牙龈卟啉单胞菌感染对人脐静脉内皮细胞表达IL-8影响的研究

目的 研究牙龈卟啉单胞菌(porphyrmonas gingivalis,P.g)感染时人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcell,HUVEC)表达趋化因子白介素-8(interleukin-8,IL-8)的变化,了解P.g对其趋化功能的影响。方法 建立P.g侵入HUVEC的体外模型,采用酶联免疫吸附法(ELISA)研究P.g381和P.g33277菌株感染HUVEC 6、24 h后的培养上清液中IL-8的浓度。结果 ELISA结果显示当P.g381感染HUVEC 6、24 h和P.g33277感染HUVEC 6、24 h时,HUVEC分泌IL-8的水平明显升高(P<0.01);感染24 h时P.g381促进HUVEC表达IL-8的水平高于P.g33277(P<0.01)。结论 P.g侵入HUVEC后可促进其表达IL-8,从而上调其趋化功能,可能与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展相关。     

牙龈卟啉单胞菌感染对血管内皮细胞与单核细胞黏附的影响

目的：研究Pg感染对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与单核细胞黏附的影响。方法：建立Pg感染HUVEC细胞株EA．hy926的体外模型,虎红染色法观察Pg381和Pg33277菌株感染HUVEC 6 h和24 h后,HUVEC与人单核细胞株THP-1细胞黏附量的变化。结果：培养6 h时Pg381感染组的THP-1细胞黏附量相对值为0．210±0．025,高于Pg33277感染组（0．078±0．024,P＜0．05）和空白对照组（0．062±0．022,P＜0．05）,Pg33277感染组和空白对照组无差异。24 h时3组间无差异（P＞0．05）。结论：Pg381感染HUVEC后能显著促进其与单核细胞的黏附。     

牙龈卟啉单胞菌感染对血管内皮细胞LOX-1 mRNA表达的影响

目的研究牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）感染对血管内皮细胞（vein endothelial cell,VEC）血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1）mRNA表达的影响。方法建立P.g感染VEC的体外模型,采用Real Time-PCR技术检测P.g381菌株感染人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）细胞株EA.hy926不同时间后,LOX-1 mRNA表达的变化。结果 P.g381侵入HUVEC促进LOX-1 mRNA的表达,与对照组相比较（△Ct值为3.78±0.16）,2 h时开始升高（△Ct值为3.60±0.33,P=0.240）,8 h达高峰（△Ct值为2.72±0.35,P=0.000）,12 h后显著回落（△Ct值为3.22±0.17,P=0.001）,至24 h时恢复至最初水平（△Ct值为3.65±0.24,P=0.390）。结论 P.g感染促进HUVEC表达LOX-1 mRNA。     

牙龈卟啉单胞菌侵入对血管内皮细胞E选择素表达的影响

目的：观察牙龈卟啉单胞菌（P.g）ATCC33277和W83侵入对血管内皮细胞E选择素转录和翻译的影响。方法：建立体外P.g侵入血管内皮细胞模型,反转录-聚合酶链式反应检测E选择素基因表达;蛋白质印迹技术检测E选择素膜蛋白表达的变化;采用SAS8.12软件包,多组均数之间的比较采用重复测量资料的方差分析,P〈0.05为差异有统计学意义。结果：P.gATCC33277和W83侵入后4h即上调E选择素基因表达（P〈0.05）,8h显著回落（P〈0.05）,24h恢复至基线水平;E选择素基因在P.gATCC33277/W83侵入后4h、8h、24h和TNFα处理0.5h后的相对表达水平分别为对照组的294.0%/326.4%、179.3%/224.6%、126.7%/128.3%和365.5%。P.g侵入后4h即诱导E选择素蛋白表达（P〈0.05）,8h达高峰（P〈0.05）,24h有持续高表达（P〈0.05）;E选择素蛋白相对表达水平分别为对照组的295.4%/343.6%、386.3%/394.3%、238.7%/296.4%和413.8%。P.gW83诱导血管内皮细胞E选择素表达的能力强于ATCC33277（P〈0.05）。结论：P.g侵入可造成血管内皮细胞E选择素高表达的动脉粥样硬化样改变,在动脉粥样硬化炎症病理反应中有重要意义。     

