质粒电穿孔转染条件的选择

电穿孔转染,作为物理方法的一种,出现于20世纪80年代中期~([1]).这种方法不仅能够将DNA、RNA,还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞.它是一种高效、简便的基因转移系统,具有其它转移方法无可比拟的优越性,如操作简便、快捷,可重复性强,转染率高,适用谱广等.     

PAMAM-D对异种移植用外源基因转染猪精子细胞的安全性研究

目的 研究应用PAMAM-D对异种移植用外源基因hDAF转染猪精子细胞的安全性.方法 制备PAMAM-D/hDAFcDNA复合物,将PAMAM-D及复合物与处理后猪精子细胞共孵育,经精子质量检测工作站检测孵育后的精子活力和精子畸形率.结果 经精子质量检测工作站检测,PAMAM-D和PAMAM-D/DNA复合物对猪精子细胞活力和精子细胞畸形率没有明显影响.结论 PAMAM-D及其复合物对猪精子细胞没有明显毒性,应用PAMAM-D制备异种移植用转基因动物是一种安全的方法.     

重组质粒电穿孔转染条件探讨

目的：为优化电穿孔转染质粒的条件,提高转染率。方法：以不同条件用电穿孔方法将重组质粒ＰＬＸＳＮ－Ｓ转入ｐ８１５、ｐＡ３１７、ＨｅｐＧ２、ＥＬ４等真核细胞,探讨电压,电容及电转缓冲液温度对转染率的影响。结果（１）低电压（２００～３００Ｖ）,高电容（９００～１０００ｕＦ）能高效转染实验所用真核细胞;（２）冰浴可提高转染率;（３）电击时间以１５～３０ｍｓ较合适。结论：电穿孔是一种高效的基因转染方法,通过优化其条件,可以提高转染率。     

精子细胞输精管及附睾管内转染法建立转基因小鼠

目前，生产转基因动物主要的方法仍是受精卵显微注射法，所需设备复杂，技术难度大，成功率低。为此，人们都在寻找一种新的方法。利用精子携带外源DNA进入卵母细胞的精子载体法是设想之一。九十年代初，Mare和Rottmann等分别报导了电击法和脂质体转染法让精子在体外携带上外源DNA，再行体外受精的方法，引起了学者们的广泛关注，但其结果不稳定，阳性率极低。我们采用脂质体包裹外源DNA，直接注入输精管内，数天后与雌鼠交配的方法，得到了较为满意的结果，现简报如下。1材料和方法将构建好的WAP－t－PA质粒与脂质体混合制备成转染…     

电穿孔转染悬浮细胞条件的优化

目的以RNA依赖性腺嘌呤脱氨酶(ADAR1)为靶基因优化悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞的电穿孔转染条件。方法通过控制电压、温度、细胞状态等转染条件,采用不同条件组合将靶向ADAR1的siRNA导入悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞,用倒置显微镜观察、细胞计数、台盼蓝拒染试验来计算siRNA序列转染率和细胞存活率。结果小鼠原代淋巴细胞在400V,40μs条件下可获得最大转染率,约为30.6%;良好的细胞状态以及低温条件可获得更好的转染效果。结论电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,通过优化其转染条件,可以提高其对悬浮细胞的转染率。     

大鼠胎脑神经干细胞的分离培养及电穿孔转染

目的 分离培养大鼠胎脑神经干细胞(NSC),研究电穿孔技术在NSC中的转染效率.方法 从sD胎鼠脑组织中分离、培养和扩增NSC,利用免疫荧光组织化学技术对NSC及其分化细胞进行鉴定.使用电穿孔技术将质粒pEGFP-N1转染入NSC,利用其表达的绿色荧光蛋白(GFP)作为转染成功的报告物或标记物,在荧光显微镜下根据发出绿色荧光的NSC数量,计算出转染效率.结果 从SD胎鼠脑组织中分离的细胞在体外可长时间自我增殖,原代及传代克隆细胞均表达NSC的特异性抗原巢蛋白,且诱导分化后可表达星形胶质细胞的特异性抗原-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元的特异性抗原-神经元特异性烯醇化酶(NSE).用电穿孔技术转染神经干细胞,其效率为17.9%～69.1%,平均30.5%.结论 本实验成功分离出具有自我增殖和多向分化潜能的胎鼠NSC,并证实电穿孔技术可对其进行高效转染,为进一步研究NSC的转基因治疗提供实验基础.     

