.05）,大鼠肾脏中GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK、p-eIF2α蛋白表达水平升高、Sirt1蛋白表达下降（P<0.05）;与模型组比较,加味升降散各剂量组及厄贝沙坦组大鼠GLU、24 h UTP水平有不同程度的降低（P<0.05）,肾脏病理损伤明显减轻,GRP78、CHOP、ATF4、p-PERK、p-eIF2α蛋白表达水平均下降（P<0.05）,Sirt1蛋白表达上升（P<0.05）。结论 加味升降散上调DN大鼠肾脏组织中Sirt1表达,抑制PERK/eIF2α通路蛋白的磷酸化,减轻肾组织ER应激反应和氧化应激,是其减轻DN大鼠肾脏病理损伤和尿蛋白的作用机制。     

基于JAK2-STAT3途径探讨黄连素对高糖诱导足细胞损伤的修复机制

[目的] 从JAK2-STAT3途径探讨黄连素对高糖诱导足细胞损伤的修复机制。[方法] 培养MPC-5条件永生化小鼠足细胞,将细胞分为正常糖浓度组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖浓度组（30 mmol/L葡萄糖）、高糖+10 μmol/L黄连素组、高糖+25 μmol/L黄连素组和高糖+50 μmol/L黄连素组。正常糖浓度组常规培养;其余各组采用相应培养基培养48 h。噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率;Transwell实验检测细胞的迁移能力;白蛋白流量率检测法测定足细胞屏障功能;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot）法分别检测JAK2和STAT3 mRNA和蛋白表达。[结果] 与正常糖浓度组相比,高糖刺激后足细胞存活率明显降低,迁移能力提高,屏障功能下降,JAK2和STAT3 mRNA和蛋白表达量提高（均P<0.01）;黄连素各组能不同程度促进足细胞存活,降低迁移能力,提高其障功能,并降低JAK2和STAT3 mRNA和蛋白表达;且呈浓度依赖性（P<0.05,P<0.01）。[结论] 黄连素能保护高糖诱导的足细胞损伤,提高足细胞在高糖环境下的存活率、降低其迁移率,维持其屏障功能,其机制可能与调控JAK2和STAT3基因与蛋白表达有关。     

加减补阳还五汤通过SIRT1途径激活自噬改善糖尿病肾病小鼠肾组织损伤

[目的] 探讨加减补阳还五汤是否通过沉默信息调节因子1（SIRT1）途径激活自噬改善糖尿病肾病（DKD）小鼠肾组织损伤。[方法] 将DKD小鼠随机分为模型组、中药组,db/m组小鼠作为正常组。给药8周后,检测小鼠血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HBA1c）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、尿微量白蛋白（mALB）水平;实时定量反转录聚合酶连锁反应（qRT-PCR）和免疫组化检测小鼠肾组织Wilms肿瘤基因1（WT1）、nephrin及podocin的表达;蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测小鼠肾组织SIRT1、人微管相关蛋白轻链3B（LC3B）、自噬相关蛋白7（Agt7）、自噬受体蛋白p62（P62）、Bcl-2同源结构域蛋白抗体（Beclin1）、B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、BCL-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表达;同时光镜观察肾脏病理形态学变化。[结果] 中药干预后,小鼠肾脏病理改变轻于模型组;尿微量白蛋白（mAlb）、血脂（TC、TG）下降,肾功能（BUN、Scr）改善;同时抑制了肾组织P62、Bax、Caspase-3表达,上调了SIRT1、Beclin-1、Agt7、Bcl-2、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达,并改善了肾组织足细胞标志蛋白WT1、nephrin及podocin的表达（P＜0.05或P＜0.01）,但对血糖水平无明显影响（P＞0.05）。[结论] 加减补阳还五汤可通过增强DKD小鼠肾脏细胞自噬,并抑制其凋亡,保护足细胞,进而发挥肾脏保护作用。其中SIRT1途径可能是其促进自噬的潜在途径。     

加味升降散调控HIF-1α/NOX4信号通路对膜性肾病大鼠氧化应激和凋亡的影响

目的 探讨加味升降散对膜性肾病（MN）大鼠血清缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）信号通路的干预作用,研究其减轻肾组织氧化应激和凋亡的相关机制。方法 采用阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）尾静脉注射方法复制MN模型,将成功造模的大鼠随机分为模型组,加味升降散组和贝那普利组。各组根据相应的药物剂量灌胃（ig）,每日1次。在给药的第4周末检测相关指标,检测24 h尿蛋白（UTP）,尿素氮（BUN）,肌酐（SCr）的变化情况,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠肾脏中超氧化物歧化酶（SOD）,丙二醛（MDA）,活性氧（ROS）水平,原位末端标记法（TUNEL）检测大鼠肾组织细胞凋亡率,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测大鼠肾脏中HIF-1α,NOX4的mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠肾脏HIF-1α,NOX4蛋白表达水平,免疫组化（IHC）检测大鼠肾脏相关凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）,B细胞淋巴瘤-xl（Bcl-xl）,Bcl-2相关X蛋白（Bax）,Bcl-2细胞死亡调节子抗体（Bim）蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠UTP明显上升（P<0.05）,SOD水平明显减少,MDA,ROS明显增多（P<0.05）,HIF-1α,NOX4的mRNA及蛋白表达水平明显上升（P<0.05）,Bax,Bim蛋白表达水平明显增高,Bcl-xl,Bcl-2蛋白表达水平下降（P<0.05）,肾组织细胞凋亡显著增多;与模型组比较,各给药组大鼠UTP水平均有不同程度下降（P<0.05）,SOD水平明显上调,MDA,ROS含量显著下降（P<0.05）,HIF-1α,NOX4的mRNA及蛋白表达量明显下降（P<0.05）,Bax,Bim蛋白表达水平下降,Bcl-xl,Bcl-2蛋白表达水平明显上升（P<0.05）,肾组织细胞凋亡显著减少。结论 加味升降散的保肾作用可能与其通过抑制HIF-1α/NOX4通路,缓解MN大鼠肾组织氧化应激状态,减少肾组织细胞凋亡有关。     

