异体骨髓间充质干细胞移植提高皮肤扩张效率

目的探讨异体骨髓间充质干细胞（bone marrow—derived mesenchymal stem cells,BM—MSCs）在皮肤扩张中发挥的作用,为临床更好地使用皮肤扩张术提供新的方法。方法体外分离、培养乳猪BM—MSCs。小型猪随机分为A、B、c、D4组,前3组脊柱两侧各埋置3个扩张器,A组扩张局部注射BM—MSCs、B组耳静脉注射BM—MSCs、C组仅埋置扩张器、D组为对照组。定期注水,测量各组扩张第7、14、28天标记面积,免疫荧光检测BM—MSCs的分化作用。结果流式鉴定BM—MSCs示CD90、CD29阳性表达,CD34、CD45阴性表达。扩张第28天,A组面积较c组增加明显（P〈0．01）,B组与C组之间比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。免疫荧光示CD31、PCNA阳性表达率A、B组大于C、D组。结论异体移植的BM—MSCs能有效促进扩张皮肤新生,以局部移植的效果明显。     

骨髓间充质干细胞的免疫学特性及其同种异体的应用研究进展

骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem ells,BMScs）具有多向分化潜能,低免疫原性,同种异体移植后能够调节机体免疫,因此逐渐成为再生医学和免疫学研究的热点。同种异体BMSCs（Allogeneic,allo—BMSCs）在再生医学、组织工程和免疫调节等方向的应川研究显示出了广阔的发展前景,但在进入临床应用前还有很多问题需要解决。本文就骨髓间充质干细胞的免疫学特性及其同种异体的应用研究进展进行综述。     

同种异体间充质干细胞复合纤维蛋白修复骨缺损

[目的]探讨骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cells,MSCs)的体外培养,以及同种异体MSCs复合纤维蛋白修复兔股骨髁松质骨缺损的效果。[方法]在日本大耳兔双侧股骨髁制作0.6 cm×1.0 cm松质骨缺损,左侧植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物,右侧单纯植入纤维蛋白。分别于术后2、5、8周行放射学、组织学检查,以了解骨缺损修复情况。[结果]单纯植入纤维蛋白的一侧不能自行愈合。植入复合物的一侧术后2周可见少量骨组织生成,5周可见大量模糊骨痂,术后8周骨缺损基本愈合。除少量炎性细胞浸润外,各期均未见明显免疫排斥反应。[结论]同种异体MSCs复合纤维蛋白可有效修复兔股骨髁松质骨缺损,8周内机体的免疫排斥反应较弱。     

不同来源血清体外培养骨髓间充质干细胞的研究

目的 适当的血清浓度可维持骨髓问充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养,而不同来源的血清对BMSCs的培养效果是否小同.本研究探讨自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清在体外培养人BMSCs的可行性.方法 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化人BMSCs,在培养过程中分别加入白体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清,观察比较细胞形态、表面抗原、生长曲线及各组在诱导剂作用下表面抗原和诱导分化的相关性.结果 从BMSCs的形态学、生长曲线、表面抗原、诱导分化上看各组无明显差异,生长状况良好.结论 自体血清、脐带血清、AB血清、胎牛血清均可维持BMSCs的体外培养,而自体血清解决异种和异体血清带来的一些潜在的风险,更为安全.     

小鼠骨髓间充质干细胞移植异体睾丸的研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)移植异体睾丸。方法:①分离5~6周龄的BALB/c小鼠胫骨、股骨,冲出骨髓,用Percoll密度梯度离心法和贴壁法分离、培养、纯化MSCs。②取第3代MSCs,用Hoe-chest33342标记并观察,制备细胞悬液。③用睾丸网注射法将标记的MSCs移植入异体小鼠睾丸内,于各时相点取睾丸组织,在3个位点连续制作快速冰冻切片,镜下观察。结果:①传至3代即可得到数量较多的纯化的MSCs。②在荧光显微镜下,标记的MSCs细胞核呈亮黄色。③用睾丸网注射法行小鼠MSCs移植异体睾丸成功,未见免疫排斥反应发生。移植后1、3d,只在中间的切片上见到MSCs,细胞核呈亮黄色,两侧的切片未查到MSCs,移植后1d细胞较集中,移植后3d细胞散在分布;移植后6、9、12d,3个位点的切片均见MSCs,部分MSCs排列呈管状;移植后15、18d,MSCs的核荧光有所减弱;移植后21d,荧光消失。结论:用睾丸网注射法将小鼠MSCs移植异体睾丸获得成功,未见免疫排斥反应发生,移植后的MSCs存活。     

