模拟微重力对人牙髓干细胞细胞骨架及迁移能力影响的研究

目的:初步研究模拟微重力(simulated microgravity,SMG)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)细胞骨架及迁移能力影响的信号通路机制。方法:采用酶消化法分离培养hDPSCs,并将其接种于PLGA支架上进行模拟微重力培养及普通重力培养。72 h后收集细胞,行Realtime-PCR检测LARG(leukemia-associated Rho GEF factor)基因的mRNA相对定量表达;拖拽实验检测RhoA-GTP表达情况;western blot检测RhoA及下游信号分子LIMK-P蛋白表达情况。结果:模拟微重力下培养的hDPSCs细胞LARG基因的mRNA表达下调(P<0.05);微重力下RhoA-GTP、RhoA及LIMK-P蛋白表达均较对照组下调(P<0.05)。结论:模拟微重力下人牙髓干细胞细胞骨架的重排,细胞迁移能力的改变可能与RhoA/ROCK信号通路有关。     

模拟微重力环境对人牙髓干细胞体外增殖能力的影响

目的：研究模拟微重力环境对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）在PLGA支架上体外增殖能力的影响。方法：将分离、鉴定后的人牙髓干细胞接种在PLGA支架上,采用MTT法检测普通环境和模拟微重力环境中培养24、48、72h的人牙髓干细胞在PLGA支架上的细胞活性。DAPI荧光染色和流式细胞术比较牙髓干细胞在两种环境培养3d的细胞数量以及细胞周期分布情况。结果：MTT显示模拟微重力组中各时间点的A值均高于普通环境培养组;DAPI荧光染色显示在模拟微重力下培养3d的人牙髓干细胞数量明显多于普通环境培养组;细胞周期分析结果表明模拟微重力组中S期细胞比例明显高于普通环境培养组（P〈0.05）。结论：接种在PLGA支架上的人牙髓干细胞在模拟微重力环境下较普通环境具有更高的体外增殖能力。     

模拟微重力对人牙髓干细胞-PLGA复合物矿化的影响

目的:研究模拟微重力(SMG)对人牙髓干细胞(hDPSCs)在聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上矿化的影响。方法:采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,并进行鉴定。hDPSCs常规接种于PLGA支架,24h后,模拟微重力环境和普通环境下分别矿化诱导。矿化诱导第3、5、7、10、14天时进行碱性磷酸酶活性检测,第21天时进行茜素红染色以观察人牙髓干细胞在PLGA支架上矿化结节形成情况。结果:模拟微重力环境下的碱性磷酸酶活性明显低于普通环境(P<0.01),茜素红染色显示模拟微重力环境下形成的矿化结节较普通环境下的小且数量少。结论:模拟微重力环境抑制hDPSCs在PLGA支架上的矿化。     

模拟微重力影响人牙髓干细胞的矿化能力与RhoA-Rho激酶信号通路相关性研究

目的初步研究Rho A-Rho激酶信号通路在模拟微重力(Simulated Microgravity,SMG)影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)矿化过程中的作用。方法将经酶消化法分离、纯化后的人牙髓干细胞体外扩增培养,以1×106细胞接种于PLGA支架上,分别于模拟微重力下及普通重力下矿化诱导液中培养,72 h后收集细胞,采用Western Blot检测Rho A蛋白表达;此外,在重力条件下采用Rho激酶抑制剂Y-27632,以矿化诱导液培养组作为对照组,检测矿化诱导3、5、7、10d两组碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)活性变化,采用Western Blot检测矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白牙本质基质蛋白(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达,采用茜素红染色法检测矿化诱导21 d,矿化结节形成水平。结果模拟微重力下,人牙髓干细胞中Rho A蛋白的表达下调;在普通重力矿化诱导条件下,加入抑制剂Y-27632后,各时间点细胞AKP表达水平均较对照组有所降低;矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白DSP、DSPP、DMP-1表达明显下调,矿化诱导21 d,矿化结节形成同样有所减少。结论模拟微重力下,Rho A蛋白表达水平下调;抑制Rho激酶的表达,可降低h DPSCs矿化能力,提示Rho A-Rho激酶信号通路可能参与模拟微重力对h DPSCs矿化能力的影响。     

Satb2过表达对牙髓干细胞增殖和迁移能力的影响

目的:通过慢病毒介导Satb2(special AT-rich binding protein 2,Satb2)感染人牙髓干细胞(human Dental pulp stem cells,hDPSCs),观察Satb2过表达对人牙髓干细胞迁移和增殖能力的影响。方法:构建Satb2过表达慢病毒感染人牙髓干细胞,通过筛选得到稳定过表达Satb2细胞克隆。CCK8实验检测过表达Satb2对人牙髓干细胞的增殖能力的影响。划痕实验和Transwell细胞迁移实验观察细胞迁移能力的变化。免疫荧光染色观察细胞骨架微管的变化。结果:过表达Satb2的人牙髓干细胞相比对照组增殖能力增强(P＜0.05),微管更粗大,细胞的迁移能力增强。结论:过表达Satb2能使人牙髓干细胞的增殖和迁移能力增强。     

