TNF-α和PGE2联合在人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达中的作用

目的:探讨不同浓度组合的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)在人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)及其饵受体骨保护素(OPG)mRNA表达中的作用。方法:将体外培养的人牙周膜成纤维细胞用不同浓度组合的TNF-α和PGE2处理24h,通过荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)来观察人牙周膜成纤维细胞RANKL、OPG mRNA表达水平。结果:不同浓度组合对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达有促进作用,尤以10ng/mL TNF-α 10-7mol/L PGE2组合对RANKL mRNA表达的促进作用及RANKL/OPG比值的增强作用最为明显。结论:10ng/mL TNF-α和10-7mol/L PGE2联合具有协同作用,通过促进人牙周膜成纤维细胞RNAKL/OPG表达量,可能在调节牙周炎引起的牙槽骨吸收中起到重要的作用。     

IL-1β对人牙周膜成纤维细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响

目的:以体外培养的人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)为研究对象,观察不同浓度的白细胞介素-1β(IL-1β)对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)中骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化剂配体(RANKL)mR-NA表达的影响。方法:组织块法体外原代培养HPDLF并鉴定,以第5代HPDLF作为实验靶细胞,分别用不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100 ng/mL)的IL-1β进行干预,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HPDLF中OPG、RANKL mRNA的表达。结果:IL-1β在0.01～10 ng/mL浓度范围内能明显上调HPDLF中OPG mRNA的表达(P<0.05),并在0.1 ng/mL时上调作用达到最大(P<0.05)。此后,随着IL-1β浓度的增加,OPG mRNA的表达量逐渐减少。IL-1β在0.01～100 ng/mL浓度范围内均可明显上调HPDLF中RANKL、RANKL/OPGmRNA的表达(P<0.05),且呈剂量依赖性,即随着IL-1β浓度增加,HPDLF中RANKL、RANKL/OPG mRNA的表达也逐渐增加,各浓度组两两比较除10 ng/mL与100 ng/mL相比无显著性差异外,其余各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:IL-1β可促进HPDLF中RANKL mRNA的表达,上调RANKL/OPG mRNA的比值。     

前列腺素E2对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达的影响

目的：探讨前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）对人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）mRNA表达的影响。方法：将体外培养的人牙周膜成纤维细胞用不同浓度（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol/L）的PGE2分别处理2、8、24、48h,使用Trizol抽提总RNA,通过半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来观察人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达强度变化。结果：10^-9～10^-6mol/LPGE2在2～24h可上调人牙周膜成纤维细胞RANKL mRNA的表达,但抑制OPGmRNA的表达,且RANKL/OPG比率呈上升趋势。结论：PGE2有可能通过调节人牙周膜成纤维细胞的RANKL/OPG mRNA表达比例,从而间接地调节破骨细胞的分化和活性。     

重组人白介素-1α对人牙周膜成纤维细胞表达RANKL和OPG影响的荧光定量RT-PCR研究

目的：通过观察重组人白介素-1α（rhIL-1α）对体外培养人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）核因子kB受体活化因子配基（RANKL）和骨保护素（OPG）表达的影响来探讨牙槽骨改建的调节机制。方法：以不同浓度rhIL-1α（0、5、10、20μg/L）作用于体外培养HPDLFs,于24 h后收集细胞,利用荧光定量RT-PCR技术检测RANKLmRNA和OPG mRNA的表达。结果：rhIL-1α同时上调HPDLFs表达RANKL mRNA和OPG mRNA,但RANKL/OPG的比值增加,这种调节作用在10μg/L的作用浓度时最明显。结论：rhIL-1α可在体外影响HP-DLFs表达RANKL mRNA和OPG mRNA,调节RANKL/OPG比值,与牙槽骨改建密切相关。     

IL-17对人牙周膜成纤维细胞RANKL表达的影响

目的 观察IL-17对人牙周膜成纤维细胞RANKL表达的影响,探讨IL-17调控牙周炎骨改建的可能致病机制。方法 用不同浓度（0、10、25、50 ng/mL）的IL-17处理人牙周膜成纤维细胞。选择最佳刺激浓度,用该浓度的IL-17处理细胞不同时间（0、12、24 h）。通过实时定量RT-PCR和Western-blot的方法检测细胞中骨吸收相关因子RANKL的表达水平。结果 IL-17可显著提高人牙周膜成纤维细胞RANKL的表达水平,并随着浓度的提高和刺激时间的延长而增加。结论 IL-17可上调人牙周膜成纤维细胞的RANKL表达,提示IL-17可通过调控人牙周膜成纤维细胞骨吸收相关因子的表达参与牙槽骨的改建。     

