SFRP5在白血病细胞中基因甲基化状态及蛋白表达分析

目的检测白血病患者标本及细胞系中分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)基因启动子区域的甲基化状态及蛋白表达情况。方法甲基化特异性PCR(MSP)检测白血病患者及细胞系中SFRP5基因启动子区甲基化状态,亚硫酸盐测序PCR(BSP)方法检测KG1a细胞中SFRP5基因甲基化状态,Western blot方法检测SFRP5蛋白在白血病患者及细胞系中的表达。结果 12例白血病患者标本中有7例发生了SFRP5基因甲基化,6例正常对照标本均未发生SFRP5基因甲基化。4种白血病细胞系(HL-60、Raji、U937、KG1a)中均发生SFRP5基因甲基化。KG1a细胞中SFRP5基因启动子区-394 bp到+99 bp位点的CpG总甲基化频率为82.5%。白血病患者标本中有7例存在SFRP5蛋白表达,6例正常标本存在SFRP5蛋白表达,4种白血病细胞系中未检测到SFRP5蛋白表达。使用去甲基化试剂DAC处理4种白血病细胞系,结果均恢复SFRP5蛋白表达。结论白血病细胞中存在SFRP5基因启动子区甲基化,并导致SFRP5蛋白表达缺失或下调。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对Wnt信号抑制因子SFRPs甲基化修饰的影响

目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰,从而活化Wnt信号通路.方法 将编码HCV核心蛋白的腺病毒(AdCore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染SMMC-7721细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因mRNA的表达;用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(DAC)对AdCore或AdGFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞进行去甲基化处理,进一步采用甲基化特异性PCR (MSP)和DNA甲基化测序,检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度,Western blot检测甲基化转移酶Dnmts的表达.结果 在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中,SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低(P＜0.05);甲基化分析结果表明:SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰;甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a表达量增加(P＜0.05).结论 HCV核心蛋白可以促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰,参与HCV相关疾病的发生.     

分泌型卷曲相关蛋白2基因超甲基化与大肠癌的研究

目的:研究分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)基因启动子超甲基化与大肠癌的关系.方法:用甲基化荧光定量PCR(MethyLight)技术检测44例散发型大肠癌和20例癌旁组织中SFRP2基因的启动子甲基化状况,20例健康志愿者大肠组织作为对照组.同时分析SFRP2基因超甲基化与临床病理特征的关系.结果:44例大肠癌组织中检出SFRP2基因超甲基化36例(36/44,81.8%),20例大肠癌旁组织中检出SFRP2基因超甲基化8例(8/20,40%),20例正常大肠黏膜组织中没有显示SFRP2基因任何甲基化条带.大肠癌中SFRP2基因甲基化较正常黏膜和邻近的正常黏膜更频繁.并且SFRP2基因超甲基化与任何包括性别、年龄、肿瘤分期、位置、组织学分级等临床病理特征之间没有显著的关联.结论:SFRP2基因超甲基化与大肠癌的发生有关,SFRP2基因超甲基化可以作为大肠癌筛检的高潜力标记.     

子宫内膜癌中SFRP1基因启动子甲基化及其mRNA表达

目的研究子宫内膜癌中SFRP1基因启动子甲基化及其对SFRP1 mRNA表达的影响。方法应用甲基化特异性PCR技术检测36例子宫内膜癌组织和对应癌旁组织中SFRP1基因启动子甲基化状态,RT-PCR方法检测上述样本的mRNA表达水平,并对结果进行统计学分析。结果子宫内膜癌组织中SFRP1基因启动子甲基化的阳性率为47.2%,癌旁组织中为11.1%,两者比较差异有统计学意义(P=0.001)。14例存在启动子甲基化和5例无启动子甲基化的子宫内膜癌组织中缺乏SFRP1 mRNA表达或表达较癌旁组织明显下降。结论SFRP1基因启动子甲基化在子宫内膜癌中常见,部分成为其表达下降的原因。     

The significance of mRNA expression and methylation of SFRP1 promoter in invasive breast cancer

目的 探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中分泌型卷曲相关蛋白1(the secreted frizzled-related protein 1,SFRP1)基因的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义.方法 采用实时荧光定量PCR技术及甲基化聚合酶链反应(MSP)技术检测58例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中SFRP1基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况,并分析其与临床病理参数之间的关系.结果 浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组(P<0.05);腋窝淋巴结有转移的浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于腋窝淋巴结无转移组(P<0.05),而与其他临床病理参数无关.SFRP1在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在23例SFRP1基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组,均未检测到SFRP1的mRNA表达.结论 SFRP1基因异常甲基化可能影响其 mRNA的转录水平;SFRP1基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关,对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助.     