模拟微重力对人牙髓干细胞在裸鼠体内矿化能力的影响

目的:研究模拟微重力环境对聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架上的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)在裸鼠体内矿化能力的影响。方法:分离、培养hDPSCs并进行鉴定,然后将hDPSCs接种到PLGA支架上培养72 h后随机分为两组,普通重力组和模拟微重力组,经矿化诱导液培养1周后分别将细胞支架复合物移植到裸鼠体内,植入术后4周取材,进行组织学(HE和Vonkossa)和免疫组织化学(DSPP)检测。结果:HE染色均可见有血管生成,Vonkossa染色均为阳性,模拟微重力组DSPP的表达水平明显高于普通重力组(P<0.05)。结论:模拟微重力有利于hDPSCs在裸鼠体内的矿化。     

转化生长因子β1对人牙髓细胞微丝骨架的重组作用

目的:了解转化生长因子β1(TGF-β1)对人牙髓细胞微丝和微管骨架的作用。方法:I型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞,以20ng/ml的TGF-β1处理细胞,分别在第30min、1、6和24h收集细胞爬片,BODYPY-Phalloidin对微丝作直接荧光染色、Rhodamine RedTM对微管蛋白α(tubulin-α)作间接免疫荧光染色,采用激光扫描共聚焦显微镜观察TGF-β1作用于牙髓细胞后不同时间点微丝和微管的变化情况。结果:TGF-β1作用于人牙髓细胞后,微丝出现解聚重组现象,在30min时间点,肌动蛋白(actin)在细胞膜下聚合成纤维形肌动蛋白F-actin,同时胞质内的F-actin解聚,6h解聚最明显,24h后可见胞质内微丝重组。观察的各时间点,微管结构未见明显解聚重组现象。结论:TGF-β1能够使牙髓细胞微丝骨架重组。     

模拟微重力环境对人牙髓干细胞体内增殖能力的影响

目的：研究模拟微重力环境对聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架上人牙髓干细胞（hDPSCs）体内增殖能力的影响。方法：分离、培养hDPSCs并进行鉴定。以PLGA作为支架材料培养人牙髓干细胞,将hDPSCs-PLGA复合物分别在模拟微重力环境和普通重力环境下培养72h,然后移植到裸鼠背部皮下。植入4周后取出组织块,分别进行HE染色、Masson染色、Ki67和I型胶原免疫组化检测。结果：模拟微重力环境下细胞密度、胶原生成量、I型胶原表达量和Ki67阳性细胞数量明显高于普通环境（P〈0.01）。结论：模拟微重力环境培养的hDPSCs的体内增殖能力高于普通重力组。     

Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞增殖能力的影响

目的: 初步研究Rho激酶抑制剂Y-27632对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖能力的影响。方法: 采用体外贴壁式培养法培养人牙髓干细胞,应用Rho激酶抑制剂Y-27632,根据培养条件,分为普通培养液培养组(Con)及普通培养液+抑制剂Y-27632培养组(Con+Y),采用MTT法检测两种培养条件下人牙髓干细胞培养24、48、72、96 h细胞活性;采用DAPI染色法及流式细胞定量检测技术(FCM)比较两组在培养48 h的细胞数量及细胞周期分布情况。结果: MTT结果显示,实验组hDPSCs细胞增殖曲线较对照组明显上移,且增殖高峰期提前;培养48 h,DAPI染色结果显示,实验组细胞总数量明显多于对照组;FCM结果显示,对照组G₀/G₁期细胞比例为(66.8±6.84)%,S期细胞比例为(25.17±0.62)%,实验组G0/G1期细胞比例为(58.59±1.76)%,S期细胞比例为(31.34±1.16)%,实验组S期细胞比例明显高于对照组(P<0.05)。 结论: Rho激酶抑制剂Y-27632促进人牙髓干细胞DNA合成、细胞分裂及增殖。     

人牙髓干细胞在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物支架上粘附与增殖的研究

采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,免疫组化法及体外诱导分化对细胞进行鉴定。将人牙髓干细胞与PLGA支架材料进行复合培养,扫描电镜(SEM)观察支架材料形态,细胞粘附、增殖及基质分泌情况;细胞计数检测其增殖力。结果:细胞接种2、5、10d,扫描电镜及细胞计数均显示HDPSCs与PLGA支架材料粘附紧密,生长状态良好,细胞明显增殖(P<0.05),有丰富的细胞外基质形成。结论:PLGA是一种适宜人牙髓干细胞粘附与增殖的支架材料。     

