榄香烯抑制人晶状体上皮细胞增殖的蛋白质组研究

目的 探讨中药单体榄香烯对碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)诱导的人晶状体上皮细胞(HLE-B3)增殖的抑制作用及其蛋白质组学规律.方法 实验研究.共分为3组:正常组、rhbFGF组及榄香烯组.正常组为培养的HLE-B3,rhbFGF组加入终浓度为10 μg/L rhbFGF,榄香烯组加入终浓度为10μg/L rhbFGF和80 mg/L榄香烯.24 h后四甲基偶氮唑蓝法检测榄香烯对HLE-B3增殖的抑制作用;蛋白质芯片联合表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术检测分析榄香烯作用于HLE-B3后蛋白质表达谱的改变、寻求差异蛋白.采用单因素方差分析,并通过Dunnett-t检验进行正常组、rhbFGF组、榄香烯组吸光度值的两两比较;对每个质荷比峰值做Kruskal-Wallis秩和检验,采用Nemenyi检验对正常组、rhbFGF组、榄香烯组中每个特定质荷比的蛋白质峰值进行两两比较.结果 (1)四甲基偶氮唑蓝法检测显示:rhbFGF组HLE-B3吸光度A值(0.599±0.053)比正常组(0.409±0.042)显著升高,榄香烯组HLE-B3吸光度A值(0.450±0.061)比rhbFGF组显著降低,抑制率达24.90%,差异有统计学意义(F=28.886,P=0.000).(2)用rhbFGF诱导HLE-B3增殖后,出现了5个差异表达的蛋白点,其中质荷比为8093和9516的2个蛋白点表达上调,质荷比为5361、9666及13 767的3个蛋白点表达下调;榄香烯作用于增殖的HLE-B3后,出现10个差异表达的蛋白点,其中质荷比为2487、4392、8566及11 600的4个蛋白点表达上调,质荷比为3679、4826、6861、9516、9557和9672的6个蛋白点表达下调.结论 榄香烯能有效抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增殖,质荷比为9516的蛋白点可能是榄香烯抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增殖的作用靶点.     

氧化还原信号转导的研究进展及其对晶状体上皮细胞增殖的作用

氧化还原信号转导是近十年发展起来的新理论。该理论认为，生长因子及细胞因子作用于细胞后，细胞内迅速生成活性氧，这些活性氧有第二信使的作用，参与了DNA复制、细胞增殖、迁移、分化等过程。本文就氧化还原信号转导的研究进展及其在晶状体的研究现状进行综述。     

增殖细胞核抗原反义寡核苷酸对牛晶状体上皮细胞增殖的影响

目的　探讨增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearantigen ,PCNA)反义寡核苷酸对牛晶状体上皮细胞增殖的影响。方法　取体外培养的第 2代牛晶状体上皮细胞用于实验。A～F组分别加入PBS、30 μmol/LPCNA反义寡核苷酸、30 μmol/LPCNA正义寡核苷酸、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、10 μg/LbFGF及 30 μmol/L反义寡核苷酸、10 μg/LbFGF及30 μmol/L正义寡核苷酸 ;常规培养 2 4h后 ,使用流式细胞仪检测细胞周期的变化和PCNA蛋白的含量。提取细胞mRNA ,采用地高辛标记PCNA探针和Northen酶联吸附免疫杂交法 ,在酶标仪上测定吸光度 (A值 )以表达PCNAmRNA含量。结果　牛晶状体上皮细胞S期的细胞数量占细胞总数的百分比A组为 ( 15 7± 1 8) % ,B组为 ( 7 9± 0 4) % ,两组比较差异有非常显著意义 (P <0 0 1) ;PCNAmRNA含量A组A值为 0 2 0 6± 0 0 0 4,B组A值为 0 173± 0 0 14,两组比较差异有显著意义 (P<0 0 5 ) ;PCNA蛋白表达率A组为 ( 5 5 2 7± 2 6 4) % ,B组为 ( 12 32± 1 82 ) % ,两组比较差异有非常显著意义 (P <0 0 1)。牛晶状体上皮细胞S期的细胞数量占细胞总数的百分比D组为 ( 2 3 4± 2 8) % ,E组为( 19 9± 2 3) % ,两组比较差异有显著意     

