RNAi抑制皮肤鳞癌A431细胞EGFR表达的实验研究

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对皮肤鳞癌A431细胞表皮生长因子受体(EGFR)基因表达的抑制作用及其对A431细胞增殖、凋亡的影响.方法:设计制备两对针对EGFR基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染A431人皮肤鳞癌细胞株,采用RT-PCR法检测EGFR mRNA的表达;Western Blot测定EGFR蛋白的表达;MTT法检测细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:siRNA2干扰后EGFR mRNA与蛋白的表达强度分别为(16.5±1.6)%和(11.1±1.6)%,与对照组比较有统计学差异(P<0.05);在EGFR表达受到抑制的同时,转染后的A431胞生长速度明显变慢;A431细胞的凋亡率为(12.6±1.4)%,与对照组比较有统计学差异(P<0.05).结论:siRNA2能有效抑制皮肤鳞癌细胞EGFR基因的表达,抑制细胞的增殖,并促进细胞凋亡.     

Smad4 在老年喉鳞癌患者中的表达及其临床意义

目的 探讨Smad4 在老年喉鳞癌患者中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学法检测65 对老年喉鳞癌患者及癌旁正常黏膜组织中Smad4 的表达。结果 老年患者喉鳞癌组织中Smad4 蛋白阳性表达率低于癌旁正常黏膜组织（P <0.05）。Smad4 表达水平与喉鳞癌分化程度、淋巴结转移有关（P <0.05）。结论 Smad4 可促进喉癌的发生、发展,可能在喉癌分化、浸润、转移过程中发挥重要作用。     

Smad 1/5和TGF-β1 mRNA在舌鳞状细胞癌组织中的表达

目的 研究舌鳞状细胞癌(SCC)组织中Smad 1/5和转化生长因子β1 (TGF-β1)mRNA的表达,探讨其与肿瘤临床分期、病理分级及淋巴结转移的关系.方法 采用原位杂交法检测49例舌SCC、20例上皮异常增生以及10例正常口腔舌黏膜组织中Smad 1/5和TGF-β1 mRNA的表达.运用χ2检验,分析Smad 1/5和TGF-β 1 mRNA表达与临床病理指标的关系;应用Spearman等级相关分析,检验Smad 1/5 mRNA与TGF-β1 mRNA表达间的相关性.结果 舌SCC、上皮异常增生和正常黏膜组织中,Smad 1/5 mRNA的表达阳性率分别为73.5%、35%和30%;TGF-β1 mRNA表达阳性率分别为67.3%、25%和20%.Smad 1/5和TGF-β1 mRNA在癌组织中的表达显著高于正常黏膜组织(P＜0.05).Smad 1/5 mRNA表达阳性率,在有或无淋巴结转移及不同TNM分期间有显著差异(P＜0.05).Smad 1/5 mRNA与TGF-β1 mRNA表达呈显著正相关(r＝0.405,P＝0.039).结论 舌SCC的发生和发展可能与TGF-β mRNA及其下游信号通路相关.     

Smad 1/5和TGF-β1 mRNA在舌鳞状细胞癌组织中的表达

目的研究舌鳞状细胞癌(SCC)组织中Smad 1/5和转化生长因子β1(TGF-β1) mRNA的表达,探讨其与肿瘤临床分期、病理分级及淋巴结转移的关系。方法采用原位杂交法检测49例舌SCC、20例上皮异常增生以及10例正常口腔舌黏膜组织中Smad 1/5和TGF-β1 mRNA的表达。运用χ2检验,分析Smad 1/5和TGF-β1 mRNA表达与临床病理指标的关系;应用Spearman等级相关分析,检验Smad 1/5 mRNA与TGF-β1 mRNA表达间的相关性。结果舌SCC、上皮异常增生和正常黏膜组织中,Smad 1/5 mRNA的表达阳性率分别为73.5%、35%和30%;TGF-β1 mRNA表达阳性率分别为67.3%、25%和20%。Smad 1/5和TGF-β1 mRNA在癌组织中的表达显著高于正常黏膜组织(P<0.05)。Smad 1/5 mRNA表达阳性率,在有或无淋巴结转移及不同TNM分期间有显著差异(P<0.05)。Smad 1/5 mRNA与TGF-β1 mRNA表达呈显著正相关(r=0.405,P=0.039)。结论舌SCC的发生和发展可能与TGF-β mRNA及其下游信号通路相关。     