微重力环境下Smads信号通路对人牙周膜干细胞成骨向分化的影响

目的:了解Smads信号通路在模拟微重力条件下对人牙周膜细胞成骨向分化的影响。方法:自手术拔除的人牙周膜中培养获得牙周膜细胞,利用有限稀释法培养获得人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)。采用旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)建立模拟微重力环境,将细胞分为对照组(正常重力组)、模拟微重力组,应用实时定量PCR检测Smads信号分子表达及加入Smads抑制剂后成骨标志物的表达,流式细胞仪检测磷酸化Smad表达。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学处理。结果:与对照组相比,模拟微重力组Smads 2、3、4 mRNA表达量显著增加,呈时间依赖性,在2h达到峰值,随后开始下降。Smads7在2h时开始上升,观测时间内未捕捉到其下降。流式细胞检测发现,p-Smads在30min时开始出现高表达(29.39%),2h时达到峰值,表达量为91.32%。加入Smads抑制剂后,p-Smads表达下降至5.3%,成骨标志物COL1、ALP、OCN表达显著下降(P<0.05)。结论:模拟微重力环境下,Smads信号通路参与了hPDLSCs成骨向分化。     

整合素α6对模拟微重力下人牙髓干细胞粘附能力的影响

目的:探究整合素α6对模拟微重力下人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)粘附能力的影响。方法:以PLGA支架为载体,将采用酶消化法培养的hDPSCs接种在PLGA支架上,分普通重力组和模拟微重力组培养72 h,Western blot检测整合素α6(Integrin α6)、整合素αv(Integrin αv)、整合素β1(Integrin β1)、粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、磷酸化粘着斑激酶(phospho-FAK)的达;si-RNA转染hDPSCs,抑制整合素α6表达,DAPI荧光染色检测转染后hDPSCs在PLGA支架上的粘附数量,Western blot检测转染后hDPSCs中整合素β1、FAK、phospho-FAK的表达。结果:模拟微重力下, 整合素α6、phospho-FAK蛋白水平上调(P＜0.05),整合素αv、整合素β1和FAK的蛋白水平未见显著性差异;si-RNA转染的hDPSCs粘附能力、phospho-FAK蛋白水平均低于对照组(P＜0.05),整合素β1和FAK的蛋白水平未见显著性差异。结论:模拟微重力下,hDPSCs在PLGA支架上粘附能力增强可能与整合素α6及其下游信号分子FAK的表达水平上调相关。     

模拟微重力对人牙髓干细胞在PLGA支架上黏附影响的研究

目的：研究模拟微重力（SMG）对人牙髓干细胞（hDPSCs）在聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架上黏附的影响。方法：采用酶消化法培养hDPSCs,并进行鉴定。将hDPSCs在模拟微重力条件接种于PLGA支架,接种细胞数分别为0.2×106、0.4×106、0.8×106、1.2×106个/支架,以常规条件接种作为对照组。接种24h后通过细胞计数检测细胞粘附率;扫描电镜（SEM）观察细胞形态。结果：模拟微重力条件接种组随接种细胞数的增多,黏附率显著升高（P〈0.01）,常规条件接种组黏附率略有降低（P〈0.05）;当接种细胞数为0.4×106、0.8×106、1.2×106/支架时,实验组高于对照组（P〈0.05或P〈0.01）;为0.2×106/支架时,对照组高于实验组（P〈0.01）。SEM显示模拟微重力条件接种组的细胞具有丰富的表面微绒毛。结论：模拟微重力条件下hDPSCs在PLGA支架上的黏附率高于常规条件。     

牙髓培养细胞特性与牙髓干细胞定位

目的 比较人牙根髓与冠髓培养细胞的特性，探讨牙髓干细胞在牙髓中的定位。方法：用组织块法分别培养人根髓、冠髓细胞，观察并比较两者的培养成功率、细胞贴壁率、细胞活性、增殖特性、细胞形态以及细胞诱导矿化能力，以探讨牙髓干细胞在牙髓组织中的定位。结果：培养的根髓细胞比冠髓细胞具有较高的成功率和贴壁率、较强的细胞活性以及相同的增殖活性，根髓细胞比冠髓细胞的形态更具有原始性，根髓比冠髓更易诱导矿化。结论：牙髓干细胞可能存在于全部牙髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度．     

人牙髓细胞原代培养方法的比较研究

目的：比较不间的人牙髓细胞原代培养方法，优化培养条件，提高培养成功率。方法：分别采用组织块法、酶消化法、组织块酶消化法进行人牙髓细胞原代培养。结果：组织块酶消化法中组织块解离、贴附和细胞游出状况均优于单纯组织块法或单纯酶消化法，成功率较高。结论：采用组织块酶消化法可提高人牙髓细胞原代培养的成功率。