浸润性乳腺癌SFRP1基因的表达及其启动子甲基化的意义

目的探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中分泌型卷曲相关蛋白1(the secreted frizzled-relat-ed protein 1,SFRP1)基因的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR技术及甲基化聚合酶链反应(MSP)技术检测58例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中SFRP1基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况,并分析其与临床病理参数之间的关系。结果浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组(P<0.05);腋窝淋巴结有转移的浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于腋窝淋巴结无转移组(P<0.05),而与其他临床病理参数无关。SFRP1在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在23例SFRP1基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组,均未检测到SFRP1的mRNA表达。结论 SFRP1基因异常甲基化可能影响其mRNA的转录水平;SFRP1基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关,对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助。     

食管癌组织中SFRPs基因异常甲基化检测及意义

目的检测食管鳞状细胞癌和癌旁正常组织SFRPs基因启动子区甲基化变化特征及其与临床病理变化的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)。结果 110例食管鳞癌组织SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因启动子区甲基化阳性率分别为61.8%(68/110)、66.7%(73/110)、62.7%(69/110)、64.3%(71/110),明显高于癌旁正常组织的13.3%(4/30)、13.3%(4/30)、20%(6/30)、26.7%(8/30)。淋巴结转移组和中、低分化食管鳞癌组织甲基化阳性率明显高于无淋巴结转移组及高分化食管癌组织,但是与性别,年龄及肿瘤分期无明显关联。结论本研究结果显示,SFRPs基因启动子区甲基化与食管鳞癌发生发展密切相关.这些基因的甲基化检测可为食管癌的防治和预后评价提供遗传学理论依据。。     

急性髓系白血病分泌型卷曲相关蛋白5基因启动子区甲基化状态研究

目的研究急性髓系白血病(AML)中WNT信号传导通路拮抗基因分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)基因的甲基化状态。方法应用甲基化特异性PCR(MSP)法对99例AML患者的骨髓或外周血进行SFRP5基因启动子区甲基化状况检测,并以70例门诊普通病人的外周血作为对照。结果 99例AML患者中检出10例(10.1%)SFRP5的甲基化,70例正常对照中仅检出1例(1.4%)SFRP5的甲基化。SFRP5在AML患者中的甲基化率显著高于正常对照(P<0.05)。SFRP5基因的甲基化状态与年龄、性别无关(P>0.05),与AML的临床分型相关(P<0.05)。结论 SFRP5基因的甲基化与AML有相关性,SFRP5基因的甲基化可能是引起AML的分子机制之一。     

慢性髓系白血病PDLIM4基因表达与其启动子甲基化水平的关系

目的:分析慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者PDLIM4(PDZ and LIM domain 4)基因转录本表达状况、启动子高甲基化改变及临床相关性。方法:应用实时定量PCR(RQ-PCR)及实时定量甲基化特异性PCR(RQ-MSP)技术分别检测CML患者PDLIM4基因转录本及启动子甲基化水平。结果:8/36例(22%)CML患者存在PDLIM4低表达,低表达率与21例对照组间差异有统计学意义(P=0.021);PDLIM4表达水平和CML患者bcr/abl融合基因转录本正相关(r=0.434,P=0.043)。13/59例(22%)CML患者出现PDLIM4启动子高甲基化改变,而24例对照未显示高甲基化,两组差异有统计学意义(P=0.016)。PDLIM4高甲基化与患者血液学相关参数无明显相关性。PDLIM4启动子高甲基化频率随疾病进展而增高,在慢性期、加速期及急变期中分别为16%(7/44)、33%(2/6)及44%(4/9)。结论:PDLIM4基因启动子甲基化改变可能与CML的疾病发展有关。     