青蒿琥酯对人表皮鳞癌A431细胞增殖和凋亡的影响

目的 初步探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对人表皮鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其相关机制.方法 以人表皮鳞癌细胞系A431为研究对象,人永生化角质形成细胞系HaCaT为正常对照,顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP)为药物阳性对照,通过MTT法和流式细胞术观察ART对A431细胞增殖和凋亡的影响,以及铁离子抑制剂去铁敏(desferrioxamine.DFOM)部分阻断ART对A431细胞的生长抑制作用.结果 ART对A431细胞有较明显的增殖抑制作用,对HaCaT细胞的损害显著低于DDP;药物组ART60 μmol/L(IC50)作用A431细胞48 h,A431细胞阻滞于S期[(67.60±4.12)%,P<0.05],同时凋亡率上调[(19.87±0.03)%,P<0.01];药物阻断组DFOM 60μmol/L预处理A431细胞4 h、加入ART60 μmol/L作用钙h,凋亡率显著下调[(7.37±0.02)%,P<0.01],而周期检测未发生变化.结论 ART通过阻滞A431细胞停滞于S期和诱导A431细胞凋亡发挥增殖抑制作用,此作用在一定范围内与药物剂量呈正相关;ART对A431细胞的诱导凋亡作用与Fe2+介导有关;ART毒副作用明显低于DDP.     

TGF －β1与 Smad4在口腔鳞癌组织中的表达及意义

目的：研究转化生长因子（ TGF）－β1及Smad4在口腔鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法免疫组化SP法检测TGF－β1及Smad4在48例口腔鳞癌组织中的表达情况,取10例正常口腔黏膜组织作对照,结合患者临床病理资料进行分析。结果 TGF－β1在口腔鳞癌组织中的阳性表达率为64.6％,高于对照组的30.0％（P＜0.05）,其阳性表达率随着肿瘤病理分级的升高而升高,颈淋巴结转移患者（76.9％）高于未转移患者（36.4％）（P＜0.05）;Smad4在口腔鳞癌组织中的阳性表达率为31.3％,低于对照组的80.0％（P＜0.05）,阳性表达率随肿瘤病理分级升高而降低,低分化患者阳性表达率显著低于高中分化患者（P＜0.05）,颈淋巴结转移患者（19.2％）显著低于未转移患者（81.8％）（P＜0.05）。两者均与患者年龄、性别因素无关（P＞0.05）;TGF－β1与Smad4蛋白表达呈负相关（ r＝－0.39）。结论 TGF－β1和Smad4在口腔鳞癌的发生及发展过程中起着重要作用,联合检测TGF－β1及Smad4蛋白的表达有助于综合评估口腔鳞癌的生物学行为。     

寻常性银屑病皮损区表皮Smad4表达下调

目的 探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号转导途径中共有Smad(Smad4)在寻常性银屑病皮损中的表达水平及其意义.方法 采用反转录-实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-Time RT-PCR)和免疫组化技术分别检测寻常性银屑病皮损和正常对照皮肤中Smad4 mRNA及其蛋白质的表达情况.结果 寻常性银屑病皮损中Smad4 mRNA及其蛋白质表达水平显著低于正常对照皮肤.结论 寻常性银屑病皮损表皮中Smad4表达下调可干扰TGF-β信号转导,有助于寻常性银屑病皮损中表皮增殖状态的形成.     

皮肤黑素瘤细胞3种Smad的表达

目的探讨Smad2、Smad3、Smad4在皮肤黑素瘤细胞中的表达情况。方法应用反转录-实时荧光定量PCR方法和蛋白印迹方法,分别检测人皮肤黑素瘤A375细胞和人正常黑素细胞中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA及蛋白表达。结果 A375细胞中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白表达均显著低于人正常黑素细胞(t=2.361~4.214,P<0.01)。结论在黑素瘤细胞的转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路中Smad2、Smad3、Smad4均出现表达下调,可能参与了皮肤黑素瘤发病。     

