人源肝癌细胞系中甲胎蛋白基因表达及甲基化的研究

目的:了解不同人源肝癌细胞系甲胎蛋白(AFP)基因表达及不同区域甲基化状态,探讨肝癌发生的表达遗传学调控机制。方法:采用亚硫酸氢盐-基因组测序(bisulfite-assisted genomic sequencing,BAGS)技术,检测人源HepG2、SMMC-7721肝癌细胞系和人成纤维细胞中AFP基因启动子区及CpG岛区的甲基化水平,RT-PCR检测基因的表达,并分析相关性。结果:HepG2细胞高表达AFP,SMMC-7721细胞低表达AFP,成纤维细胞不表达AFP;在启动子区,HepG2细胞的非甲基化修饰位点发生率较高,尤其是第一个和第二个CG位点,SMMC-7721细胞的甲基化程度较之高,而成纤维细胞甲基化程度整体很高;在CpG岛区,成纤维细胞的非甲基化修饰位点发生率较高,主要是第6个和第7个CG位点,SMMC-7721、HepG2细胞的甲基化程度较之高。结论:AFP基因启动子甲基化程度与基因表达水平存在负相关,AFP基因CpG岛甲基化程度与基因是否表达有关,AFP基因启动子低甲基化可能是AFP高表达的分子机制。     

食管鳞状细胞癌中MT-3基因表达与启动子区CpG岛甲基化相关性

目的:使用启动子区CpG岛的甲基化特异性PCR(MSP),分析食管鳞状细胞癌中MT-3基因表达与启动子区CpG岛甲基化的相关性。方法:对MT-3基因启动子区的用MSP检测方法,并以DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂5-氮2'-脱氧胞(5-aza-CdR)分别处理食管鳞状细胞癌组织及HET-1A细胞株,检测MT-3基因启动子区甲基化状态变化,Western blot检测蛋白表达。结果:食管鳞状细胞癌组织中MT-3基因启动子区呈甲基化状态,HET-1A细胞株MT-3基因启动子区呈非甲基化状态。采用5'-Aza-dC去除食管鳞状细胞癌组织中MT-3基因启动子区甲基化后,金属硫蛋白3表达水平上升了9.2倍。结论:MT-3启动子区CpG岛甲基化可能是导致金属硫蛋白3低表达的重要机制,其结果则导致食管癌发生。     

SFRP5在白血病细胞中基因甲基化状态及蛋白表达分析

目的检测白血病患者标本及细胞系中分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)基因启动子区域的甲基化状态及蛋白表达情况。方法甲基化特异性PCR(MSP)检测白血病患者及细胞系中SFRP5基因启动子区甲基化状态,亚硫酸盐测序PCR(BSP)方法检测KG1a细胞中SFRP5基因甲基化状态,Western blot方法检测SFRP5蛋白在白血病患者及细胞系中的表达。结果 12例白血病患者标本中有7例发生了SFRP5基因甲基化,6例正常对照标本均未发生SFRP5基因甲基化。4种白血病细胞系(HL-60、Raji、U937、KG1a)中均发生SFRP5基因甲基化。KG1a细胞中SFRP5基因启动子区-394 bp到+99 bp位点的CpG总甲基化频率为82.5%。白血病患者标本中有7例存在SFRP5蛋白表达,6例正常标本存在SFRP5蛋白表达,4种白血病细胞系中未检测到SFRP5蛋白表达。使用去甲基化试剂DAC处理4种白血病细胞系,结果均恢复SFRP5蛋白表达。结论白血病细胞中存在SFRP5基因启动子区甲基化,并导致SFRP5蛋白表达缺失或下调。     

The significance of mRNA expression and methylation of SFRP1 promoter in invasive breast cancer

目的 探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中分泌型卷曲相关蛋白1(the secreted frizzled-related protein 1,SFRP1)基因的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义.方法 采用实时荧光定量PCR技术及甲基化聚合酶链反应(MSP)技术检测58例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中SFRP1基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况,并分析其与临床病理参数之间的关系.结果 浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组(P<0.05);腋窝淋巴结有转移的浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于腋窝淋巴结无转移组(P<0.05),而与其他临床病理参数无关.SFRP1在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在23例SFRP1基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组,均未检测到SFRP1的mRNA表达.结论 SFRP1基因异常甲基化可能影响其 mRNA的转录水平;SFRP1基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关,对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助.     

浸润性乳腺癌SFRP1基因的表达及其启动子甲基化的意义

目的探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中分泌型卷曲相关蛋白1(the secreted frizzled-relat-ed protein 1,SFRP1)基因的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR技术及甲基化聚合酶链反应(MSP)技术检测58例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中SFRP1基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况,并分析其与临床病理参数之间的关系。结果浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组(P<0.05);腋窝淋巴结有转移的浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于腋窝淋巴结无转移组(P<0.05),而与其他临床病理参数无关。SFRP1在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在23例SFRP1基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组,均未检测到SFRP1的mRNA表达。结论 SFRP1基因异常甲基化可能影响其mRNA的转录水平;SFRP1基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关,对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助。     

对TRAIL耐药的肝癌细胞caspase-8基因甲基化状态及其mRNA表达

目的研究肝癌细胞株HepG2和SMMC 7721对肿瘤坏死因子相关与凋亡诱配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)的敏感性与caspase-8基因启动子区5′CpG岛的甲基化状态和mRNA表达的关系及5′-氮-2′-杂脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对TRAIL抗癌活性的影响.方法采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR method, MSP)方法检测caspase-8基因5′CpG岛甲基化状态;采用RT-PCR方法检测caspase-8 mRNA表达;采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色方法检测细胞凋亡.结果 2株肝癌细胞均属TRAIL耐药细胞,caspase-8基因5′CpG岛均为非甲基化状态; 5-Aza-CdR即不能增加caspase-8 mRNA表达,亦不能提高肝癌细胞对TRAIL的敏感性.结论肝癌细胞对TRAIL的敏感性与caspase-8基因的甲基化状态及mRNA表达无关,5-Aza-CdR不能提高肝癌细胞对TRAIL的敏感性.     