未分化骨髓间充质干细胞的免疫学特性研究

目的 研究骨髓间充质干细胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类抗原与共刺激分子CD80（B7—1）和CD86（B7—2）的表达及探讨MSC的抗原性。方法 采用流式细胞技术检测MSC表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类抗原与共刺激分子CDS0（B7—1）和CD86（B7—2）的表达，测定淋巴细胞MSC混合反应的强度。结果 MSC表达高水平的MHCⅠ类抗原，不表达MHCⅡ类抗原，低表达CD86（B7—2），不表达CD80（B7—1），IFN-γ刺激48h后，MHCⅠ类抗原表达增加，MHCⅡ类抗原表达，CD80（B7—1）、CD86（B7—2）也均有表达。未分化的MSC经γ-干扰素（IFN-γ）刺激之后，不会引起很强的免疫排斥反应，表现为弱免疫原性。结论 未分化的MSC抗原性较弱，具有同种异体移植的可能。     

第三方骨髓间充质干细胞对同种异体皮肤移植的影响

目的 探讨第三方骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)对同种异体皮肤移植的影响.方法 40只雌性C57BL/6和50只雄性BALB/C小鼠分别作为皮肤移植的供体和受体.将50只BALB/C小鼠随机分为5组,每组10只:空白对照组,直接进行皮肤移植;给予受体环磷酰胺组(Cyelophosphamide,CP组);给予受体SD大鼠BMSCs移植组(SD-BMSCs组);给予受体CP+SD-BMSCs移植组(CP+SD-BMSCs组);CM-DiI荧光标记组.CP+SD-BMSCs组给予大剂量CP腹腔注射,200 mg/kg,2 d,移植当天自受体小鼠尾静脉注射1×10~6个SD-BMSCs.检测项目包括:观察皮片存活时间、单向混合淋巴反应、组织HE染色、组织荧光镜检,流式细胞仪检测受体外周血单核细胞中SD-BMSCs的含量等.结果 CP+SD-BMSCs组皮肤移植物存活时间(14.5±1.9)d,空白对照组为(8.O±0.8)d,CP组为(11.1±1.4)d,SD-BMSCs组为(10.9±1.4)d,CP+SD-BMSCs组皮肤移植物存活时间明显比后3组延长(P<0.05).混合淋巴反应结果显示,BMSCs对淋巴细胞的增殖抑制作用存在量效关系.HE染色发现CP+SD-BMSCs组不但有血管生成,淋巴细胞浸润也较少.CM-DiI标记的SD-BMSCs能够在BALB/c小鼠体内存活30 d以上,SD-BMSCs组与CP+SD-BMSCs组外周血流式细胞仪均检测到SD-BMSCs.结论 BMSCs能够在异种受体体内存活较长时间;第三方BMSCs能够延长同种异体移植物的存活时间;BMSCs能够抑制异种T淋巴细胞的活化增殖.     