慢性粒细胞白血病患者HAGE基因启动子的低甲基化

目的： 探讨中国人群慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）患者螺旋酶抗原(helicase antigen,HAGE)基因启动子的甲基化状况和临床相关性。方法： 应用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）技术对50例不同临床分期的CML患者骨髓标本HAGE基因启动子的甲基化状态进行检测。结果： 13例（26%）CML患者存在HAGE基因启动子的低甲基化改变,而24例对照均无HAGE基因低甲基化,两组比较差异有统计学意义（P=0.007)。HAGE基因启动子低甲基化改变与CML患者的年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、临床分期及染色体异常均无相关性（P>0.05）。慢性期、加速期和急变期患者中HAGE基因启动子低甲基化频率分别为25%（9/36）、25%（1/4）和30%（3/10）（P>0.05）。结论： HAGE基因启动子低甲基化是CML中的常见分子事件。     

尿多酸肽诱导慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药细胞生长抑制及分化的体外观察

目的观察尿多酸肽（CDA-2）在体外对慢性粒细胞性白血病（CML）伊马替尼（IM）耐药细胞株K562R生长抑制及诱导分化的作用。方法MTT和集落形成实验观察CDA-2对CML细胞株K562、IM耐药细胞株K562R、IM耐药和非耐药CML患者骨髓细胞生长抑制作用。吉姆萨染色观察细胞形态,膜联蛋白-V（Annexin-V）／碘化丙啶（PI）染色分析细胞凋亡,流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b、CD14的表达,反转录PCR（RT-PCR）检测细胞分化相关基因、细胞周期调节基因及DNA甲基化转移酶基因的表达。结果CDA-2均可抑制K562、K562R、IM耐药和非耐药CML患者骨髓细胞的生长,且对K562R细胞和IM耐药CML患者骨髓细胞的生长抑制更明显;CDA-2改变了K562和K562R细胞形态,诱导细胞向成熟分化,并引起细胞周期在G1期的停滞;这种停滞可能与CDA-2抑制DNA甲基转移酶活性,逆转细胞周期调节基因的甲基化状态有关。结论CDA-2在体外对K562R细胞株有很强的生长抑制和诱导分化的作用,提示CDA-2可能成为治疗IM耐药的CML患者的一种新药。     

酪氨酸蛋白磷酸酶2高表达对p210bcr/abl诱导的慢性粒细胞白血病细胞增殖与凋亡抵抗的影响

目的研究Src癌基因同源的酪氨酸蛋白磷酸酶2(Shp2)在慢性粒细胞白血病(CML)细胞中的表达,及其在p210bcr/abl诱导的白血病细胞恶性增殖和凋亡抵抗中的作用。方法收集25例p210bcr/abl阳性CML患者白血病细胞样本,8例非肿瘤病人骨髓和10例正常人外周血细胞样本作阴性对照,K562和KU812白血病细胞系作为p210bcr/abl阳性对照,KG1白血病细胞作为Shp2阳性对照。用Western印迹技术定量分析与比较Shp2在白血病细胞和正常骨髓造血细胞中的表达情况,通过特异性抑制剂分别下调Shp2和白血病融合基因p210bcr/abl后,观察Shp2表达对p210bcr/abl阳性白血病细胞增殖与凋亡的作用。细胞增殖与凋亡检测应用流式细胞仪。结果(1)磷酸化Shp2蛋白在92%患者CML白血病细胞样本中呈高表达状态,而在8例非肿瘤患者骨髓和10例正常人外周血细胞中低表达或不表达。磷酸化Shp2/β肌动蛋白比值分别为0.91±0.62、0.16±0.09和0.03±0.05(P均<0.01)。(2)下调Shp2蛋白表达后,白血病细胞凋亡率从4.89%上升到38.69%(P<0.01),而S期细胞从33.6%下降到10.8%(P<0.01)。(3)特异性抑制p210bcr/abl融合基因表达蛋白后,白血病细胞中磷酸化Shp2蛋白明显下降,同时出现明显细胞凋亡与生长抑制现象。结论(1)磷酸化Shp2蛋白在慢性粒细胞白血病细胞患者中呈过度表达状态,并且与白血病细胞恶性增殖与凋亡抵抗密切相关。(2)bcr/abl融合基因阳性患者的白血病细胞中Shp2的过度表达可能由p210bcr/abl蛋白激活引起。     

