白木香法呢基焦磷合酶基因AsFPS1的克隆及表达分析

法呢基焦磷酸合酶(FPS) 是倍半萜代谢途径中的关键限速酶之一.本研究在454高通量测序已获得的cDNA序列基础上,PCR扩增其开放阅读框并测序验证;提取三年生白木香根、茎、叶的总RNA及健康和伤害处理的愈伤组织的总RNA,以反转录成的单链cDNA为模板进行荧光定量PCR,检测AsFPS1基因的组织表达特异性及对伤害处理的反应.结果表明,扩增到的AsFPS1基因全长1 342 bp,开放阅读框1 029 bp,编码342个氨基酸.组织表达分析的结果显示,AsFPS1基因主要在根和茎中表达,叶中的表达量较低;该基因同时受物理伤害和结香液处理的诱导,分别在6,12 h达到最高表达水平.通过AsFPS1基因全长cDNA的克隆和表达分析,为后续研究其生物功能及沉香倍半萜合成机制奠定了基础.     

地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1的克隆和表达分析

为了克隆地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,分析地黄RgIAA1的时空表达特性及对逆境胁迫的响应。以拟南芥AtIAA14的cDNA序列为探针在地黄转录组数据库中进行比对,应用生物信息学方法分析RgIAA1的序列特征及进化关系,以实时荧光定量PCR技术检测RgIAA1在地黄不同组织以及逆境胁迫下的表达量。结果表明,获得1条903 bp的cDNA序列,包含一个681 bp完整的开放阅读框（ORF）,编码226个氨基酸,具有Aux/IAA家族蛋白的典型结构域和特征序列。RgIAA1在地黄不同组织中的表达呈差异表达,其中在地黄幼嫩叶片里表达强度最大,其次为茎,且随着叶片的伸展,RgIAA1表达强度不断降低。在连作时RgIAA1的表达量升高,NaCl和渍水胁迫下RgIAA1的表达量降低。实验首次克隆了地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。     

铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析

目的: 揭示铁皮石斛热激蛋白HSP70基因冷胁迫表达,为耐低温品系选育提供分子生物学基础。 方法: 根据已获得的HSP70基因片段序列,采用RACE方法从铁皮石斛中克隆到HSP70基因全长cDNA序列。预测其编码蛋白的结构与功能,并运用实时定量PCR进行冷胁迫下表达分析。 结果: 核苷酸序列分析表明该基因全长2 296 bp,包含一完整的1 944 bp的开放阅读框,编码647个氨基酸。氨基酸序列具有典型的HSP70特征并且与其他植物的HSP70有很高的同源性。冷胁迫表达分析说明该基因确实能被低温诱导表达。 结论: 首次克隆获得受低温诱导表达的铁皮石斛HSP70基因,为进一步研究铁皮石斛健康栽培与抗寒品系的选育奠定基础。     

白木香AsMAPK3基因的克隆及表达分析

目的:克隆白木香中分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)基因,检测其组织表达及诱导表达特性。方法:在454高通量测序获得部分c DNA序列基础上,利用RACE方法获得全长cDNA。采用NCBI在线Blastp、DNAman和MEGA4软件,对序列进行生物信息学分析。随后,通过荧光定量PCR检测目的基因的组织表达及诱导表达特性。结果:扩增到了白木香中分裂原活化蛋白激酶基因AsMAPK3,并对其进行了生物信息学分析和表达特性分析。结论:通过As MAPK3的克隆及分析,为后续验证其生物学功能奠定了基础。     

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT3,BcUGT6的表达分析及其原核表达

该研究测定了北柴胡中2个糖基转移酶基因BcUGT3和BcUGT6在不同组织中的转录水平及MeJA处理后不定根中的转录水平。BcUGT3在根、叶、花和果中的转录水平无明显差异,但均高于茎中的转录水平。BcUGT6在叶中转录水平最高,在花中最低。以未处理的为对照,BcUGT6在MeJA处理后2 h,8 h,24 h,2 d,4 d的北柴胡不定根中,转录水平均提高近2倍,表明BcUGT6的转录受MeJA影响较小。BcUGT3转录水平随处理时间的延长不断增加,4 d时,达7倍左右。利用载体pET-28a（+）,进行了2个基因的原核表达。IPTG诱导后,宿主菌表达出了目的蛋白,并获得了纯化蛋白。为后续开展这2个基因的功能研究奠定了基础。     