碱性成纤维细胞生长因子诱导牛晶状体上皮细胞增殖细胞核抗原的表达及对晶状体上皮细胞增殖作用的研究

目的 观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导牛晶状体上皮细胞（bovine lens epithelial cell,BLEC)增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及对BLEC增殖的作用。方法 取体外培养的第2代BLEC,加入不同浓度的bFGF(0.01-100.00μg/L）共同培养24－96h后,用^3H-TdR掺入法测定BLEC DNA合成率,用流式细胞仪检测细胞周期和PCNA的表达。结果 不同浓度的bFGF有促进BLEC增殖作用,并呈剂量时间依赖性,当浓度为10.00μg/L的bFGF作用BLEC24－48h后,晶状体上皮细胞的^3H-TdR掺入值分别为11772．5和10988．2,较对照组的6550．5增加约一倍,两组比较差异有显著意义（P＜0．05）。bFGF作用BLEC可使PCNA表达率上升（77．40％）,并使BLEC周期发生变化,S期细胞和G2／M期细胞比例分别提高至23．41％和20．76％,与对照组比较,差异有显著意义（P＜0．05）。结论 bFGF通过上调BLEC的PCNA表达,改变细胞周期,致使BLEC进入增殖状态。     

bFGF对人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ｂＦＧＦＧ）在体系对人晶状体上皮细胞增殖的影响及机制探讨。方法 取人晶状前囊膜培养。加入不同浓度ｂＦＧＦ（１μｇ．Ｌ＾－１１０μｇＬ＾－１、１００μｇ．Ｌ＾－１）,４８ｈ后免疫组化测增殖核细胞抗原阳性面积率,取人晶状体前囊膜免疫组化测ｂＦＧＦ受体。结果 一定浓度（１～１００ｕｇ．Ｌ＾－１）的ｂＦＧＦ在体     

碱性成纤维细胞生长因子对兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的：观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor ,bFGF)对兔晶状体上皮细胞（rabbit lens epithelia cell,RlECs)的作用。方法：采用bFGF作用于第2－3代培养细胞,用MTT法测定细胞对增殖的影响;电观察细胞形态的变化,流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果：bFGF可促进晶状体上皮细胞的增殖,尤其是浓度为10μg.L^-1作用最明显,透射电镜显示细胞增殖活跃,流式细胞仪观察进入S期的细胞明显增加。结论：bFGF是促进培养兔晶状体上皮细胞增殖的重要因素。     

反义c-myc基因转染抑制人晶状体上皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导的反义cmyc基因(AdASmyc)转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)系B3(HLEB3)增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法将AdASmyc转染HLEB3,观察细胞形态变化;采用生长曲线法、噻唑蓝比色法分析细胞增殖改变;使用流式细胞仪测定细胞凋亡变化、分析细胞周期改变(DNA倍体法);采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法、Western免疫印迹法检测细胞cmycmRNA及其蛋白产物表达的变化。结果AdASmyc成功转染后,HLEB3逐渐变圆、脱壁。转染后24~96h细胞的增殖受到抑制,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<001);凋亡细胞比例(转染48h为1833%,转染96h为2693%)明显升高,与相应对照组(48h为319%,96h为175%)比较,差异均有统计学意义(P<001);细胞出现G1期阻滞现象,表现为G1期细胞比例[转染48h为(6050±759)%,转染96h为(8190±860)%]增加和S期细胞比例[转染48h为(2840±338)%,转染96h为(1675±897)%]下降,与相应对照组比较,差异均有统计学意义(P<001);RTPCR法和Western免疫印迹法检测发现cmycmRNA及其蛋白产物水平特异性下调。结论AdASmyc可成功转染HLEB3,并特异性抑制cmyc基因的表达,诱发细胞G1期阻滞,有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

过氧化氢对人晶状体上皮细胞内细胞质膜微囊蛋白的影响

目的探讨过氧化氢（H2O2）对人晶状体上皮细胞的细胞质膜微囊蛋白（CP）及磷酸化CP-1分布与表达的影响。方法给予人晶状体上皮细胞（SRA01／04）不同浓度及不同时间点的H2O2刺激。用激光共聚焦显微镜和免疫荧光显微镜观察CP及磷酸化CP-1的分布。通过免疫印迹试验观察CP表达水平的变化以及磷酸化CP—1的表达。结果通过激光共聚焦显微镜和荧光显微镜,观察到人晶状体上皮细胞的质膜和细胞质内含有丰富的CP;当给予细胞H2O2刺激后,细胞质内CP的分布增多;当刺激时间达到1h,细胞膜被破坏,但仍可观察到CP的分布情况。此外,H2O2的刺激可以使CP-1发生磷酸化。免疫印迹试验发现,随着H2O2作用时间的延长和刺激浓度的升高,细胞质膜和细胞总蛋白质的CP表达水平呈下调趋势。结论H2O2刺激人晶状体上皮细胞后,CP重新分布并可能破坏了细胞质膜微囊（caveolae）的结构,使得细胞的CP表达下调。细胞质膜微囊和CP可能在人晶状体上皮细胞中具有重要作用。     