急性髓系白血病GLIPR1基因甲基化及其表达

目的：检测GLIPR1基因在急性髓系白血病（AML)细胞株和AML患者骨髓细胞中的甲基化状态和表达水平,探讨其表达水平与启动子甲基化的关系。 方法：以5株白血病细胞株, 以及54例治疗前AML患者骨髓、48例急性淋巴细胞胞白血病（ALL）患者骨髓、40例慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓、35例对照骨髓和8例治疗后完全缓解AML患者骨髓为样本,采用RT-PCR检测GLIPR1 mRNA表达水平,采用甲基化特异PCR（MS-PCR）方法检测GLIPR1基因甲基化状态,并对GLIPR1 mRNA表达水平与其甲基化状态进行相关性分析。 结果：GLIPR1基因在AML细胞株中的表达水平低于CML急性变细胞株和ALL细胞株,而前者甲基化水平高于后者。5-aza-2dC处理细胞后,GLIPR1基因在AML细胞株中的表达水平明显上调,而在CML急性变细胞株和ALL细胞株中的表达水平上调不明显。GLIPR1基因在AML骨髓中的表达水平（0.38±0.20）明显低于ALL骨髓（0.76±0.18）、CML骨髓（0.80±0.14）和对照骨髓（0.85±0.12）,在完全缓解AML骨髓中的表达水平明显高于治疗前AML骨髓（0.78±0.13 vs. 0.36±0.20）;而ALL和CML骨髓中的表达水平与对照骨髓比较无明显差异(P＞0.05）。GLIPR1基因在AML骨髓的甲基化阳性率(81.5%)明显高于ALL骨髓（37.5%)、CML骨髓（27.5%)和对照骨髓（14.3%),在完全缓解AML骨髓中的甲基化阳性率明显低于治疗前骨髓(12.5% vs. 75.0%);而在ALL和CML骨髓中的甲基化阳性率与对照骨髓比较无明显差异(P＞0.05）。GLIPR1基因在AML骨髓中的表达水平与其甲基化呈负相关。结论：GLIPR1基因在AML中表达下调或缺失及启动子甲基化可能是导致GLIPR1基因表达沉默的原因,GLIPR1基因表达和甲基化水平对判断AML患者的疗效有一定意义。     

黄连解毒汤通过抑制血红素加氧酶-1发挥逆转慢性粒细胞白血病加速期的作用

目的:探讨黄连解毒汤(HLJDT)对慢性粒细胞白血病(CML)加速期的治疗作用,以及HLJDT及其主要活性成份之一的黄芩素对血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响。方法:通过对1例CML的患者口服HLJDT治疗6个月的观察,外周血检查和骨髓穿刺分析治疗前后外周血象和骨髓象的变化;流式细胞术分析HLJDT和黄芩素对CML细胞系K562的活细胞计数的影响;逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测患者骨髓单个核细胞HO-1基因的表达;蛋白印记检测经黄芩素处理后K562细胞HO-1蛋白的表达水平。结果:口服HLJDT对CML加速期的治疗有效,可明显降低骨髓和外周血原始粒细胞和早幼粒细胞数,使疾病重新回复到慢性期;并且在体内能降低肿瘤细胞HO-1基因的表达,在体外,HLJDT能抑制K562细胞的增殖,且其主要成份黄芩素亦有相同作用,并且下调HO-1蛋白的表达。结论:HLJDT具有治疗CML加速期的作用,其机理与抑制HO-1基因和蛋白的表达有关;因此,HLJDT具有潜在的临床应用价值。     

白血病细胞系中WT1基因启动子区域DNA甲基化的研究

目的应用基于聚合酶链反应(PCR)的实验方法,研究白血病细胞系中WT1基因启动子区域的DNA甲基化水平及其与WT1基因表达的关系.方法采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术,检测HL-60、Jurkat及KG-1等白血病细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态;以5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-aza-CdR)对启动子区域DNA高甲基化的U937细胞系进行去甲基化处理后,观察WT1基因表达水平的改变.结果 HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1水平高表达,而Jurkat和U937细胞表达水平极低,同时检测到这两个细胞系存在WT1基因启动子区域DNA高甲基化;经去甲基化处理后,U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者升高.结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一.     