皮肤鳞状细胞癌Smad2和Smad7的表达及其临床意义

目的 检测Smad2和Smad7蛋白在皮肤鳞状细胞癌中的表达，分析其与皮肤鳞状细胞癌的病理分级及临床分期的关系。方法 采用免疫组化SABC方法，检测60例皮肤鳞状细胞癌及10例正常皮肤石蜡包埋组织标本中Smad2和Smad7蛋白的表达与定位。采用图像分析技术对蛋白表达定量分析，比较正常鳞状上皮与不同分化程度鳞状细胞癌之间Smad2和Smad7蛋白表达的差异，分析Smad2和Smad7蛋白在皮肤鳞状细胞癌临床Ⅰ期至Ⅲ期的表达差异。结果 正常皮肤和皮肤鳞状细胞癌的胞浆中都表达Smad2和Smad7。与正常鳞状上皮相比，皮肤鳞状细胞癌中Smad2的表达明显下调，而Smad7的表达明显上调（P〈0．05）。皮肤鳞状细胞癌中，临床分期从Ⅰ期到Ⅲ期，Smad2的表达逐渐降低，其中Ⅰ期与Ⅲ期及Ⅱ期与Ⅲ期之间相比，差异有统计学意义（P〈0．05），而Smad7的表达虽然逐渐增加，但差异无统计学意义。结论 Smad2的表达下调及Smad7表达上调可能解除了TGF-β信号对细胞增殖的抑制作用，引起TGF-β的生长抑制信号缺失，使细胞生长失去控制，导致肿瘤的发生。TGF-β信号的下游分子Smad2的表达下调与皮肤鳞状细胞癌的浸润和转移有关。     

转化生长因子-β1与抑癌基因Smad4在肝癌组织中表达及其意义

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)与抑癌基因Smad4(TGF-β1)在肝癌组织中的表达意义。方法用免疫组化SABC法检测TGF-β1与Smad4在肝癌及肝硬化组织中的表达。结果TGF-β1在肝癌组织中的阳性表达率(72.4%)高于肝硬化组织(14.3%),P<0.01;Smad4在肝癌组织中的阳性表达率(37.9%)低于肝硬化组织(85.7%),P<0.01;TGF-β1在Ⅰ期(无转移)肝癌组织的阳性表达率(63.3%)高于Ⅱ、Ⅲ期(有转移)肝癌组织(22.2%),P<0.01。结论TGF-β1在肝癌中高表达,Smad4在肝癌中供低表达,二者与肝癌的发生发展密切相关。     

人A431皮肤鳞状细胞癌中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路对P53的调节作用

目的  观察丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号通路的活化及抑制对皮肤鳞状细胞癌（SCC）细胞增殖、凋亡情况的影响,探讨MAPK/ERK信号通路与抑癌基因P53在皮肤SCC中的相互作用机制。方法  培养人A431皮肤SCC细胞株,分为低、中、高浓度的MAPK/ERK通路抑制剂（PD98059+DMSO）组及激活剂（IGF+PBS）组、空白对照（DMSO）组。噻唑蓝法检测细胞体外增殖活力,流式细胞术（FCM）检测细胞的凋亡,Western blot检测各组A431细胞中P-ERK、P53蛋白表达。结果  经不同浓度的抑制术PD98059处理A431细胞,细胞增殖受到抑制,呈浓度-效应和时间-效应关系（P <0.05）;经不同浓度的激动剂胰岛素样生长因子（IGF）处理A431细胞,细胞增殖受到促进,呈浓度-效应和时间-效应关系（P < 0.05）。FCM检测结果显示,PD98059作用于A431细胞,细胞凋亡率明显增高,呈浓度-效应关系（P <0.05）;而IGF作用于A431细胞,细胞凋亡率明显降低,呈浓度-效应关系（P <0.05）。Western blot检测结果显示,PD98059处理A431细胞,P-ERK蛋白的表达降低,P53蛋白的表达增强,随着PD98059浓度的增加,P-ERK蛋白明显降低,P53蛋白明显增强（P <0.05）;而IGF处理A431细胞,P-ERK蛋白的表达增强,P53蛋白的表达降低,随着IGF浓度的增加,P-ERK蛋白明显增强,P53蛋白明显降低（P <0.05）;经过Pearson相关性分析,P53与P-ERK的表达呈负相关（P <0.05）。结论  人A431细胞中MAPK/ERK信号通路被IGF激活后,促凋亡因子P53表达降低,细胞增殖能力增强,凋亡能力降低;而该通路受抑制后,促凋亡因子P53表达增高,细胞增殖能力降低、凋亡能力增强。

     