miR-146a在人牙髓细胞中的表达及其作用研究

目的 检测miR-146a在正常及脂多糖（LPS）刺激的人牙髓细胞（hDPC）中的表达,探讨miR-146a对hDPC分泌炎性因子的影响及其机制.方法 （1）实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法测定正常及LPS刺激的hDPC miR-146a的表达水平.（2） Lipofectamine 2000脂质体分别转染化学合成的miR-146a类似物（miR-146a mimics）、miR-146a抑制剂（miR-146a inhibitor）及其相应无关序列小RNA对照,转染24 h后1μg/ml LPS刺激hDPC,4h后实时荧光定量PCR检测白细胞介素6（IL-6）、IL-8 mRNA的表达,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清IL-6、IL-8的分泌;Western blot 法检测miR-146a下游靶标白细胞介素1受体相关激酶1（IRAK1）及肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达水平.两组比较采用独立样本t检验,多组比较采用方差分析.结果 （1）经LPS刺激的hDPC miR-146a表达水平高于正常hDPC（12 h：t=8.488,P=0.014;24 h：t=39.661,P＜0.001）.（2）转染miR-146a mimics的hDPC在1μg/mlLPS刺激下产生炎性因子IL-6、IL-8的水平低于阴性对照,差异有统计学意义（IL-6 PCR：P＜0.001,IL-6 ELISA：P＜0.001;IL-8 PCR：P＜0.001,IL-8ELISA：P=0.011）;过表达miR-146a后IRAK1及TRAF6蛋白水平明显下调（IRAK1：P=0.002; TRAF6：P＜ 0.001）.结论 miR-146a在LPS刺激的hDPC中表达上调,转染miR-146a可下调其靶基因IRAK1及TRAF6表达并降低IL-6、IL-8分泌,推测miR-146a参与牙hDPC的炎症反应调控.     

四种牙周致病菌侵入血管内皮细胞能力的体外研究

目的 研究和比较4种常见牙周致病菌Pg33277、Pi25611、Aa29522和Fn10953黏附和侵入人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的能力,为深入探讨牙周致病菌感染HUVEC在促进动脉粥样硬化发生、发展中的作用奠定初步基础.方法 建立牙周致病菌感染HUVEC的体外模型,采用扫描电镜、抗生素保护-菌落计数法观察以上牙周致病菌黏附和侵入HUVEC的能力.结果扫描电镜结果表明Pg33277、Pi25611、Aa29522和Fn10953均可黏附于HUVEC;抗生素保护法结果发现Pg33277、Pi25611、Aa29522和Fn10953均可侵入HUVEC,细菌侵入量分别为(0.8±0.1)×10~8、(4.1±0.5)×10~6、(1.6±0.3)×10~6、(5.0±0.4)×10~6CFU/L,侵入率分别为(0.400±0.050)%、(0.021±0.003)%、(0.008±0.002)%和(0.025±0.002)%,Pg33277侵入能力远较其他3种牙周致病菌强(P＜0.001),其余3种牙周致病菌间的侵入能力差异无统计学意义(P＞0.05).结论 4种常见牙周致病菌Pg33277、Pi25611、Aa29522和Fn10953均可黏附和侵入HUVEC,Pg33277侵入能力最强,这可能为其进一步发挥相关的生物学作用奠定基础.     

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目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)W83、ATCC33277刺激人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)分泌基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的变化.方法 本研究于2010年9月至2011年6月在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行.将P.gingivalis W83、ATCC33277作用于HPDLFs0、6、12、24、48h后,运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中MMP-1、TIMP-1质量浓度变化,并计算MMP-1/TIMP-1值.结果 P.gingivalis感染HPDLFs的MMP-1和TIMP-1表达均增强,并呈时间依赖性;且MMP-1/TIMP-1值明显高于未感染的对照组(P＜0.05).P.gingivalis W83感染后MMP-1/TIMP-1值明显高于P.gingivalis ATCC33277(P＜ 0.05).结论 P.gingivalis具有促进HPDLFs分泌MMP-1、TIMP-1的作用,且可造成牙周组织破坏;P.gingivalis W83降解细胞外基质的能力高于P.gingivalisATCC33277.     