C-Met抑制剂对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的:探讨 c-M et抑制剂 K252a 对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用。方法 : 取原代培养人晶状体上皮细胞加入 H G F、H G F K252a,以 D M EM 为对照,应用四唑盐法(M TT法)观察 K252a 对晶状体上皮细胞生长的抑制作用,蛋白质免疫印迹(W estern blot)方法检测 K252a 对 Bcl-2,C aspase-3 蛋白表达的影响。结果:H G F (50nm ol/L) K252a(30nm ol/L)组与对照组光密度值无显著差异 (P>0.05),Bcl-2 和 C aspase-3 的表达水平变化都不明显。结论:c-M et抑制剂 K252a 对人晶状体上皮细胞增殖有抑制作用。     

过氧化氢酶基因重组腺病毒对大鼠晶状体氧化损伤的防护作用

目的探讨过氧化氢酶(CAT)基因重组腺病毒对晶状体氧化损伤进行基因治疗的可行性。方法克隆CAT基因,构建CAT基因重组腺病毒,测定病毒液滴度。体外培养大鼠晶状体,Western印迹分析确定重组腺病毒感染大鼠晶状体后CAT表达峰值时间。按随机分组原则将大鼠晶状体分为对照组(A组)、H2O2处理组(B组)、H2O2及重组腺病毒处理组(C组),分别于6、12、18、24h检测晶状体透明度,并采用双染色流式细胞技术进行细胞凋亡分析。结果构建出具有生物学活性的CAT基因重组腺病毒。CAT基因重组腺病毒感染体外培养大鼠晶状体后9h,CAT表达达到峰值,并在36h内保持恒定。6、12、18、24h,C组晶状体的透明度均低于A组,高于B组,3组比较差异均有统计学意义(P<005);C组细胞凋亡率均高于A组,低于B组,3组比较差异均有统计学意义(P<005)。结论CAT基因重组腺病毒可抑制氧化剂导致的晶状体混浊和晶状体上皮细胞凋亡,具有用于治疗氧化所致白内障的可能性。     

短发夹状RNA干扰bcl-2后诱导人晶状体上皮细胞凋亡的实验研究

目的 应用RNA干扰技术抑制人品状体上皮细胞(HLEC)bcl-2基因表达,观察诱导其细胞凋亡情况,为防治晶状体后囊膜混浊提供新的策略.方法 实验研究.设计2条以bcl-2基因为靶标的短发夹RNA(shRNA),克隆入质粒PGCsi表达载体,分别命名为P1、P2,经脂质体转染入永生性HLEC系SRA01/04,48 h后检测转染效率和bd-2的基因及蛋白表达情况,并检测HLEC的细胞凋亡情况.多组间及组间计数资料的比较,采用随机区组设计的方差分析.结果 重组质粒经自动基因测序仪测序,证实构建成功.转染后48 h,流式细胞仪测得P1、P2转染率为44.1%、47.2%.免疫印迹法测得P1、P2组的bcl-2蛋白表达较对照组降低,实时荧光定量聚合酶链反应法测得P1、P2组的bcl-2 mRNA相对表达量为0.435、0.476,较对照组降低(F=1672.4,P<0.05),流式细胞仪双染法测得P1、P2组HLEC的细胞凋亡率分别为42.3%、45.4%,较对照组增加(F=1756.2,P<0.05),并且活化型caspase-3蛋白的表达增加.结论 P1、P2可抑制HLEC的bcl-2基因表达,并诱导HLEC凋亡.(中华眼科杂志,2009,45:636-640)     

姜黄素诱导牛晶状体上皮细胞凋亡的机制

目的探讨天然药物姜黄素对晶状体上皮细胞(LEC)凋亡的诱导效应及其机制。方法通过透射电镜观察姜黄素对体外培养的牛LEC超微结构的影响;采用流式细胞术(FCM)观察姜黄素对LEC的DNA含量及线粒体跨膜电位(AΨm)的影响。结果透射电镜下可观察到姜黄素组LEC呈现核染色质凝聚、固缩、边集、核碎裂等典型的细胞凋亡形态学改变。经FCM检测显示,姜黄素组作用早期(24 h)LEC细胞核的DNA量没有改变,在作用的中、晚期(48、72 h)细胞核内DNA呈现明显的下降趋势,DNA含量显著低于空白对照组(P<0．01);而姜黄素作用早期线粒△Ψm已经开始下降,8 h时△Ψm下降的细胞数占(4．13±0．52)％;作用72 h后达高峰,占(46．91±3．71)％。各期与正常对照组的差异均有统计学意义(P<0．01)。结论姜黄素可通过细胞核和细胞质两种途径诱导LEC凋亡。诱导LEC凋亡可能是姜黄素减少晶状体后囊膜混浊的细胞和分子机制,姜黄素可能成为一种新型的、高效低毒的防治后发性白内障的药物。     

