抗人BPI23单克隆抗体的制备和鉴定

目的 采用杂交瘤技术制备抗人BPI23单克隆抗体,并对其应用进行初步分析。方法 免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按常规方法融合;用间接ELISA法和Western - blot筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法亚克隆3次获得稳定分泌抗人BPI23单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单抗并对抗体类型进行鉴定;用Western-blot分析抗体的特异性;用间接ELISA法测抗体效价;将分离纯化的正常人外周血中性粒细胞和单个核细胞制成涂片,用抗人BPI23单克隆抗体进行免疫染色。结果 获得3个（1B4、9C12和2H11）稳定分泌抗人BPI23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型分别为κ型IgM、κ型IgG1和κ型IgG1;抗体效价分别为1.28×105、1.28×105和4.1×106,纯化后抗体含量分别为0.208g/L、2.03g/L和3.88g/L;3种纯化抗体均能与本实验制备的人BPI23和市售人BPI55标准品特异性结合,而不能与小鼠BPI25和人LBP结合;在免疫组化实验中,1B4、9C12和2H11单抗均能与人中性粒细胞中的BPI特异性结合。结论 成功制备了人BPI23特异性单克隆抗体,为BPI检测试剂盒的研制奠定了基础。     

用体外免疫的人淋巴细胞研制抗HBsAg单克隆抗体

应用抗ＨＢｓＡｇ抗体阳性供者的外周血淋巴细胞和随机取样的人扁桃体和外伤脾细胞，经乙型肝炎疫苗体外免疫后和骨髓瘤细胞融合制作杂交瘤。在以１２例人外周血、扁桃体和脾来源的淋巴细胞为亲本细胞制作的杂交瘤中，共获得了抗ＨＢｓＡｇＩｇＭ抗体阳性的孔３８个，ＩｇＧ抗体阳性的孔１６个。经比较，细胞融合率和杂交瘤分泌抗体阳性率均以扁桃体来源的细胞最佳。抗体阳性的杂交瘤细胞经克隆化后，只获得了３株分泌抗ＨＢｓＡｇＩｇＭ抗体的杂交瘤克隆。对这３株杂交瘤克隆分泌抗体的特异性进行了分析，讨论了人源单克隆抗体交叉反应的可能原因。     

基因疫苗脾内免疫制备抗人c-kit单克隆抗体及其初步鉴定

目的：用基因脾内免疫方法制备抗人c-kil单克隆抗体，并通过对抗体生物学特性的初步研究，确定该方法制备抗体的可行性。方法：利用分子克隆方法构建重组质粒pcDNA3．1／c-kit胞外区，脾内免疫BALB／c小鼠一次，通过杂交瘤技术制备抗人c-kit单克隆抗体。采用流式细胞术、Western blot方法初步鉴定制备的抗体。结果：目的基因片段c-kit外区正确插入质粒pcDNA3．1，重组质粒免疫小鼠后通过杂交瘤技术获得了三株分泌抗人c-kit胞外区的杂交瘤细胞株6CA、2C5和5D5。其亚类均为IgM类，识别不同的抗原表位，其特异性与抗人c-kit抗体一致。结论：可用基因脾内一次免疫法制备抗人c-kit单克隆抗体。     

抗人淋巴细胞E受体单克隆抗体的研究

用杂交瘤技术制备了一识别E受体单克隆抗体Tlla(JN20-5),间接免疫荧光分析表明Tlla(JN 20-5)与多种T细胞反应,并识别人外周血全部T细胞。此抗体对E玫瑰花生成有明显阻断作用,其相应抗原又与E受体一样对胰酶消化敏感。外周血单个核细胞经PHA刺激不同时间后与Tlla(JN 20-5)及另一CD_2抗体的反应百分率无明显增加,但反应强度增加。标准CD_2抗体Leu 5b、Anti-CCT_3都有阻断FITC标记Tlla(JN 20-5)的作用,说明Tlla(JN 20-5)为一识别E玫瑰花受体的单克隆抗体。     