膜肾1号方对大鼠肾脏病理及PI3K/Akt/mTOR信号通路表达的影响

[目的] 观察膜肾1号方对膜性肾病大鼠肾脏病理的改善作用及其对自噬通路磷脂肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）相关蛋白表达的影响。[方法] 将大鼠随机分为对照组、模型组、膜肾1号方高剂量组、中剂量组、低剂量组,盐酸贝那普利组。采用大鼠尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）的方法建立MN大鼠模型,灌胃、取材。苏木精-伊红（HE ）染色法观察大鼠肾脏组织病理改变;免疫球蛋白G（IgG）免疫荧光染色观察大鼠IgG沉积;蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测PI3K/Akt/mTOR 信号通路相关蛋白及自噬相关蛋白轻链3（LC3）表达。[结果] 药物干预后,膜肾1号方组大鼠24 h尿蛋白、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白下降且低于模型组,并具有统计学差异（P＜0.05）。光镜下观察,HE染色示正常组肾组织整体结构基本正常,膜性肾病（MN）模型组肾小球毛细血管丛充血,系膜增生,基底膜出现增厚,部分肾小管细胞空泡变、组织内可见炎症细胞浸润,可见嗜复红蛋白及IgG沉积。经膜肾1号方和盐酸贝那普利干预后,大鼠肾脏病理学改变均有所减轻。各组大鼠IgG沉积显示,与对照组比较模型组IgG沉积明显,IgG荧光表达升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）,盐酸贝那普利组和膜肾1号方组IgG荧光表达下降且低于模型组,具有统计学差异（P＜0.05）。Western Blot检测显示,药物干预后,盐酸贝那普利组和膜肾1号方组大鼠PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达下降,LC3 表达增加,并具有统计学差异（P＜0.05）。[结论] 膜肾1号方可改善大鼠肾脏病理损伤,膜肾1号方干预后PI3K-Akt信号通路相关蛋白磷酸化磷酸肌醇3激酶（p-PI3K）,磷酸化Akt蛋白（p-Akt）,磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）表达明显降低,自噬相关蛋白LC3表达升高,其分子机制与自噬信号通路的调控有关。     

基于AKAP1/Drp1信号通路探讨当归补血汤对糖尿病肾病大鼠足细胞线粒体分裂及凋亡的影响

目的 观察当归补血汤对糖尿病肾病（DKD）大鼠足细胞线粒体分裂及凋亡的影响,探讨当归补血汤对DKD大鼠肾脏保护作用及机制。方法 SD大鼠随机分为造模组65只,喂养高糖高脂饲料;正常组10只,喂养普通饲料;6周后,造模组大鼠予腹腔注射链脲佐菌素（STZ）制备2型糖尿病（T2DM）模型。将制备成功的T2DM大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组（0.014 g·kg^-1）、当归补血汤低、中、高剂量组（0.36、0.72、1.44 g·kg^-1）。连续灌胃16周。治疗第16周末检测各组大鼠空腹血糖（FBG）、24 h尿蛋白（24 h UTP）;苏木素-伊红（HE）、马松（Masson）染色观察大鼠肾组织病理;透射电镜（TEM）观察足细胞线粒体;二氢乙锭（DHE）法检测大鼠肾组织活性氧簇（ROS）表达水平;原位末端标记法（TUNEL）检测各组大鼠肾细胞凋亡情况;免疫组化法（IHC）检测大鼠肾组织中足细胞标志蛋白突触足蛋白（Synaptopodin）、膜蛋白（Podocin）及切割型胱天蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）表达水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肾组织激酶锚定蛋白1（AKAP1）、磷酸化动力相关蛋白1（p-Drp1）、线粒体融合蛋白2（Mfn2）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠FBG、24 h UTP表达升高;可见肾小球内系膜增生,基底膜增厚;电镜下足细胞线粒体肿胀,线粒体嵴断裂、紊乱;ROS表达增加,TUNEL阳性细胞明显增多,Synaptopodin、Podocin表达降低,cleaved Caspase-3表达增加,AKAP1、p-Drp1表达增加,Mfn2、Bcl-2/Bax表达降低（P<0.01）;与模型组比较,当归补血汤高剂量组能降低FBG、24 h UTP水平,肾组织病理损伤及足细胞线粒体损伤明显改善,ROS表达减少,肾组织TUNEL阳性细胞数明显减少,Synaptopodin、Podocin表达升高,cleaved Caspase-3表达降低,AKAP1、p-Drp1表达降低,Mfn2、Bcl-2/Bax表达增加（P<0.05,P<0.01）。结论 当归补血汤可通过调控AKAP1/Drp1通路抑制足细胞线粒体分裂及凋亡,减少蛋白尿,从而延缓DKD进展。