Jurkat T细胞电穿孔转染条件的优化

目的优化人急性淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat T细胞)的电转染条件。方法通过选择不同的电压、质粒浓度、细胞状态等转染参数,采用不同条件组合后用电穿孔法将质粒转入Jurkat T细胞。通过锥虫蓝拒染实验和荧光显微镜分析转染效率。结果 Jurkat T细胞在电压150 V条件下转染效率达到(62.10±2.13)%;处于对数生长期的细胞转染效率较高;质粒浓度低于0.5 g·L-1时影响转染效率;短时期内温度对转染效率的影响不大。结论本实验通过选择优化Jurkat T细胞的转染参数、控制影响因素,可有效提高Jurkat T细胞电转染效率。     

悬浮细胞电穿孔转染参数的选择研究

目的以凋亡抑制蛋白家族成员Survivin为目的基因,对采用电穿孔转染悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞的各种参数进行选择,以提高转染效率。方法通过选择不同的电压、温度、细胞状态等转染参数,采用不同参数组合将化学合成靶向Survivin的siRNA导入悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞,用倒置显微镜观察细胞计数,台盼兰拒染试验来评估siRNA的转染率和细胞存活率。结果小鼠原代淋巴细胞在350 V,40μs条件下,可获得最大转染率,约为31%;良好的细胞状态以及低温条件等参数均可获得更好的转染效果。结论电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法 ,通过选择经优化的针对悬浮细胞的转染参数,可以获得较高的转染率。     

电穿孔转染K562细胞的效率研究

目的:探讨脂质体转染与电穿孔转染的效率,观察电转染对K562细胞凋亡的影响。方法:以GFP为报告基因,通过脂质体转染及电穿孔两种方式转染K562细胞,荧光显微镜下观察并计算转染效率,Annexin V和PI观察细胞凋亡率。结果:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,电穿孔转染效率10%左右,脂质体转染效率小于1%。电穿孔时K562细胞凋亡率为40%。结论:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,但细胞凋亡率也高。     

电穿孔转染SD大鼠神经干细胞条件优化

目的 以原代培养的SD大鼠神经干细胞为研究对象,优化电穿孔转染条件.方法 通过设置不同的电压、脉冲时间、电压脉冲时间组合等电转染条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的靶向大鼠β-catenin基因的siRNA质粒导入SD大鼠神经干细胞,48 h后观察并比较神经干细胞的转染效率,确定最佳电转染条件.结果 300V电压、60μs脉冲时间或300V电压、80μs脉冲时间的转染条件下,SD大鼠神经干细胞可获得较好的转染效率,分别为(62.21±11.56)％和(53.34±9.0)％.结论 电穿孔转染是一种高效的基因转染方法,通过条件的优化,可以提高SD大鼠神经干细胞的电转染效率     

电穿孔法基因转染悬浮细胞条件的优化

目的 以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因优化悬浮培养的白血病细胞的电穿孔转染条件。方法 通过控制电压、电容、细胞状态、温度及缓冲液等转染条件，采用不同条件组合后用电穿孔法将质粒GFP转入悬浮培养的人白血病细胞株K562和NB4，用流式细胞仪和荧光显微镜观察转染率。结果 (1)低电压、高电容能高效转染悬浮培养的人白血病细胞，细胞类型不同条件有所差异，K562细胞在250V、950μF得到最大转染率40．6％，NIM细胞在350V、950μF得到最大转染率32．9％。(2)良好的细胞生长状态能明显提高转染率。(3)温度和缓冲液中的血清成分对电穿孔效率影响不大。结论 电穿孔是一种高效的基因转染法，通过优化其条件，可提高转染率。     

电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化

目的:通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorscent proteinEGFP)的真核表达载体pIRES2-EGFP(IRES2 internal ribosome entrysite 2 内部核糖体进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell,imDC),探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响.方法:通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC.在大肠杆菌中扩增pIRES2-EGFP质粒,选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等.应用电穿孔仪将pIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞,荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数.0.4%锥虫蓝(trypan blue)染色,计数电转染后细胞存活率.结果:当imDC浓度为5×10<'6>/mL与6/μg DNA质粒混合,设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 μs时,其电转染率到最高,细胞存活率最高,转染后24 h明显表达,48 h后表达最强.结论:在适当的电压、脉冲时间下,选择适当的细胞浓度、DNA剂量,在转染后的一定时间范围内,电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少.电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术.     