两种fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激下口腔上皮细胞ICAM-1的表达

目的比较2种fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P．gingivalis）刺激下口腔上皮细胞ICAM-1的表达水平。方法实验组用P．gingivalis ATCC 33277（Ⅰ型菌毛组）,W83（Ⅳ型菌毛组）,47A-1（Ⅳ型菌毛组）分别与KB细胞（ATCC CCL17）共同孵育24h;对照组为未受P.gingivalis刺激的KB细胞。分别在1h、3h、6h和24h收集细胞,运用流式细胞仪检测KB细胞膜上ICAM-1的动态表达。结果P．gingivalis刺激细胞后3h、6h和24h,实验组ICAM-1的表达水平均高于对照组;2种fimA基因型P．gingivalis调节KB细胞表达ICAM-1的方式相似,Ⅳ型菌毛组的调节作用强于Ⅰ型菌毛组。结论P.gingivalis上调口腔上皮细胞表达ICAM-1的水平与其fimA基因型相关,提示P.gingivalis致病性与其fimA基因型相关。     

牙髓卟啉单胞菌脂多糖对小鼠成骨细胞表达MCP-1的影响

目的: 探讨牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.endodontalis)脂多糖对小鼠成骨细胞表达单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)mRNA和蛋白的影响,以及是否有p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路和核因子κB（Nuclear Factor-κB, NF-κB）信号通路的参与。方法: 以不同质量浓度的P.endodontalis脂多糖(0~50 mg/L)刺激MC3T3-E1细胞24 h;以20 mg/L P.endodontalis脂多糖作用于细胞不同时间（0~48 h）后,采用实时反转录PCR和酶联免疫吸附测定检测MCP-1mRNA和蛋白的表达。采用p38MAPK抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂BAY11-7082分别预处理细胞1 h,检测其对P.endodontalis脂多糖刺激MC3T3-E1细胞后MCP-1mRNA表达的影响。采用SPSS 13.0软件包对结果进行单因素方差分析和Dunnett t检验。结果: 不同质量浓度的P.endodontalis脂多糖（0~50 mg/L）刺激MC3T3-E1细胞后,MCP-1的mRNA表达和蛋白分泌呈剂量依赖性;观察时间内（0~48 h）,20 mg/L P.endodontalis脂多糖作用于MC3T3-E1细胞后,MCP-1 mRNA的表达和蛋白分泌呈时间依赖性;10 mol/L的SB203580和BAY11-7082分别预处理细胞1 h,可以降低P.endodontalis脂多糖诱导MCP-1 mRNA的表达,且SB203580的抑制作用强于BAY11-7082。结论: P.endodontalis脂多糖可能通过激活p38MAPK和NF-κB信号通路诱导成骨细胞表达MCP-1mRNA和蛋白。     

牙龈卟啉单胞菌GroEL对人脐静脉内皮细胞影响的研究

目的:探究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)的代谢产物GroEL对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖活性、凋亡及炎症反应的影响,以期为探讨P.g致心血管疾病的发病机制提供理论依据。方法:用不同浓度的P.g GroEL(2、4、6、8、10μg/mL)处理HUVEC 24 h,观察处理前后细胞形态的变化。通过CCK-8法检测HUVEC的增殖活性,流式细胞学检测细胞凋亡,RT-qPCR和ELISA法分别检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)、E-选择素(E-selectin)的表达。结果:P.g GroEL处理HUVEC 24 h后,显著降低了细胞活力并增加了细胞凋亡率(P<0.05),且随着P.g GroEL浓度的增加,对细胞活性的抑制作用和细胞凋亡数量也逐渐增加。P.g GroEL还显著刺激了HUVEC分泌IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin(P<0.05)。结论:P.g GroEL以浓度依赖性方式抑...     