依曲替酸诱导上皮鳞癌细胞凋亡及相关信号途径的改变

目的：研究依曲替酸诱导上皮鳞癌细胞凋亡及其分子机制。方法：用MTT法观察依曲替酸对A431细胞的生长影响，电镜观察细胞形态，流式细胞仪检测凋亡峰的出现，Annexin-V染色证实凋亡的发生。同时用逆转录PCR法观察，经依曲替酸作用不同的时间后，A431细胞中信号传导和转录激活因子3（STAT3）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p42／44丝裂原激活的蛋白激酶（p42／44MAPK）mRNA表达的改变；用蛋白印迹术，研究经依曲替酸作用不同的时间对A431细胞中磷酸化STAT3（p-STAT3）、CyclinD1蛋白表达的影响。结果：①随着依曲替酸作用时间的延长及剂量的增加，对A431细胞增殖的抑制作用增加。流式细胞仪检测显示，亚G1期凋亡峰明显增加，电镜观察和Annexin-V染色证实了凋亡的存在。②依曲替酸能明显抑制A431细胞中STAT3、CyclinD1 mRNA表达的改变，随着作用时间的延长，抑制作用增强，P〈0．05；并下调p-STAT3、CyclinD1蛋白的表达；下调p42／44MAPK mRNA的表达。③经依曲替酸作用后，A431细胞中CyclinD1 mRNA表达的下降与STAT3 mRNA表达的下降呈正相关，P〈0．05；p-STAT3、CyclinD1蛋白也同步下调，P〈0．05；而CyclinD1 mRNA表达的下降与p42／44MAPK mRNA的下调无相关性。结论：①依曲替酸具有抗上皮鳞癌细胞生长及诱导上皮鳞癌细胞凋亡作用。②依曲替酸抗上皮鳞癌细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的机制，可能主要是通过调节JAK／STAT3信号途径而实现的。     

雷公藤内酯醇对鳞癌A431细胞增殖凋亡及其COX-2和survivin表达的影响

目的 观察雷公藤内酯醇(TP)对皮肤鳞癌A431细胞株增殖与凋亡、环氧合酶-2(COX-2)和生存素(survivin)mRNA表达水平的影响,探讨TP抗皮肤肿瘤的作用机制.方法 以体外培养的人皮肤鳞癌A431细胞株为研究对象,MTT比色法测定不同浓度TP对A431细胞株增殖活性的影响,光镜观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测TP作用于A431细胞株后细胞周期的分布以及凋亡峰的出现.RT-PCR法检测TP对A431细胞株COX-2和survivin mRNA表达水平的影响.结果 随着TP剂量的增加及作用时间的延长,TP对A431细胞株增殖活性的抑制作用增强,TP能够诱导A431细胞株凋亡和改变细胞周期的分布,与对照组相比,G0/G1期细胞比例增多(P<0.05),S期细胞比例减少(P<0.05);另外,TP能抑制A431细胞COX-2和survivin mRNA的表达,不同浓度处理组两两相比,差异具有显著性(P<0.01).结论 TP通过诱导A431细胞凋亡、抑制A431细胞COX-2和survivin mRNA表达发挥抗皮肤肿瘤的作用.     

蜂毒肽通过线粒体凋亡途径促进皮肤鳞状细胞癌A431细胞株对5-FU的敏感性

目的探究蜂毒肽通过线粒体凋亡途径促进皮肤鳞状细胞癌A431细胞株对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性机制。方法筛选蜂毒肽作用于A431细胞株的半数抑制浓度(IC₅₀),并用于后续干预浓度。将A431细胞随机分为对照组(不干预)、蜂毒肽组(0.5 μmol/L蜂毒肽)、5-FU组(0.25 μmol/L 5-FU)和联合组(0.5 μmol/L蜂毒肽+0.25 μmol/L 5-FU)。检测各组A431细胞在24、48、72 h细胞活性、72 h细胞周期占比,以及细胞凋亡率及细胞线粒体凋亡蛋白(Smac)、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、细胞色素C(Cyt C)、促凋亡蛋白(Bax)的蛋白表达量。采用裸鼠荷瘤实验观察各组细胞的肿瘤生长抑制率。结果与对照组相比,不同时间点下蜂毒肽组、5-FU组、联合组的细胞存活率降低(P＜0.05);与蜂毒肽组和5-FU组相比,不同时间点下联合组的细胞存活率降低(P＜0.05)。与对照组比较,蜂毒肽组、5-FU组、联合组的细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例、Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表达增加(P＜0.05);与蜂毒肽组和5-FU组相比,联合组的细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例、Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表达增加(P＜0.05)。与对照组比较,蜂毒肽组、5-FU组、联合组的S期与G2/M期细胞比例降低(P＜0.05);与蜂毒肽组和5-FU组比较,联合组的S期与G2/M期细胞比例降低(P＜0.05)。与蜂毒肽组和5-FU组比较,联合组肿瘤生长第30天的肿瘤生长抑制率升高(P＜0.05)。结论蜂毒肽可增强人皮肤鳞状细胞癌A431细胞对5-FU的敏感性,蜂毒肽和5-FU联合使用可将A431细胞周期有效阻滞在G0/G1期,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,其机制可能与激活线粒体凋亡途径有关。     