电穿孔法介导siRNA高效转染小鼠原代软骨细胞

目的：建立小鼠原代软骨细胞高效电转siRNA的方法。方法常规分离得到的小鼠原代软骨细胞继续用链丝菌蛋白酶消化3h,然后应用高效电转缓冲液和优化的电转参数转染pCMV－EGFP表达质粒或siRNA,用台盼蓝检测细胞存活率;转染后48h分析转染效率和siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平。结果电穿孔后原代软骨细胞的存活率＞80％,质粒的转染效率达到37．3％±5．2％;siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平分别下调了75％和66％。结论成功建立了通过电穿孔介导siRNA转染小鼠原代软骨细胞的方法,达到了很好的基因沉默效果且保持了较高的细胞存活率。     

电穿孔法转染人原代成纤维细胞条件的优化

目的 通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件.方法 通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1电穿孔转染入人原代成纤维细胞.利用锥虫蓝染色检测细胞存活情况,采用流式细胞术检测转染24 h后的转染效率.结果 在低电压模式下,脉冲电压320 V、质粒浓度为20 μg/mL、脉冲1次时,人原代成纤维细胞的电转染效果最理想,转染效率达到(42.53±0.63)％,细胞存活率为(74.30±3.01)％.结论 优化了人原代成纤维细胞的电转染条件,在保证细胞较高存活率的前提下提高了人原代成纤维细胞的电转染效率,为后续基因功能的研究打下基础.     

宫颈癌SiHa细胞脂质体与电穿孔转染效果比较

目的探讨脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad gene，FHIT）转染宫颈癌SiHa细胞过程中脂质体与电穿孔两种转染方法的效果有无区别。方法分别用脂质体和电穿孔方法将真核表达质粒PRcCMV—FHIT及PRcCMV转染SiHa细胞，用带绿色荧光蛋白的PEGFP—C2空质粒检测瞬时转染效率。结果脂质体与电穿孔两种方法的瞬时转染效率无明显差别，但转染过程中两种方法转染的细胞形态有差别；在筛选稳定转染细胞株的过程中，电穿孔法转染的细胞更易存活。结论两种方法均适于瞬时转染，而电穿孔法可能更适于稳定转染。     

电穿孔转染法与脂质体转染法对K562和HepG2细胞转染效率的影响

目的通过对电穿孔转染法和脂质体转染法在K562、HepG2细胞中的转染效率比较,探索最佳的细胞转染方法和条件。方法以K562、Hep G2细胞为研究对象,采用电穿孔转染法和脂质体转染法分别转染带有绿色荧光的质粒PEGFP-N1和无荧光的质粒p CDNA3.1、p CDNA3.1-EOS基因,荧光显微镜下观察PEGFP-N1转染效果,计算转染效率;收集各培养组细胞,裂解后提取蛋白,采用Western blot方法检测基因转染后的蛋白表达。结果当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压150 V时进行电穿孔,转染质粒PEGFP-N1,K562细胞可以得到较高的转染率;当脉冲20 ms、电阻90Ω、电压250 V时,转染质粒PEGFP-N1,Hep G2细胞可以得到较高的转染效率。在K562细胞和Hep G2细胞中,电穿孔转染法的转染效率均显著高于脂质体转染法(P<0.05)。电穿孔转染法转染PEGFP-N1后K562细胞和Hep G2细胞的存活率显著低于脂质体法(P<0.05)。Western blot结果显示电穿孔转染法蛋白表达量高于脂质体转染法(P<0.05)。结论最佳条件下电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,对比较难转染的悬浮细胞效果更佳。     

运用电穿孔技术建立小鼠脑内基因转染模型

目的借助生物物理技术建立一种高效实用的脑内基因转染技术，探讨其在神经科学研究中的应用。方法选取孕15 d C57系小鼠，取出子宫角，用自制玻璃电极将目的质粒和荧光质粒混匀后注入胎鼠侧脑室，应用BTX电转染仪在胎鼠脑两颞极间给予设定的电脉冲刺激，后将胎鼠放入孕鼠腹腔让其自然出生后8 d取脑，冰冻切片，抗GFP、抗Tubulin免疫组化染色，荧光显微镜下观察。结果在小鼠大脑皮层Ⅱ、Ⅲ层，转染CAG-EGFP的脑片可见绿色荧光细胞带，转染细胞抗GFP免疫组化染色阳性；转染DS-red的呈红色荧光细胞带，转染细胞均呈抗Tubulin免疫组化染色阳性。结论子宫内胚胎电转染技术是一个很好的在体基因转染技术，可为神经科学研究提供一个很好的技术平台。