人及小鼠白内障晶状体上皮细胞凋亡的超微结构

目的 探讨人老年性白内障及小鼠先天性白内障与其晶状体上皮细胞凋亡的关系。方法 用透射电镜观察４例老年性白内障患者及２例先天性白内障小鼠晶状体上皮细胞凋亡的超微结构,并分别与同类正常晶状体上皮细胞超微结构进行比较。结果 老年性白内障患者及先天性白内障小鼠晶状体上皮细胞中均可见凋亡细胞,而正常晶状体未见凋亡细胞。结论 人老年性白内障及小鼠先天性白内障的发生均与其晶体上皮细胞的凋亡有关。     

基质金属蛋白酶抑制剂对培养的人晶状体上皮细胞移行抑制作用的研究

目的 通过体外人晶状体囊袋模型的建立,探讨基质金属蛋白酶抑制剂GM6001对白内障患者术后晶状体上皮细胞移行的抑制作用及其对细胞活性的影响,以寻找一种安全有效地防治晶状体后囊膜混浊的药物.方法 本文为实验研究.16例供体人眼行模拟白内障手术,建立人晶状体囊袋培养模型,确认赤道部晶状体上皮细胞开始移行后,将晶状体囊袋置于不同浓度(1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L)的GM6001及其阴性对照液(100 μmol/L)中培养(每组4个囊袋).相差显微镜下分别测量培养10、20及30 d时各组晶状体上皮细胞在后囊膜移行的距离;酶联免疫吸附实验测定囊袋培养液中MMP-2和MMP-9的浓度.四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定不同实验浓度GM6001对细胞活性的影响.多组间及组间计数资料的比较,采用随机区组设计的方差分析.结果 培养的人晶状体囊袋中赤道部晶状体上皮细胞第4天开始移行.GM6001明显抑制了晶状体上皮细胞在后囊膜的移行,呈剂量依赖性(F=53.79,P<0.01):实验第20天,10μmol/L GM6001组晶状体上皮细胞移行距离较对照组减少70%(P<0.01),100μmoL/L组减少98%(P<0.01);GM6001降低了MMP-2、MMP-9表达水平,浓度越高,抑制作用越明显(F=86.59,72.96;P<0.01):实验第20天,10 μmol/L GM6001组MMP-2和MMP-9表达水平较对照组均降低70%(P<0.01),100 μmol/LGM6001组MMP-2水平降低了90%(P<0.01),MMP-9水平降低了87%(P<0.01);MTT法显示,晶状体上皮细胞在GM6001中仍保持增殖活性,各处理浓度组光密度(A)值与对照组比较差异无统计学意义(F=0.62,P>0.05).结论 MMP抑制剂有效地抑制了体外囊袋培养的人晶状体上皮细胞在后囊膜的移行,且对细胞活性无明显影响.因此,MMP抑制剂可能对预防后囊混浊有一定作用.     