乳腺癌细胞中PNRC基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的 研究乳腺癌细胞中富含脯氨酸核受体辅活化子(proline-rich nuclear receptor coactivator protein,PNRC)基因启动子CpG岛的甲基化状态及在PNRC转录调节中的作用.方法 应用PT-PCR检测PNRC基因在正常乳腺细胞与乳腺癌细胞中的表达情况,并运用"MethPrimer"软件对PNRC启动子区进行分析,预测CpG岛,通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测PNRC启动子区CpG岛的甲基化状况;PT-PCR及Northern杂交检测乳腺癌细胞经甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dc)作用后,PNRC基因mRNA的表达情况;Westernblot检测5-Aza-dc干预对PNRC蛋白表达的影响;将含PNRC启动子序列的报告质粒转染乳腺癌细胞,再经5-Aza-dc处理后,检测PNRC基因启动子的活性.结果 PNRC基因在乳腺癌细胞中的表达较正常乳腺细胞明显降低;乳腺癌细胞PNRC基因启动子区存在CpG岛甲基化;乳腺癌细胞经5-Aza-dc处理后,PNRC基因mRNA及蛋白表达水平显著增加,其PNRC基因启动子的活性也明显增强.结论 PNRC基因启动子区的高甲基化导致PNRC在乳腺癌细胞中表达降低.     

重组天花粉蛋白体外诱导宫颈癌 HeLa 细胞 p27 基因去甲基化的研究

目的 研究重组天花粉蛋白 (recombinant trichosanthin, rTCS) 对宫颈癌 HeLa 细胞中 p27 基因甲基化状态和基因表达的影响。方法 应用不同质量浓度的 rTCS (20、40、80 μg/mL) 处理体外培养的宫颈癌 HeLa 细胞后,MSP 法检测用药前后细胞中 p27 基因的甲基化状态,RealTime PCR 法检测用药前后细胞中 p27 和 DNA 甲基转移酶1 (DNMT1) mRNA 水平的变化,Westernblotting 法检测用药前后细胞中 p27 蛋白表达的变化。结果 HeLa 细胞中 p27 基因为低表达,基因启动子区 CpG 岛呈部分甲基 化状态。40 μg/mL rTCS 处理导致 p27 基因启动子区 CpG 岛去甲基化;在 20、40、80 μg/mL 的 rTCS 作用 48 h 后,p27 基因 mRNA 相对表达水平分别升高 2.22、4.00、6.03 倍,p27 蛋白水平表达也逐渐增加;宫颈癌 HeLa 细胞中 DNMT1 mRNA 高表达,40 μg/mL rTCS 处理 48 h 可至 DNMT1 mRNA 表达水平降低 78%。结论 rTCS 通过抑制 DNMT1,逆转 p27 基因启动子区 CpG 岛的甲基化状态,使宫颈癌 HeLa 细胞中 p27 基因表达活化。rTCS 能逆转宫颈癌 HeLa 细胞 p27 基因甲基化状态,调控 p27 基因和 DNMT1 的表达。     

甲基转移酶1表达质粒对结肠癌细胞错配修复基因甲基化及其表达的影响

目的 分析DNA甲基转移酶1(Dnmt1)基因的真核表达质粒对人结肠癌细胞错配修复基因甲基化及其转录水平和微卫星不稳定性(MSI)的影响。方法 分别构建含有人的正义Dnmt1(HMT)和反义Dnmt1(THM)的真核表达质粒,将其转染入结肠癌SW1116细胞,以Western印迹实验分析各组细胞Dnmt1蛋白的表达情况。定量PCR检测hMLH1、hMSH2基因的表达。甲基化特异性PCR分析hMLH1、hMSH2启动子区甲基化情况,银染法研究其对微卫星不稳定性的影响。结果 转染正义Dnmt1质粒的细胞hMLH1、hMSH2的启动子甲基化水平升高,基因mRNA表达降低。转染反义Dnmt1质粒可使细胞中hMSH2启动子呈非甲基化状态,基因表达增强。未发现转染正义和反义Dnmt1基因的SW1116细胞存在MSI的变化。结论 重组Dnmt1表达质粒可通过调控人结肠癌细胞中错配修复基因的甲基化影响基因的表达。     

DNA 甲基化对NOR1 基因启动子活性和基因表达的影响

目的:研究DNA 甲基化对NOR1 基因启动子活性和表达的影响。方法:采用SssI 甲基转移酶处理NOR1基因启动子报告载体,经重亚硫酸钠修饰后测序检测报告载体甲基化水平。未经SssI 处理和经SssI 处理的NOR1 基因启动子报告载体分别转染细胞,检测荧光素酶活性或GFP 表达。采用去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理白血病细胞系HL60 细胞,抽提RNA,Real-time RT-PCR 检测NOR1 mRNA 表达水平。结果:重亚硫酸钠测序表明SssI 甲基转移酶体外处理导致NOR1 启动子CpG 岛CG 位点完全甲基化。体外甲基化的NOR1 启动子活性完全丧失。去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷连续处理3 d 后,白血病细胞系HL60 细胞中内源性NOR1 mRNA 表达水平显著增加。结论:SssI 甲基转移酶可用于体外甲基化修饰NOR1 基因启动子报告载体。甲基化修饰导致NOR1 启动子活性丧失。去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理恢复NOR1 mRNA 表达。