慢性白血病Id4甲基化研究

目的探讨Id4基因在慢性白血病患者中的甲基化情况。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MS—PCR）,对初发9例慢淋白血病（CLL）和18例慢粒白血病（CML）患者的骨髓进行Id4基因甲基化检测,以正常骨髓作为对照。结果Id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态,在9例CLL患者中全部检测到Id4基因甲基化,而在18例CML患者中,检测到12例Id4基因甲基化。结论慢性白血病患者骨髓Id4基因发生了不同程度的甲基化改变,CLL和CML患者的甲基化发生比例不同。     

PTEN基因对慢性粒细胞白血病Survivin、Xiap、Smac调控的研究

目的 探讨肿瘤抑制基因PTEN对人慢性粒细胞白血病(CML)中生存素(Survivin)、X连锁凋亡抑制蛋白(Xiap)、线粒体促凋亡蛋白(Smac)调控的作用.方法(1)将携带有野生型PTEN和绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及对照载体腺病毒(Ad-GFP)转染人慢性粒细胞白血病细胞系K562,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测转染效率、细胞周期及凋亡率;荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN、Survivin、Xiap、Smac mRNA水平变化,Western印迹检测PTEN蛋白表达水平的变化.(2)研究10例慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)、10例慢性粒细胞白血病急变期(CML-BC)及10名健康人(NC)骨髓单个核细胞内PTEN、Survivin、Xiap、Smac mRNA表达水平变化.结果 以感染复数(MOI)=200转染K562细胞后,Ad-PTEN-GFP组K562细胞最大增殖抑制率为38.6％,转染3d后Ad-PTEN-GFP组K562细胞内Survivin、Xiap、Smac mRNA表达水平(0.0700±0.0059、0.0089±0.0006、0.0600±0.0039)均明显低于Ad-GPF组(0.4370±0.0790、0.0661±0.0072、0.1580±0.0078)和未转染组(0.4530±0.0810、0.0700±0.0079、0.1770±0.0085),转染Ad-PTEN-GFP组与转染Ad-GFP相比Survivin mRNA表达水平降低6.14倍、Xiap降低7.44倍,而Smac mRNA降低2.95倍(均P＜0.01).CML-BC患者中PTEN mRNA表达水平低于CML-CP及健康对照组,而Survivin、Xiap、Smac mRNA在CML-BC患者中均高于CML-CP及健康对照组(均P＜0.01).结论 Survivin、Xiap、Smac基因可能在PTEN介导的慢性粒细胞白血病细胞凋亡通路中参与抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用.     

METHYLATION PATTERN OF LRP15 GENE IN LEUKEMIA

Objective To investigate the methylation status of LRP15 gene in acute leukemia (AL) patients and its role in the tumorigenesis. Methods The methylation of LRP15 promoter and first exon of bone marrow mononuclear cells in 73 patients with AL, 10 with chronic leukemia (CL), 9 with hematological benign diseases, and 20 healthy transplantation donors was analyzed by using methylation specific polymerase chain reaction. The methylation of LRP15 gene promoter and first exon in COS7, K562, and HL60 cell lines was also assayed. Results No LRP15 gene promoter methylation was detected in COS7 cell line. LRP15 gene promoter was methylated in K562 and HL60 cell lines. No deletion of LRP15 gene was detected in all samples. In nearly all French-American-British leukemia subtypes, we found that frequency of LRP15 methylation in adult patients with AL was 71.23% (52/73). There was no detectable methylation in any of the 20 healthy donors and 8 chronic myeloid leukemia patients. The difference in frequency of LRP15 methylation between AL patients and healthy donors or CL patients (10.00%, 1/10) was significant (P<0.01). Hypermethylation of LRP15 gene was found in 57.14% (16/28) of newly diagnosed AL patients, 83.33% of relapsed AL patients respectively, which was significantly different (P<0.05). We also demonstrated LRP15 methylation in 55.56% (5/9) adults with benign hematological diseases. Conclusions LRP15 methylation changes are common abnormalities in leukemia. LRP15 is postulated to be a tumor suppressor gene.     

转录因子LMO2与LYL1在髓系白血病细胞的异常表达与相互作用

目的 探讨转录因子LMO2与LYL1在髓系白血病细胞的表达、相互作用及意义.方法 荧光实时定量聚合酶链反应、基因转染与免疫共沉淀实验等.结果 LMO2在51.1%的未缓解急性髓系自血病(AML)患者表达增强,LYL1在62.2%的AML患者表达增强,二者共同高表达的患者比例为31.1%,表达水平有正相关性.基因转染实验显示LMO2与LYL1的表达相互激活.应用免疫共沉淀证明髓系白血病细胞中LMO2-LYL1复合物的存在.结论 LMO2与LYL1在白血病细胞的表达异常和相互作用可能是引起髓系造血细胞增殖分化异常的重要因素.