Wnt3a促进人晶状体上皮细胞增生及相关机制的研究

背景 晶状体上皮细胞(LECs)的异常增生是晶状体后囊膜混浊(PCO)的重要病理基础,以往研究证实Wnt3a信号可促进上皮细胞的增生,但其对LECs的作用机制尚不清楚. 目的 研究Wnt3a对人LECs增生的作用,探讨相关分子机制,为PCO的临床治疗提供新的靶点.方法 将人LECs系SRA01/04细胞进行培养后以4×105个/孔的密度接种于6孔板继续孵育.构建Wnt3a cDNA表达载体,采用脂质体介导转染技术将Wnt3a cDNA表达载体瞬时转染人SRA01/04细胞中,对照组转染pcDNA3-HA表达载体.采用Western blot技术验证载体在转染细胞中的表达;MTT法和流式细胞仪检测Wnt3a在SRA01/04细胞中的过表达对细胞增生能力的影响;Western blot法检测Wnt3a过表达对Wnt/β-catenin下游信号分子β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达的影响;应用免疫荧光法检测Wnt3a过表达后β-catenin表达的定位变化;采用免疫细胞化学法检测Wnt3a过表达后增生细胞核抗原(PCNA)蛋白表达的变化.结果 本研究成功构建了人Wnt3a基因的表达载体Wnt3a cDNA,获得Wnt3a过表达的Wnt3a/SRA01/04细胞及对照pcDNA3-HA/SRA01/04细胞.Western blot检测证实,与pcDNA3-HA/SRA01/04相比,Wnt3a/SRA01/04细胞内Wnt3a蛋白表达明显升高.MTT法检测表明,Wnt3a cDNA转染组SRA01/04细胞的增生率明显高于对照组(F分组=15.235,P=0.005;F时间=369.677,P=0.000),转染后各时间点2个组间SRA01/04细胞的增生率差异均有统计学意义(t=20.843,P=0.001;t=26.214,P＜0.01;t=25.177,P=0.001;t=35.516,P＜0.01;t=615.056,P＜0.01).细胞周期分析发现,Wnt3a cDNA转染组G1期细胞比例为51.74％,明显少于对照组的79.44％,而S期细胞的比例为36.23％,明显多于对照组的12.34％.Wnt3a cDNA转染组SRA01/04细胞PCNA蛋白表达阳性率为47.00％±7.58％,明显高于对照组的16.00％±3.61％,差异有统计学意义(t=8.256,P＜0.01).转染后48 h,β-catenin蛋白密集分布于Wnt3a/SRA01/04细胞核和细胞质中,而在对照组仅出现于细胞质之中.Wnt3a/SRA01/04细胞中Wnt3a蛋白表达水平上调,β-catenin细胞定位由细胞质转入细胞核;Wnt/β-catenin信号通路靶蛋白Cyclin D1和c-Myc蛋白表达上调. 结论 在SRA01/04细胞中,Wnt3a过表达使Wntβ-catenin信号通路活化,下游靶蛋白Cyclin D1和c-Myc表达上调,可促进人LECs的增生.     

端粒酶活性在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中的表达及意义

目的 探讨端粒酶活性在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中的表达及意义.方法 对新西兰大白兔11只(22只眼)行超声乳化晶状体吸除术法,术后3个月所有实验动物的晶状体后囊膜均已混浊.20只眼分别取赤道部囊膜、混浊后囊膜组织,采用端粒重复序列扩增-聚丙烯酰胺凝胶电泳法定性和端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附定量法检测其晶状体上皮细胞端粒酶活性.两者端粒酶活性比较采用成组设计t检验.结果 以HepG2细胞作为端粒酶检测阳性对照,兔晶状体赤道部囊膜组织、后囊膜均可检测到端粒酶活性,表现为自50 bp开始多个模糊梯度条带状电泳图谱,其吸光度A450-690值分别为0.85±0.23、0.67±0.19,两者比较差异有统计学意义(t=2.526,0.021;P＜0.05).结论 在兔后囊膜混浊晶状体上皮细胞中存在端粒酶活性,其活性较晶状体赤道部囊膜上皮细胞低.     

人原代晶体上皮细胞bFGF多肽和mRNA的表达

目的 为研究后发性白内障的发生机理,检测生长中人晶体上皮细胞（ＨＬＥＣｓ）自身是否表达碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）。方法 体外培养人晶体上皮细胞,用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交的方法,检测ＨＬＥＣｓ中ｂＦＧＦ多肽和其ｍＲＮＡ的表达。结果 用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交方法,可检测到生长中的人晶体上皮细胞自身表达碱性成纤维细胞生长因子。结论 结合碱性成纤维细胞生长因子促进人晶体上皮细胞生长     

体外模拟牛眼晶状体后囊膜混浊及普拉洛芬眼液对其细胞融合影响的实验研究

目的探讨晶状体后囊膜上晶状体上皮细胞的增生分化规律和普拉洛芬滴眼液对晶状体后囊膜混浊（PCO）的抑制作用.方法将牛后囊膜晶状体上皮细胞面朝上平铺于25 ml培养瓶底部,分别加入含0%、10%、20%胎牛血清的DMEM培养液培养1～5周,计数后囊膜晶状体上皮细胞覆盖率,并用Giemsa染色和扫描电镜观察其形态.同时用相当于普拉洛芬滴眼液滴眼后4 h在房水中的浓度（0.23 mg/L）作用于组织培养模型,与对照组比较,观察其对后囊膜晶状体上皮细胞融合时间的影响.结果赤道部的晶状体上皮细胞向晶状体后囊膜增生、迁徙,晶状体后囊膜形成明显的混浊和皱缩;后囊膜晶状体上皮细胞融合天数随血清浓度的升高而缩短;浓度为0.23 mg/L的普拉洛芬对后囊膜晶状体上皮细胞的融合有明显抑制作用.讨论体外模拟PCO的组织培养是研究后发性白内障的有效方法.普拉洛芬是一种安全、有效降低PCO发生率的药物,可作为白内障术后的常规用药.