白木香AsJAZ1基因原核载体的构建与表达

克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis jasmonate-zim-domain protein(As JAZ1)基因的编码区,构建原核表达载体及诱导重组蛋白的表达,为筛选互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础。该实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆到茉莉酸信号转导抑制蛋白基因JAZ(As JAZ1)的编码区全长序列,克隆到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达载体p ET-28a-As JAZ1,经酶切鉴定和测序验证后将其转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经0.5 mmol·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h后,可获得相对分子质量约为39 k Da的融合重组蛋白的高效表达。该重组蛋白在大肠杆菌的上清和沉淀中均有表达,但以包涵体表达为主。     

白木香转录因子AsMYB1和AsMYB2克隆及表达分析

MYB类转录因子是数量最多、功能最多样化的转录因子家族之一。该研究根据白木香转录组高通量测序结果设计引物扩增白木香中MYB基因,利用RT-PCR技术从白木香中首次克隆得到2个MYB基因c DNA全长,分别命名为AsMYB1,AsMYB2,并对MYB蛋白质进行跨膜结构分析和聚类分析,预测其生物学信息;利用实时荧光定量PCR技术检测AsMYB基因在不同组织,及在NaCl、低温(4℃)、重金属(CdCl_2)、干旱(甘露醇)4种非生物胁迫和脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯4种外源激素处理下的表达差异。该研究中克隆获得的AsMYB1基因全长1 063 bp,编码353个氨基酸;AsMYB2基因全长1 081bp,编码359个氨基酸。2个基因具有组织表达特异性;AsMYB1,AsMYB2基因的转录水平受到不同生物胁迫和外源激素的影响,说明MYB基因对白木香防御反应和激素信号传导具有重要的作用。     

白木香AsMYC2基因全长cDNA克隆及伤害诱导表达分析

目的 克隆国产沉香基原植物白木香[Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg]茉莉酸(JA)信号途径核心转录因子基因(MYC2),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础.方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆MYC2基因cDNA全长,并进行生物信息学分析;采用实...     

白木香JAZ1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的伤害诱导表达分析

目的克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis茉莉酸(JA)信号途径核心抑制蛋白基因(jasmonate-zim-domain protein,JAZ),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆JAZ基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qR T-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)和机械伤害处理的白木香愈伤组织中JAZ基因的表达模式。结果获得白木香JAZ基因全长cDNA,命名为AsJAZ1,GenBank登录号为KP677281。序列分析表明,该基因的序列全长为1507 bp,包含一个990 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸,蛋白质相对分子质量为34280,等电点为6.89。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理0.5 h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的27倍,随后显著下降;经机械处理2h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经机械处理的白木香愈伤组织)的17倍,随后又快速降低,到24h基本恢复正常。结论获得AsJAZ1基因全长cDNA序列,该基因对伤害诱导极敏感,且能在伤害早期响应。     

白木香2个小分子热激蛋白基因的克隆及表达分析

目的从白木香Aquilaria sinensis中克隆sHSP1和sHSP2基因,并对它们的生物信息学及表达模式进行分析。方法根据本课题组白木香转录组数据库进行分析获得2条具有小分子热激蛋白(sHSPs)保守结构域的sHSPs基因序列,利用RT-PCR技术克隆sHSP1和sHSP2基因的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测sHSP1和sHSP2基因在不同组织和高盐及外源ABA、SA、MJ处理下不同时间的表达差异。结果克隆得到的白木香sHSP1和sHSP2基因开放阅读框都为474 bp,编码157个氨基酸。组织表达分析的结果显示,sHSP1和sHSP2基因主要在根中表达,在茎和叶中的表达量较少;白木香愈伤组织在高盐处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在36 h和24 h达到最高表达水平,而愈伤组织在外源ABA、MJ处理下,sHSP1和sHSP2基因都在12 h达到最高表达水平,在SA处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在12、24 h达到最高表达水平。结论获得了sHSP1和sHSP2 2基因全长c DNA序列,且2个基因在不同组织根、茎、叶中的表达存在差异性,在受到高盐和外源ABA、SA、MJ处理时,在不同时间的愈伤组织中的表达及积累情况也不同,该研究为后续深入研究白木香防御反应奠定了基础。     