雷公藤内酯醇对皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖与凋亡的影响

目的:探讨雷公藤内酯醇(triptolide,TP)对体外培养的人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖与凋亡的影响.方法:以体外培养的人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株为研究对象,MTT比色法测定TP对A431细胞株增殖活性的影响,光镜观察细胞形态学的改变,流式细胞仪检测TP作用于A431细胞株后细胞周期的分布及凋亡率的变化.结果:随着TP剂量的增加及作用时间的延长,TP对A431细胞株增殖活性的抑制作用增强,TP不但能够引起细胞形态的改变(漂浮细胞及核固缩现象增多),而且能够诱导A431细胞株凋亡,改变细胞周期的分布,与对照组相比G0/G1期细胞比例增多(P<0.05),S期细胞比例减少(P<0.05).结论:TP通过诱导A431细胞凋亡并抑制其增殖发挥抗肿瘤作用.     

新型维A酸CD437对表皮样癌A431细胞的致凋亡作用

目的 研究一种新合成的维A酸CD437及全反式维A酸(ATRA)对体外培养的人表皮样癌细胞系(A431)及正常人类表皮角质形成细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用.方法 MTT法测定CD437及ATRA对A431细胞系及正常人类表皮角质形成细胞的增殖抑制作用,光镜观察两种药物对细胞形态的影响,用流式细胞术研究两种药物对细胞凋亡及细胞周期的影响.结果 维A酸CD437较传统ATRA更显著抑制A431细胞系的生长,并具有时间、浓度依赖性;显微镜观察可见细胞有细胞毒性、凋亡特征性改变;CD437可促进A431细胞的快速凋亡及正常人类表皮角质形成细胞Gl期抑制;与CD437相比,ATRA对A431细胞的促凋亡作用相对无效;CD437不能诱导正常人类表皮角质形成细胞发生显著凋亡.结论 与传统维A酸ATRAS相比较,CD437更有效抑制表皮样癌细胞的增殖并显著诱导其凋亡:相对于正常表皮角质形成细胞,CD437对A431细胞具有选择性诱导凋亡作用,从而为临床治疗或预防皮肤癌提供实验依据.     

黄芩素抑制皮肤鳞癌细胞株A431增殖的体外研究

目的 研究黄芩素(BAI)对鳞状细胞癌A431细胞的增殖、集落形成及细胞周期的影响,探索BAI抗肿瘤的作用机制.方法 以体外培养的人表皮鳞癌A431细胞株为研究对象,MTT法观察BAI对A431细胞的生长抑制作用,光镜和电镜观察细胞形态,集落形成实验观察BAI对瘤细胞的生长抑制,流式细胞仪检测细胞周期中各期细胞比例和凋亡率.结果 MTT法显示,随着BAI作用时间延长及剂量增加对A431细胞增殖的抑制作用增强,有明显的时间和剂量依赖性,与对照组比较差异有显著性(P<0.01);光镜显示,随黄芩素浓度的增大细胞生长速度明显受到抑制,形态变圆;电镜显示,A431细胞伪足明显缩短,数量减少;流式细胞仪检测显示,随BAI浓度及作用时间的延长,细胞周期被明显阻断在S期,凋亡率增高,与对照组比较差异有显著性(P<0.05).结论 (1)BAI处理48h后,抑制A431细胞增殖而无细胞毒性的最适剂量范围为10～30μM;②BAI能明显地抑制皮肤鳞癌A431细胞增殖、细胞周期的进程、瘤细胞集落及伪足形成.