微囊化同种异体骨髓间充质干细胞移植预防兔椎间盘退变的实验研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)磁粒子标记的微囊化同种异体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bMMSCs)移植预防椎间盘退变的可行性.方法:选用60只健康新西兰大白兔.随机平均分为A、B、C、D、E 5组,每组12只.A、B、C、D组应用髓核抽吸法制作L2/3、L3/4、L4/5椎间盘退变模型,取同种异体兔bMMSCs行体外培养,并在体外纯化扩增,用SHO标记后行微囊化,于造模手术当时植入(A组)兔手术节段椎间盘内;B组植入未微囊化bMMSCs;C组移植空微囊;D组仅制作模型,不移植;E组为正常对照组.分别于建模后2、4、6、8周时用MRI扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪,并于相应时间点处死动物后取L2/3、L3/4、L4/5髓核组织,用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化,免疫组化法测定Ⅱ型胶原含量的变化.所得数据进行统计学分析.结果:bMMSCs能被SPIO有效标记,应用MRI扫描可观察到其在体内的分布,8周时MRI图像与4周时相比,干细胞由注射部位向周边发生了迁徙.建模后2、4、6、8周各时间点.A组髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量均高于B组、C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05);B组均高于C组及D组,差异有统计学意义(P<0.05);各时间点E组与B组、C组及D组相比差异有统计学意义(P<0.05);术后6、8周时A组与E组之间差异无统计学意义(P>0.05);各时间点C组和D组之间差异无统计学意义(P>0.05).结论:微囊化bMMSCs移植后能恢复兔髓核中细胞外基质含量,其效果优于单纯bMMSCs移植.     

骨髓间充质干细胞与胶原三维培养系统的建立

目的建立骨髓间充质干细胞(MSCs)与胶原的三维培养系统。方法 采用贴壁法对(5.8±3.4)×105个原代大鼠骨髓MSCs进行分离培养,通过传代次数的增加对其进行纯化扩增,然后以鼠尾胶原为成份构建胶原膜,用扫描电镜和噻唑蓝(MTT)比色法观察MSCs在胶原膜上的增殖状况。结果MSCs在体外扩增16代后共可获得(4.0±3.3)×1012个细胞,扩增(6.8±1.0)×106倍。扫描电镜结果显示,大鼠MSCs与鼠尾I型胶原有良好的亲和性;MTT结果显示,接种胶原膜后MSCs增殖特性与接种前相比,差异无显著性(P>0.05)。增殖曲线显示MSCs最适接种密度为2×104/cm2。结论大鼠MSCs接种后在胶原膜上增殖状况良好,此三维培养系统适于植入皮肤受损动物模型。     

成骨诱导后的骨髓间充质干细胞对外周血单个核细胞增殖的免疫调节作用

目的:探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)及成骨诱导后的骨髓间充质干细胞(OM-BMSCs)对同种异体的外周血单个核细胞(PBMCs)的免疫调节作用。方法:分离比格犬BMSCs,成骨诱导培养基(ost eogenic medium,OM)进行成骨诱导,建立BMSCs、OM-BMSCs与同种异体PBMCs的共培养体系,分三种实验条件,共9组。A组:5×104受体PBMCs加入5×104供体PBMCs共培养;B组:A组组分加入已铺被1×104/孔BMSCs的96孔板;C组:A组组分加入已铺被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板;D组:5×104受体PBMCs加入植物血凝素A(PHA)刺激物;E组、F组:将D组组分按B、C组方式处理;G组:5×104受体PBMCs加入IL-2炎症因子;H组、I组:G组组分按B、C组方式处理。A、D、G组分别为三个实验条件的对照组,单独接种1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作为空白对照组Bl ank1组、Bl ank2组。以上各组分别培养120h后,应用Cell Titer 96 Aqueous检测各组PBMCs的增殖情况。结果:在各实验条件下与相应对照组相比较,BMSCs与OM-BMSCs均能抑制双向混合淋巴细胞反应(MLR)中PBMCs的增殖,均能抑制经PHA刺激后PBMCs的增殖,均能抑制经IL-2刺激后PBMCs的增殖(P<0.01)。结论:BMSCs及成骨分化的BMSCs对刺激细胞、PHA、IL-2刺激的同种异体PBMSs的增殖均表现为抑制效应,成骨分化后的骨髓间充质干细胞对同种异体免疫反应仍具有免疫调节作用。     