Strain-dependent activation of the mouse immune response is correlated with Porphyromonas gingivalis-induced experimental periodontitis

Aims: To evaluate the effect of oral infection with three Porphyromonas gingivalis strains on alveolar bone loss (ABL) and its correlation with the mouse immune response.
Materials and Methods: Mice were orally infected with P. gingivalis strains 381, 33277 and 53977. After 42 days, maxillae were analysed for ABL using micro-computed tomography and the serum for anti- P.gingivalis IgG1 and IgG2a levels. The cytokine response to P. gingivalis was tested using the subcutaneous chamber model.
Results: The P. gingivalis 53977-infected group showed the highest ABL, which was significantly different from all other groups ( p <0.001). In addition, the humoral response to P. gingivalis 53977 was significantly lower than the response to P. gingivalis 381 and 33277 ( p 0.01). The IgG2a/IgG1 ratio was higher in the P. gingivalis 33277-infected group (1.6) compared with the P. gingivalis 381-infected group (0.51). Four days post-infection, interleukin (IL)-1 β levels remained significantly higher in the P. gingivalis 53977-infected group only (1198.2±260.0, p <0.05), while IL-4 levels remained significantly higher in the P. gingivalis 381-infected group (265.8±131.6, p <0.05).
Conclusions: The high levels of ABL induced by P. gingivalis 53977 were inversely correlated with the humoral response to this bacterium. In addition, ABL was correlated with an elevated pro-inflammatory response.     

低浓度牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激骨唾液酸蛋白的基因表达和转录

目的研究低浓度牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）对成骨细胞系（ROS17/2.8）中骨唾液酸蛋白（Bonesialoprotein,BSP）基因表达和转录的调节作用,以及细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1/2）转导途径阻断剂（U0126）对此调节作用的影响。方法0.01mg/LP.g·LPS作用ROS17/2.8细胞0h、3h、6h和12h后,用Northern杂交观察BSP和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）mRNA的表达;再将ROS17/2.8细胞随机分为四组：空白对照组、LPS（0.01mg/LP.g·LPS）组、U0126（5μmol/L）组、U0126＋LPS组（U0126预刺激细胞30min后,U0126与P.g·LPS共同作用）,各组持续作用12h后,用瞬时转染法分析BSP基因启动子的转录活性。结果0.01mg/LP.g·LPS作用ROS17/2.8细胞12小时后BSP和OPN的mRNA杂交条带增强;0.01mg/LP.g·LPS使BSP基因启动子（pLUC3）转录活性值与空白载体活性值的比值升高1.582（F=5.734,P〈0.05）,U0126使其降低2.693（F=11.500,P〈0.01）,U0126使LPS对比值的升高变化降低2.242（F=6.204,P〈0.05）。结论低浓度（0.01mg/L）P.g·LPS增强ROS17/2.8细胞BSP基因表达和转录,而且其对BSP基因转录活性的上调作用是经由ERK1/2信号转导路径介导的。     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激上皮细胞表达细胞因子的比较

目的比较不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）刺激下口腔上皮细胞表达细胞因子的水平。方法P.gingivalis ATCC33277（IfimA）,W83（ⅣfimA）,47A-1（ⅣfimA）分别与KB细胞ATCCCCL17共同孵育6h,在3h和6h收集细胞和培养上清液。逆转录-聚合酶链式反应检测KB细胞IL-8,IL-6,IL-1βmRNA的表达,酶联免疫反应检测培养上清液中IL-8,IL-6,IL-1β的变化。结果3h时,ⅣfimA组IL-6蛋白水平低于IfimA组（P〈0.05）,6h时,ⅣfimA组IL-6和IL-8蛋白水平均低于ⅠfimA组（P〈0.05）;IL-8,IL-6mRNA和蛋白水平表达不一致,提示存在转录后水平的调节。3h,6h时,IL-1β对P.gingvalis刺激不敏感,mRNA和蛋白表达水平都很低。结论P.gingivalis fimA基因型与上皮细胞表达细胞因子的水平相关,提示P.gingivalis致病性与其fimA基因型相关。     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激口腔上皮细胞白细胞介素-8的表达