抗人淋巴细胞E受体单克隆抗体的研究

用杂交瘤技术制备了一识别E受体单克隆抗体Tlla(JN 20-5),间接免疫荧光分析表明Tlla(JN20-5)与多种T细胞反应,并识别人外周血全部T细胞。此抗体对E玫瑰花生成有明显阻断作用,其相应抗原又与E受体一样对胰酶消化敏感。经PHA刺激不同时间后Tlla(JN20-5)与另一CP_2抗体一样,同外周血单个核细胞反应百分率无明显增加,但反应强度增加。标准CO_2抗体Leu 5b、Anti-CCT3都有阻断FITC标记Tlla(JN20—5)的作用,说明Tlla(JN20—5)为一识别E玫瑰花受体的单克隆抗体。     

肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定

 目的 制备出高效价的抗人肺鳞癌单克隆抗体。方法 以云南个旧肺鳞癌细胞YTMLC -90免疫的Balb/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1、SP2/0细胞为亲代细胞,应用鼠-鼠杂交瘤技术建立杂交瘤细胞系。ELISA法筛选,有限稀释法克隆化培养,ELISA法测定抗体效价,双抗体夹心法鉴定Ig亚类,制备染色体,Giemsa染色计数染色体数目,ABC免疫组化法行不同组织细胞的交叉检测。结果 获得三株稳定分泌抗YTMLC-90细胞抗体的杂交瘤细胞株S2D1、N2D1及N3C5。培养上清效价分别为1∶512、1∶284及1∶1024,腹水效价分别为1∶105、1∶104及1∶104;Ig亚类分别为IgG1、IgG2a及IgG3;染色体众数在90～110之间;三株抗人肺鳞癌单克隆抗体与其它组织细胞无交叉反应性。杂交瘤细胞体外传代培养6个月仍保持抗体稳定分泌。结论 成功制备高效且特异的抗人肺癌单克隆抗体。     

抗人淋巴细胞E受体单克隆抗体的研究

用杂交瘤技术制备了一识别E受体单克隆抗体T11a(JN20-5),间接免疫荧光分析表明T11a(JN20-5)与多种T细胞反应,并识别人外周血全部T细胞。比抗体对E玫瑰花生成有明显阻断作用,其相应抗原又与E受体一样对胰酶消化敏感。经PHA刺激不同时间后T11a(JN20-5)与另一CP_2抗体一样,同外周血单个核细胞反应百分率无明显增加,但反应强度增加。标准CO_2抗体Leu5b、Anti-CCT_3都有阻断F1TC标记T11a(JN20-5)的作用,说明T11a(JN20—5)为一识别E玫瑰花受体的单克隆抗体。     

抗人T细胞白血病1型病毒(HTLV1)的人源单克隆抗体

本文报告了用EBV-杂交瘤技术产生人单克隆抗体。从多发性硬化症病人外周血获得B淋巴细胞,经EB病毒转化,建立了永久性的B细胞系并与小鼠骨髓瘤细胞(P_3×63Ag8.653)或Spatz-4(人与鼠细胞杂交的瘤细胞系)融合,用ELISA方法筛选阳性杂交瘤,再经亚克隆培养,筛选出抗HTLV1特异性抗体,通过SDS-PAGE,western blot及FACS分析,证明这些抗体只与HTLV1的24kDa蛋白反应,并全部分泌IgM类型免疫球蛋白。     

抗体基因工程——重组抗体

七十年代中杂交瘤单克隆抗体问世以来,在医学和生物学的研究及临床应用中,单克隆抗体己越来越显示它的重要性。但是,目前能应用的单克隆抗体(McAb)大多是鼠-鼠杂交瘤,抗体是属鼠的免疫球蛋白(Ig),在进入人体后能激发抗异种蛋白的反应。为此,人们试着获得人型免疫球蛋白(Ig)的McAb。目前除了人-人杂交瘤外,用抗体基因工程方     

产生增强LAK活性的双特异性抗体的杂交-杂交瘤

至今用化学交联,体细胞杂交及基因工程等四种主要方法可以产生识别两个不同抗原的双特异性抗体(Bispecific antibody)。实验证明,双特异性抗体的临床应用价值优于单价的单克隆抗体。我们在对自产的抗人小细胞肺癌单克隆抗体较系统的研究基础上,利用杂交-杂交瘤(Hybid-Hybridoma)方法建立了几株分泌抗人小细胞肺癌和人CD3的双特异性抗体的交杂-杂交瘤细胞系。     