内毒素刺激对体外培养人牙龈成纤维细胞表达OPG和RANKL的影响

目的:检测内毒素(LPS)刺激后,体外培养人牙龈成纤维细胞(HGFs)表达骨保护素(OPG)和核因子-kB受体活化因子配体(RANKL)的变化,探讨其对牙槽骨吸收的影响.方法:组织块法培养正常HGFs并鉴定来源,以5 μg/ml LPS刺激第4 代细胞,在0、6、12、24、48 h各时间点用免疫细胞化学方法检测OPG...     

1，25（OH）2D3对培养人牙乳头细胞Calbindin—D28K表达和矿化能力的影响

目的：研究1,25（OH）2D3对培养人牙乳头细胞Calbindin-D28K（CaB）表达和矿化能力的影响。方法：用10^-8mol/L1,25(OH)2D3矿化液处理长期培养的第28天细胞24h,用放射免疫和免疫组化方法,观察CaB表达和碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（OC）的变化。同位素示踪方法观察1,25(OH)2D3对胞外基质^45Ca^2 的影响。结果：加入1,25(OH)2D3后ALP活性约为对照组的4倍;OC含量约为对照组的1.5倍。CaB在培养28d牙乳头细胞及其胞外基质中表达,而在培养14d牙乳头细胞中CaB免疫反应阴性。1,25(OH)2D3可加强CaB表达,并使胞外基质对^45Ca^2 摄取量增加1.5倍。结论：1,25（OH）2D3有促进人牙乳头细胞矿化作用,表现在不仅能刺激OC、ALP的活性,而且可刺激具有分化表型的牙乳头细胞中CaB的合成,增加基质对Ca^2 的摄取。证实促进牙乳头细胞的钙转导是CaB在矿化过程中的作用之一,推测CaB被“俘获”在基质中时有诱导Ca^2 聚集和直接贮存的作用。     

尼古丁对人牙周膜成纤维细胞中Fas/Apo-1（CD95）表达的影响

目的：研究尼古丁（nicotine）对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）中Fas/Apo-1（CD95）表达的影响。方法：采用组织块培养法培养原代人牙周膜成纤维细胞并传代取处于对数生长期的第6代细胞用于实验,采用浓度为2mg/L的尼古丁处理第6代牙周膜成纤维细胞72h,通过免疫组织化学染色法检测尼古丁对人牙周膜成纤维细胞中Fas表达的情况。结果：证实尼古丁作用于人牙周膜成纤维细胞后,胞膜中Fas/Apo-1（CD95）抗原呈阳性表达。结论：提示尼古丁可通过Fas系统这一途径导致人牙周膜成纤维细胞的凋亡,从而加重牙周组织破坏的程度和影响牙周组织的再生。     

静态牵张应变对人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的:探讨牵张应变对体外培养的人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响。方法:牵张应变量设为0%、8%、13%、18%、23%共5组,每组分别加载1 h8、h、16 h、24 h后收集细胞,免疫组化检测细胞中COX-2的表达,灰度分析并进行统计学处理。结果:8%~18%牵张应变范围,细胞内COX-2表达随着加载时间和应变量的增高而增强,23%应变量作用下COX-2表达降低,且与加载时间无关联。结论:在细胞的生理应变范围(8%、13%、18%)内,静态牵张应变促进人牙周膜成纤维细胞COX-2的表达,当牵张应变量超过生理应变范围(23%),则COX-2的表达量降低。     