目的比较不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）刺激下口腔上皮细胞白细胞介素-8（IL-8）的表达水平,初步探讨P.gingivalis致病性与其fimA基因型的关系。方法P.gingivalis ATCC 33277（Ⅰ型fimA）、W83、47A-1（Ⅳ型fimA）和KB细胞ATCC CCL-17共同孵育24 h,以未受刺激的KB细胞作为对照组,分别在1、3、6、24 h收集细胞和培养上清液。RT-PCR检测KB细胞IL-8 mRNA的动态表达,酶联免疫反应检测培养上清液中IL-8的动态变化。结果2种fimA基因型菌株刺激1 h,KB细胞IL-8 mRNA的表达上调至峰值,高于对照组,3~24 h IL-8 mRNA的表达水平接近对照组;P.gingivalis感染细胞后3~24 h,上清液中的IL-8水平低于对照组,Ⅳ型菌株低于Ⅰ型菌株;IL-8 mRNA及其蛋白表达不完全一致,提示IL-8的表达存在转录后水平的调节。结论fimA基因型与口腔上皮细胞IL-8的表达水平相关,提示P.gingivalis致病性与其fimA基因型相关。     

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目的研究盐酸米诺环素对脂多糖（LPS）作用下人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）的白细胞介素-6（IL-6）mRNA表达的影响。方法本研究于2011年10月至2012年2月在井冈山大学医学院重点实验室进行。培养HPDLF并分为以下5组：对照组（未加药）、高剂量组（0．01g／LLPS＋0．2班盐酸米诺环素）、低剂量组（0．0lg／LLPS＋0．05g/L盐酸米诺环素）、中剂量组（0．01g／LLPS＋0．1g／L盐酸米诺环素）、模型组（0．0lg／LLPS）,每组均复种3孔。实时荧光定量PCR检测各组HPDLF中的IL-6mRNA表达情况。结果对照组、高剂量组、低剂量组、中剂量组、模型组的IL-6mRNA相对表达量分别为：0．61±0．08、0．62±0．10、0．88±0．17、0．49±0．21、1．88±0．07。模型组IL-6mRNA的相对表达量高于对照组、高剂量组、低剂量组、中剂量组,且差异有统计学意义（P〈0．01）。对照组及低、中、高剂量组的IL-6mRNA相对表达量两两比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论盐酸米诺环素能够降低LPS作用下HPDLF中的IL-6mRNA的表达,这可能是盐酸米诺环素治疗牙周炙的作用机制之一。     

两种基因型牙龈卟啉单胞菌对上皮细胞的影响

目的 比较2种fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)刺激下口腔上皮细胞白介素-6( Interlukin-6,IL-6)的表达.方法 以未受P.g刺激的上皮细胞作为对照组,实验组用P.g ATCC 33277(I型菌毛组)和W83、47A-1(Ⅳ型菌毛组)分别与口腔上...     

低氧对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响

目的 研究低氧对人牙周膜细胞（PDLC）的碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因表达的影响.方法 采用组织块法体外分离培养人PDLC;取第3 ～ 5 代细胞分别在常氧和低氧条件下培养后检测其ALP 活性;并通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）观察低氧处理后人PDLC 中成骨相关基因的表达变化.结果 低氧12、24、36、48 h 组ALP 活性均比常氧组高;其中低氧48 h 组与常氧组相比明显升高,差异有统计学意义（P ＜ 0.05）;低氧48 h 组ALP mRNA 表达比常氧组高,差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）;4 个时间点低氧组骨钙蛋白（OCN）mRNA 表达均比常氧组高,且差异有统计学意义（12、36 h：P ＜ 0.05;24、48 h：P ＜ 0.01）.结论 低氧增强人PDLC 的ALP 活性,上调ALP mRNA 和OCN mRNA 的表达,促进人PDLC 向成骨细胞分化,同时促进成骨细胞的矿化,提示低氧环境对人PDLC 的骨向分化功能产生一定的影响.