人胶质瘤相关抗原内映像独特型疫苗研究

5A_8为抗人胶质瘤相关抗原的单克隆抗体(Ab_1)。用分泌5A_8的杂交瘤细胞免疫BALB/c小鼠,制备抗5A_8独特型的单克隆抗体1 D_1(Ab_2)。研究证明,1D_1可特异地与5A_8结合,抑制5A_8与胶质瘤传代细胞(靶细胞)的反应性,但它对另一株抗胶质瘤单克隆抗体5F_4及多克隆抗血清与靶细胞的反应性均无阻断作用。用1D_1免疫BALB/c小鼠,可诱导出与胶质瘤细胞(靶细胞)产生特异性反应的抗体(Ab_3即Ab′_1)。Ab_3可与5A_8亲和层柱提取的靶抗原相结合,并能阻断靶抗原与~(125)I—5 A_8的反应,因而得出结论,1D_1具有胶质瘤相关抗原的内映像(Ab_2 β)。     

一种用于检测抗活细胞表面抗原单抗的ELISA

在快速筛选单克隆抗体的方法中,放射免疫测定法(RIA)的缺点是试剂半衰期短、造价昂贵和接触有害的放射性物质。作者曾用免疫荧光法(IF)筛选杂交瘤上清,深感工作量甚大。因此不得不对酶联免疫吸附试验进行探讨。本文介绍用培养的活肿瘤细胞系做ELISA,达到筛选杂交瘤上清和鉴定单克隆抗体反应性的双重目的。本研究所用的抗人肿瘤的单克隆抗体是: Ⅰ A4、ⅡF6、ⅢE3、ⅢE5、ⅥEI、     

纯化和标记抗人轻链β2m单克隆抗体的方法

背景:通过杂交瘤细胞株接种小鼠腹腔可获得含大量抗体的腹水,但以往纯化腹水中单克隆抗的方法较复杂,不易操作。 目的：制备、纯化和标记抗人类白细胞抗原Ⅰ类分子轻链的单克隆抗体,以检测肿瘤细胞表面的人类白细胞抗原Ⅰ类分子的表达。 方法：将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔,获得含抗人轻链β2m抗体的腹水,用改良的辛酸-硫酸铵方法纯化腹水,将纯化后的单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素(FITC),标记后的抗体用于检测外周血单个核细胞、表达空载人类白细胞抗原A2分子的T2细胞和白血病K562细胞表面的人类白细胞抗原Ⅰ类分子,并用流式细胞仪和荧光显微镜观察人类白细胞抗原Ⅰ类分子的表达。 结果与结论：纯化后的抗人轻链β2m-FITC单克隆抗体纯度为96%。流式细胞检测结果表明,人类白细胞抗原Ⅰ类分子在外周血单个核细胞表面高表达,在表达空载人类白细胞抗原A2分子的T2细胞表面低表达,而在白血病K562细胞表面不表达。结果证实,用改良的辛酸-硫酸铵方法纯化腹水以此制备的抗人轻链β2m-FITC能有效区别不同细胞表达人类白细胞抗原Ⅰ类分子的强弱,其纯化方法简便易行。     

一株中和人IL-17免疫活性的单克隆抗体的制备

目的制备抗人IL-17单克隆抗体,并鉴定其中和活性。方法用hIL-17作为免疫和检测抗原,用间接ELISA法筛选分泌抗人IL-17抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行中和活性鉴定。结果获得1株稳定分泌抗人IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG2b,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶8.192×105;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western Blot检测证明该单抗与人IL-17蛋白特异地结合;单抗亲和常数为8.192×10-9 mol/L;ELISA及Real-time-PCR检测证明该单抗能够有效地阻断人IL-17刺激Hela细胞产生IL-6的作用。结论所制备的抗人IL-17单克隆抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性,为针对IL-17为靶点的抗体药物的开发奠定了基础。     