骨髓间充质干细胞及其诱导成骨的研究进展

间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞,主要存在于骨髓,还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织[1],如皮肤成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌的卫星细胞和血管内皮细胞等。骨髓MSCs(BMSCs)是骨髓基质的组成成分,体外分离培养后,在一定的诱导条件下,BMSCs具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多向分化的能力[2-3],这些细胞经过20～30个培养周期,仍能保持多向分化潜能。无论是自体的还是同种异源的BMSCs,一般都不会引起宿主的免疫反应。BMSCs以其来源充足、取材简便、对供体损伤小、易于分离培养、体外增殖能…     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学特性研究

目的 探讨体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,并研究其生物学特性.方法 取大鼠股骨和胫骨,以Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,MTT法测定细胞的生长曲线,流式细胞仪细胞表面抗原.结果 原代分离的BMSCs,培养48 h开始贴壁,胞体由圆形变为椭圆形、多角形或短梭型;培养第12天,见胞体渐变为长梭型,并达90%单层融合;经传代扩增,细胞进一步纯化.7代以前,细胞在2 d内处于潜伏期,第3天进入对数生长期,第7天进入平台期;10代后增殖速度变慢;流式细胞仪鉴定BMSCs表而抗原,CD44、CD90、CD34阳性率分别为99.62%、95.13%、2.06%.结论 Ficoll密度梯度离心法结合贴壁法有效分离纯化大鼠BMSCs,且细胞生长稳定,增值能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性.     

成人间充质干细胞体外成骨的初步研究

目的 建立一种分离和培养成人骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的方法,观察成人MSCs体外成骨潜能。方法 用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,并在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养。通过传代培养扩增MSCs。为促进成人MSCs体外成骨性分化,第5传代培养时加入成骨性添加剂,培养第4、12天分别用流式细胞仪分析成人MSCs表面分子的表达,并用碱性磷酸酶组化染色和Von Kossa染色。结果 成人MSCs是骨髓黏附细胞中有相应细胞表面蛋白表达和形态均的一细胞群。成骨性添加剂可作用于传代培养的成人MSCs,表现为培养皿表面有相互连接的结节状聚合体、碱酶染色阳性细胞数量增多、Von Kossa染色可见钙化的基质沉积。结论 所建立的成人MSCs的分离和培养条件可分选出骨髓黏附细胞中一组独特的细胞群,成人MSCs具有体外成骨潜能。     

人嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞体外共培养的实验研究

[目的]通过体外共培养观察人嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响.[方法]取5个月以上引产胎儿嗅球及骨髓,分离培养及鉴定OECs及MSCs,携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺相关病毒转染标记OECs,双苯亚甲胺荧光染料标记MSCs,将两种细胞按1∶1比例进行共培养,MSCs单独培养组为阴性对照组,免疫细胞化学方法检测MSCs表达巢蛋白(nestin)、神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)情况.[结果]MOI值为1×106时OECs表达GFP阳性率为84.89％,对细胞生长活性无明显影响.共培养时两种细胞生长良好,共培养7d未见形态学改变,经复方丹参注射液诱导后部分MSCs呈现神经元样改变,表达nestin、NSE、NeuN、NF-M、GFAP特异性标志,且共培养组的分化率明显高于单独MSCs培养组,有显著性差异.[结论]OECs可通过分泌可溶性物质及细胞之间的相互作用启动MSCs分化程序,提高MSCs向神经细胞分化率.     