Toll样受体4对人牙周膜成纤维细胞表达p-IRAK1和p-IκB-α的影响

目的：观察Toll样受体4（toll—likereceptors4,TLR4）对人牙周膜成纤维细胞（humanperiodontalligamentcells。HPDLCs）在内毒素脂多糖（1ipopolysaccharides,LPS）刺激下表达磷酸化IRAK1（phospho—IRAK1,P—IRAKl）和磷酸化IκB-α（phospho—IκB-α,p-IκB-α）的影响。方法：采用Western印迹和图像分析技术,检测HPDLCs受大肠杆菌LPS（1μg／m1）刺激2．5、5、10和15min后表达P—IRAK1和p—IκB-α的水平;同时检测1：100滴度的抗TLR4单克隆抗体对HPDLCs在1μg／mlLPS刺激下表达p-IRAK1和P—IκB-α的影响。采用SPSS10．0软件包对结果进行单因素方差分析。结果：LPS刺激HPDLCs5min后,HPDLCs表达p-IRAK1和P—IκB-α的水平最高．条带灰度与3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）条带的比值分别由0．054、0．19增加到0．785、0．809（P〈0．05）。抗TLR4单克隆抗体预处理的HPDLCs在LPS刺激下表达p-IRAK1和P—IκB-α的水平均降低,条带灰度与GAPDH条带的比值分别南0．82、0．874降低到0．099、0．201（P〈0．05）。结论：TLR4参与了HPDLCs受LPS刺激后的信号传导过程,可能介导了牙周病的发生和发展。     

Toll样受体4对人牙周膜成纤维细胞表达p-IRAK1和p-IкB-α的影响

目的:观察Toll样受体4(toll-like receptors 4,TLR4)对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligamentcells,HPDLCs)在内毒素脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激下表达磷酸化IRAK1(phospho-IRAK1,p-IRAK1)和磷酸化IкB-α(phospho-IкB-α,p-IкB-α)的影响。方法:采用Western印迹和图像分析技术,检测HPDLCs受大肠杆菌LPS(1μg/ml)刺激2.5、5、10和15min后表达p-IRAK1和p-IkB-α的水平;同时检测1∶100滴度的抗TLR4单克隆抗体对HPDLCs在1μg/mlLPS刺激下表达p-IRAK1和p-IкB-α的影响。采用SPSS10.0软件包对结果进行单因素方差分析。结果:LPS刺激HPDLCs 5min后,HPDLCs表达p-IRAK1和p-IкB-α的水平最高,条带灰度与3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)条带的比值分别由0.054、0.19增加到0.785、0.809(P<0.05)。抗TLR4单克隆抗体预处理的HPDLCs在LPS刺激下表达p-IRAK1和p-IкB-α的水平均降低,条带灰度与GAPDH条带的比值分别由0.82、0.874降低到0.099、0.201(P<0.05)。结论:TLR4参与了HPDLCs受LPS刺激后的信号传导过程,可能介导了牙周病的发生和发展。     

人牙乳头细胞分化过程中胞内Ca^2＋浓度变化和1，25（OH）2D3对Ca^2＋影响

目的：探讨人牙乳头细胞不同分化阶段和1,25（OH）2D3作用下细胞内Ca^2 的变化。方法：体外培养人牙乳头细胞,利用激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca^2 浓度的变化。结果：具有某些成牙本质细胞表型的细胞（21d)胞内Ca^2 浓度比无分化表型的细胞（14d)高约2倍;1,25（OH）2D3使21d组细胞胞内Ca^2 明显升高,而14d组则无明显变化。结论：人牙乳头细胞在分化过程中胞内Ca^2 浓度上调;1,25（OH）2D3能提高牙乳头细胞静息内Ca^2 水平以达新的Ca^2 稳态,促进牙乳头细胞分化。     

羧甲基壳聚糖对LPS干预人牙周膜成纤维细胞表达PGE2的影响

目的:观察脂多糖(LPS)干预下,不同浓度羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMC)对人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)表达前列腺素E2(PGE2)的影响. 方法:取冻存的人牙周膜成纤维细胞进行复苏培养,以浓度为10 mg/L的LPS进行诱导,用不同浓度的CMC进行干预,采用免疫组织化学方法检测PGE2在HPDLFs中的表达变化.结果:不同浓度CMC能够下调同一浓度LPS诱导的HPDLFs表达的PGE2,随CMC浓度的增加PGE2的表达量呈逐渐减弱趋势(P<0.05). 结论:CMC可能对LPS诱导的HPDLFs炎症损伤过程中表达PGE2有重要的抑制作用.     