红细胞分化相关蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

应用杂交瘤技术和电泳迁移超滞留技术筛选和制备红细胞分化相关蛋白单克隆抗体，以阐明此类蛋白的生物学功能。用杂交瘤技术制备了５８０株针对终末分化期红细胞，包括人胚肝中，晚幼红细胞和氯高铁血红素诱导分化的人红白血病细胞核蛋白的单克隆抗体。     

抗种系基因DNA的自身抗体

在研究自身反应性免疫球蛋白的基因组成中,用人—人杂交瘤获得了抗DNA的单克隆自身抗体。SLE病人或麻疯风病人外周血淋巴细胞与淋巴母细胞融合,所得的单克隆自身抗体均为IgM。其中大部分与变性的DNA呈强反应并与其它几种多核甙酸有交叉反应性,极少数天然DNA呈强反应。一些与磷脂、细胞结构蛋白、细菌表面物质呈交叉反应。大约有     

抗人前B淋巴细胞鼠-鼠杂交瘤的建立

用急淋患者的白血病细胞为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备了一株抗人前B淋巴细胞杂交瘤All_(26)。该杂交瘤分泌的单克隆抗体活性高,特异性地针对前B淋巴细胞,     

鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:探索以白细胞为免疫原的鼠抗人白细胞天然蛋白单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)制备与克隆筛选鉴定方法,制备鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法:用健康人外周血白细胞免疫小鼠,利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备mAbs,通过免疫细胞化学法对杂交瘤细胞进行非特异性阳性筛选,有限稀释法进行亚克隆,应用免疫沉淀鄄质谱法进行mAb 特异性鉴定,通过Western blot 进行细胞株筛选,小鼠体内诱生腹水法制备单抗,亲和层析法纯化,ELISA 间接法测定效价及亲和力,Western blot 进行特异性鉴定及交叉反应性分析,免疫组化染色人乳腺癌石蜡切片。结果:获得免疫细胞化学检测阳性多克隆细胞35 孔,分泌鼠抗人S100A9 蛋白单克隆抗体细胞株11 株,优选1 株制备腹水并纯化鉴定抗体,抗体效价为1 3.18 105 ,亚类为IgG1,轻链为kappa 链,抗体纯度达95%以上,亲和力常数3.54 108 L/ mol,与S100A8的交叉反应率为0.12%,与S100A12 和S100A13 几乎无交叉反应,组化染色识别人乳腺癌组织中的S100A9 蛋白。结论:成功制备鼠抗人S100A9 天然蛋白单克隆抗体,该单抗具有高效价、较高亲和力和高特异性,能为其应用于免疫组化检测S100A9蛋白的表达提供依据。     

抗肌红蛋白单克隆抗体的制备与鉴定及其初步应用

目的 制备和鉴定抗肌红蛋白(Mb)单克隆抗体,为人肌红蛋白检测试剂的研制奠定基础.方法 用人肌红蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,用ELISA方法筛选,有限稀释法进行克隆化培养阳性杂交瘤细胞株.ELISA法测定小鼠腹水滴度,CLIA法对抗体进行配对实验与特异性鉴定.结果 筛选培养出9株分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水滴度为1∶5×104 ～ 1∶2×105.通过配对实验,有5株抗体6种组合可以成功配对.这5株抗体的亲和常数为6.46×108 ～ 3.68×109 L/mol.用5株抗体所建立的6种化学免疫分析方法与人Hb交叉反应率为7.434×103％ ～2.904×10-2％,与人ALB交叉反应率为4.980×10-7％ ～3.830×10-5％.用Mb17B6与Mb21E8两株抗体建立的CLIA标准曲线的线性系数为0.997,灵敏度为6.02ng/mL.结论 成功制备了可以应用于免疫分析的抗肌红蛋白单克隆抗体.     

应用完全酶解法构建杂交瘤2F_7DNA基因文库

人-鼠嵌合抗体。在人体内应用时,将消除或大大减低由鼠的Ig在人体中引起的异种蛋白反应,这对单克隆抗体的临床应用,将开辟更为广扩的前景。本实验室研制的鼠型杂交瘤单克隆抗体2F_7,在体外已显示对人体小细胞肺癌有良好的反应性,与正常组织极少有交叉反应。抗体与小细胞肺癌抗原,有较好的结合常数、在带人体小细胞肺癌的裸鼠体内,也显