白木香肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)基因的克隆及表达分析

对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis肉桂酸-4-羟基化酶基因 C4H 编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析。根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有肉桂酸羟化酶酶保守结构域的 C4H 基因序列,采用RT-PCR技术克隆得到白木香 C4H 基因编码区序列,并对C4H蛋白进行生物信息学分析。另外,采用qRT-PCR方法对 C4H 基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。序列分析表明,所克隆的 C4H 基因编码区开放阅读框（opening reading frame,ORF）长为1 515 bp,编码514个氨基酸,GenBank登录号为KF134783。qRT-PCR实验证明 C4H 基因受不同伤害处理的诱导,分别在8,20 h达到最高表达水平。白木香 C4H 基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究C4H蛋白在白木香中黄酮及芳香族类化合物合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

国产沉香中的倍半萜类和单萜类化学成分

目的:研究国产沉香的化学成分.方法:通过多种色谱手段,对国产沉香的石油醚及乙醇提取物进行化学成分分离,采用现代波谱技术对化合物的结构进行鉴定.结果:从国产沉香中分离得到9个化合物,分别鉴定为3,3,7-trimethyltri-cycloundecan-8-one(1),longifolene(2),norlongilactone(3),caryophyllenol-Ⅱ(4),humulene diepoxide A(5),kobusone(6),(一)-bornyl ferulate (7),(24R)-24-ethylecholesta-4,22-dien-3-one (8),(24R)-24-3-ono-4-en-sitosterone (9).结论:化合物2～9均为首次从国产沉香中分离得到的化合物.化合物1～6为倍半萜类化合物,化合物7为单萜衍生物,化合物8,9为甾类衍生物.     

白木香查尔酮合酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因AsCHS1编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析。方法:根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列,采用RT-PCR技术,以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列,并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。另外,采用qRT-PCR方法,以组蛋白(histones)为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。结果:序列分析表明,所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 194 bp,编码397个氨基酸残基,命名为AsCHS1。qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12 h最大,说明该基因能够在早期响应伤害胁迫。结论:白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

白木香叶脂溶性化学成分研究

目的:研究白木香叶脂溶性化学成分.方法:应用溶剂法和色谱法分离纯化化合物,利用谱学技术鉴定化合物结构.结果:分离得到11个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇(1)、二十六烷酸(2)、隐丹参酮(cryptotanshinone,3)、2α-羟基熊果烷(2α-hydroxyursane,4)、二氢丹参酮I(dihydrotanshinone I,5)、丹参酮I(tanshinone I,6)、丹参酮ⅡA(tanshinoneⅡA,7)、2α-羟基熊果酸(2α-hydroxyursolic acid,8)、对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid,9)、对羟基苯酚(hydroquinone,10)和胡萝卜苷(11).结论:除化合物9外,其他化合物均为首次从白木香叶中分离得到.     

白木香叶化学成分的研究

目的:研究白木香叶的化学成分。方法:应用溶剂法和色谱法分离纯化化合物,利用谱学技术鉴定化合物结构。结果:分离得到33个化合物,本文鉴定12个化合物的结构,分别为5-羟基-7,4’-二甲氧基黄酮(1)、金合欢素(2)、木犀草素(3)、芫花素(4)、芫花苷(5)、腺苷(6)、芫花素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(7)、高次衣草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、次黄嘌呤(9)、尿嘧啶(10)、8-C-β-D-半乳糖基异牡荆素(11)、4-(1,2,3-三羟基丙基)-2,6-二甲氧基苯-1-O-β-D-葡萄糖苷(12)。结论:除化合物1,3,4外,化合物2,5～12均为首次从白木香叶中分离得到。     