机械压力对人牙周膜成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响

目的：探明机械压力与人牙周膜成纤维细胞转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1,TGF-β1）蛋白表达的关系。方法：本实验采用细胞加载装置,对人牙周膜成纤维细胞施加0kPa、250kPa、500kPa、1000kPa的压力,通过酶联免疫吸附实验,分别检测细胞受力后6h、12h、18h、24h时TGF-β1的含量。结果：加载250kPa组、500kPa组在细胞受力后各个时段TGF-β1含量没有变化;1000kPa组在细胞受力后的第12h,TGF-β1含量显著降低。结论：人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1受到机械压力的调控;在一定载荷作用下,TGF-β1的含量随着压力的增大而有所降低。     

压力作用时间对人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1的影响

目的:探讨压力作用不同时间对人牙周膜成纤维细胞表达TGF-β1的影响.方法:本实验采用细胞加载装置,对人牙周膜成纤维细胞施加1.0MPa的压力,分别持续1Omin、30min、50min、通过酶联免疫吸附实验,分别检测细胞受力后6h、12h、18h、24h时TGF-β1的含量.结果:加载1Omin组在细胞受力后的各个时段TGF-β1含量与对照组相比无显著性差异(P>0.05).加载30min组(0.51±0.06)和加载50min组(0.46±0.06)TGF-β1含量在细胞受力后的第12h同对照组(0.78±0.08)相比明显降低(P<0.05).结论:在一定加载时间内,人牙周膜成纤维细胞合成TGF-β1量随着压力作用时间的延长而有所降低.     

黄芩苷对牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞pro-MMP-1和MMP-3 表达的影响

目的　检测黄芩苷对白细胞介素 1β(IL 1β)诱导作用下人牙龈成纤维细胞 (HGF)分泌基质金属蛋白酶 1酶原 (pro MMP 1)的量和牙周膜细胞 (PDLCs)基质金属蛋白酶 3(MMP 3)表达的变化。方法　体外培养HGF和PDLCs,分别运用ELISA和免疫组化方法检测 pro MMP 1的量和MMP 3的表达。结果　与对照组的 (1 96 0± 0 176 ) μg/L相比 ,1μg/L的IL 1β能够显著促进HGF分泌 pro MMP 1(3 333± 0 12 3) μg/L ,且增加PDLCsMMP 3的表达 (P <0 0 0 1) ;加入黄芩苷后能降低HGF的pro MMP 1分泌量 ,其作用呈浓度 (10～ 10 0 0 μg/L)依赖性 ;黄芩苷对IL 1β诱导下PDLCs合成MMP 3的能力没有影响 ,但是能够抑制MMP 3的释放。结论　黄芩苷能够抑制由IL 1β介导的HGF分泌pro MMP 1和PDLCMMP 3的表达 ,提示黄芩苷可用于牙周病的防治。     

生理和药理浓度下1，25（OH）2D3对软骨细胞增殖、成熟和钙化的影响研究

目的　体外观察生理和不同药理浓度的1,25（OH）2D3对原发性股骨头软骨细胞（femoral chondrocytes,FCs）和继发性髁突软骨细胞（condylar chondrocytes,CCs）增殖、成熟和钙化的影响。方法　通过分离培养1周龄雌性SD仔鼠的FCs和CCs,体外分为6组：（1）空白对照组（不做处理）;（2）溶剂组（0.01%酒精处理）;（3）～（6）分别为0.1、1、10、100 nmol/L 1,25（OH）2D3处理组。各组按相应处理因素处理24 h后通过CCK8检测对2种软骨细胞增殖能力的影响,并对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、Ⅱ型胶原（collagenⅡ,COLⅡ）以及X型胶原（collagen X,COL X）进行 qRT-PCR和Western blot检测。结果　（1）CCK8检测结果显示,1,25（OH）2D3呈浓度依赖性抑制2种软骨细胞的增殖,且CCs的抑制率较FCs明显;PCNA的qRT-PCR和Western blot检测结果与之基本一致。（2）相对于空白对照组,体外生理浓度（0.1 nmol/L）的1,25（OH）2D3对2种软骨细胞COLⅡ的表达影响差异无统计学意义（P＞0.05）,药理浓度（1、10、100 nmol/L）的1,25（OH）2D3可上调2种软骨细胞COLⅡ的表达,其中FCs最佳浓度在10 nmol/L,而CCs呈浓度依赖性上升。（3）相对于空白对照组,1,25（OH）2D3对2种软骨细胞COL X的mRNA和蛋白水平表达均无统计学意义（P＞0.05）。结论　体外1,25（OH）2D3呈浓度依赖性抑制软骨细胞增殖,药理浓度的1,25（OH）2D3可促进软骨细胞成熟,且其对CCs的影响较FCs显著;而其对2种软骨细胞的钙化无影响。