人骨髓基质干细胞与表面置换珊瑚羟基磷灰石培养的定向诱导分化

目的观察人骨髓基质干细胞（hMSC）与表面置换的珊瑚羟基磷灰石（SCHA）体外培养的细胞粘附、增殖和分化,寻找理想的骨修复材料。方法海南天然滨珊瑚在特定温度和压力下部分水热反应,制成表面置换的珊瑚羟基磷灰石,将SCHA薄片与人骨髓基质干细胞体外培养,经诱导后于4、8、12、16d分别用荧光显微镜和扫描电镜（SEM）观察细胞活性、粘附和分化过程。结果SCHA保留原有的珊瑚贯穿多孔的三维结构。荧光显微镜可见hMSC在SCHA的表面和孔道内生长良好,第16d达最高水平;电镜显示细胞粘附良好,分化为成骨细胞,分泌大量胶原纤维,可见合成的钙结节。结论hMSC在表面置换的珊瑚羟基磷灰石内粘附、增殖、分化良好,两者具有较好的生物相容性,SCHA是一种良好的骨组织工程支架材料。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

荧光活性染料DiI标记观察人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨粘附的实验研究

目的通过荧光活性染料DiI标记观察骨髓基质干细胞在部分脱钙骨上的粘附。方法用DiI标记人骨髓基质干细胞,接种于部分脱钙骨上,测定细胞的粘附率。于接种后第2、4、7天激光共聚焦显微镜观察细胞在支架材料上的生长状况。结果DiI标记的骨髓基质干细胞的粘附率为(99.9±0.2)%,未标记的骨髓基质干细胞粘附率为(99.1±1)%,两者无统计学差异(P>0.05);第7天时细胞脱钙骨内孔覆盖。结论荧光活性染料DiI标记不影响骨髓基质干细胞在部分脱钙骨支架上的粘附,是观察骨髓基质干细胞在脱钙骨支架上粘附状况的较好方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞作为滋养层培养小鼠胚胎干细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞(embryonic stemcells ESCs)的可能。方法:收集BALB/C小鼠3·5d胎龄的囊胚,接种于大鼠骨髓间充质干细胞的滋养层上,培养5~6d后挑取胚胎干细胞集落,胰酶消化传代。观察细胞集落生长情况,通过碱性磷酸酶染色、细胞核型分析对细胞生物学特性进行检测。结果:ES细胞呈集落性生长,碱性磷酸酶组织化学染色阳性,具有正常核型及多向分化潜能。结论:大鼠MSCs可以作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞,并能保持未分化状态。     

WNT2B对人骨髓间充质干细胞成脂肪细胞分化的影响

目的观察WNT2B对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向脂肪细胞分化的影响。方法采用慢病毒载体在hMSCs中过表达WNT2B基因(实验组),以空慢病毒载体作为对照(对照组),并将hMSCs进行脂肪细胞诱导分化7 d,以实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测脂肪细胞标志基因过氧化物酶增殖物激活受体γ2(PPARγ2)、脂蛋白脂酶(LPL)和降脂素(Adipsin)的表达,在光镜下计数油红O染色阳性细胞的数目,并对油红O染色强度进行定量检测。计量数据组间比较采用t检验或者Mann-Whitney检验。结果在hMSCs成脂肪细胞诱导分化过程中,WNT2B的蛋白表达水平在分化早期即发生改变,实验组hMSCs的PPARγ2(3.85±0.01比0.70±0.10,t=54.289,P<0.01)、LPL(17.78±1.78比1.29±1.30,t=12.958,P<0.01)、Adipsin基因表达强度(0.88±0.11比0.38±0.05,t=7.167,P<0.01)显著低于对照组,实验组hMSCs单位面积形成脂肪细胞的数量显著低于对照组[(30.50±2.07)个比(10.33±1.63)个,t=50.230,P<0.01],油红染色定量分析显示实验组吸光度值显著低于对照组(0.77±0.02比0.49±0.02,t=10.397,P<0.01),差异均有统计学意义。结论过表达WNT2B可以抑制体外hMSCs向脂肪细胞的分化。     

体外人骨髓间充质干细胞向汗腺细胞表型转化的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(MSCs)向汗腺细胞分化的可行性.方法:体外分别分离培养、扩增并鉴定MSCs和汗腺细胞,将汗腺细胞置于47℃环境中1 h建立汗腺细胞体外休克模型,继续孵育3～5 d,收集上清液作为条件培养基对MSCs分化诱导,应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测对比共培养10 d后MSCs细胞表型的改变.结果...