白木香树干的化学成分研究

为了研究白木香树干的化学成分,该研究采用硅胶柱色谱与Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行分离纯化,并运用波谱方法对所分离的化合物进行结构鉴定。从白木香树干正丁醇萃取物中分离鉴定了16个化合物,经波谱解析鉴定为threo-buddlenol C(1),thero-ficusesquilignan A(2),erythro-buddlenol C(3),(±)-buddlenol D(4),(-)-杜仲树脂酚(5),(-)-松脂素(6),5'-甲氧基落叶松脂醇(7),erythro-guaiacylglycerol-β-coniferyl ether(8), threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl ether(9),herpetin(10),(+)-丁香树脂酚(11),curuilignan(12),刺五加酮(13),松伯醇(14),3,4,5-三甲氧基苯酚(15),雪胆甲素(16),其中化合物1~13为木脂素。化合物1~10,14~16均为首次从白木香中分离得到。     

白木香枝枯病病原菌的鉴定

目的:明确白木香枝枯病的病原菌,确定其是否能够诱导白木香产生沉香.方法:通过形态特征观察、rDNA-ITS序列测定分析、柯赫氏法则验证确定病原菌及其分类地位.结果:分析结果表明,侵染白木香Aquilaria sinensis的病原菌为可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae,该菌可诱导沉香产生.结论:首次明确白木香枝枯病的病原菌为可可毛色二孢,为利用真菌诱导白木香结香研究提供理论基础.     

白木香叶的化学成分研究(二)

为综合利用白木香叶的丰富资源,阐明其物质基础,课题组再次对其化学成分进行了研究,采用多种色谱技术对其化学成分进行分离纯化,从白木香叶95%,70%乙醇提取物的氯仿和正丁醇萃取部位共分离得到12个化合物.经多种波谱方法鉴定其结构,分别为鸢尾酚酮2-(O-α-L)-吡喃鼠李糖苷(3),4'-羟基-5-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖(6-1)木糖苷(2),7,3',5'-三甲氧基黄酮苷(3),5-甲氧基芹菜素7-(O-β-D)-葡萄糖苷(4),2-苯乙基1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),红景天苷(6),苯甲醇1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(7),2,6-二甲氧基-4-羟基苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8),vanilloloside(9),(+)-丁香脂素(10),β-维生素E(11),豆甾-5-烯-3β,7α-二醇(12),化合物 2,3,5~9,11和12 为首次从该属植物中分离得到.另外,对氯仿萃取部位的9个流分进行了4种人体肿瘤细胞毒活性筛选,均未显示明显活性.     

白木香内生真菌多节孢 Nodulisporium sp. A4的化学成分研究

目的:研究来源于药用植物白木香、具有抗肿瘤活性的内生真菌多节孢Nodulisporium sp.A4的化学成分.方法:采用马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基培养、乙酸乙酯萃取得到内生真菌A4的发酵液和菌丝体粗提物,采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱、制备薄层色谱和重结晶等方法对粗提物进行分离纯化,运用现代波谱技术(NMR,MS)结合文献对照鉴定化合物结构.采用MTT法测定化合物的体外抗肿瘤活性.结果:从内生真菌A4的发酵液中分离获得7个化合物,分别为5-methyl-2-vinyltetrahydrofuran-3-ol(1),6-methyl-2-(5-methyl-5 -vinyltetrahydrofuran-2 -yl)hept-5-en-2-ol (2),6α-hydroxycyclonerolidol(3),rel-( 1S,4S,5R,7R,10R) -10-desmethyl-1 -methyl-11 -eudesmene(4),酪醇(5),8-甲氧基-1-萘酚(6),1,8-二甲氧基萘(7).从内生真菌A4的菌丝体中分离获得3个化合物,分别为麦角甾醇(8),过氧化麦角甾醇(9),啤酒甾醇(10).药理活性评价结果表明在作用浓度为100 mg·L-1时,化合物3和4对肿瘤细胞SF-268和NCI-H460的抑制率分别为89.1％,44.2％和82.3％,79.8％.结论:化合物1为新的天然产物,化合物2,3,7,10为首次从该属真菌中分离得到,化合物3和4对肿瘤细胞SF-268和NCI-H460的增殖具有一定的抑制作用.