锌指蛋白A20促进同种异体大鼠小体积移植肝再生并抑制急性排斥

目的 探讨锌指蛋白A20对同种异体大鼠30%小体积移植肝再生与排斥及受体存活时间的影响.方法 采用急性排斥组合DA (RT1a)大鼠→Lewis (RT1l)大鼠建立同种异体大鼠30%小体积肝移植模型. 75只大鼠均分为A20腺病毒组(A20组)、对照空腺病毒组(rAdEasy组)及对照生理盐水组(PS组)3组. 供肝切取后采用离体门静脉灌注法转基因干预,肝脏灌洗后移植. 观察受体存活时间及排斥反应,检测移植肝A20表达、肝细胞再生与凋亡、肝血窦内皮细胞(LSECs)中NF-κB活性与ICAM-1 mRNA表达、移植肝浸润单核细胞(LIMCs)总数及自然杀伤(NK)细胞和自然杀伤T(NKT)细胞数以及血清IFN-γ水平. 结果 A20组受体大鼠存活时间长于PS组大鼠和rAdEasy组大鼠(P=0.001 8),而PS组大鼠存活时间又长于rAdEasy组大鼠(P=0.001 8). A20促进小体积移植肝再生,肝移植后4 d A20组大鼠肝细胞BrdU标记指数高于PS组大鼠和rAdEasy组大鼠(P＜0.01); A20组大鼠肝细胞凋亡指数低于PS组大鼠和rAdEasy组大鼠(P＜0.01). 肝移植术后4 d,组织学检测结果显示A20组大鼠移植肝有少量细胞浸润,呈轻度排斥; 而PS 组和rAdEasy组大鼠移植肝有大量细胞浸润,呈重度排斥. A20能抑制移植后早期(1 d) LSECs 中NF-κB活性和 ICAM-1 mRNA 表达. 流式细胞术检测结果显示A20能下调移植肝LIMCs数,包括下调NK和NKT 亚群细胞数,并下调血清IFN-γ水平(P＜0.05). 结论 A20能有效促进同种异体大鼠30%小体积移植肝再生,抑制排斥并延长受体存活时间,其功效可能与抑制LSECs中NF-κB活性、抑制LIMCs浸润及减少NK 细胞和NKT 细胞浸润入肝以及抑制肝细胞凋亡有关.     

重组肝细胞生长因子促进大鼠移植肝细胞的再生

目的探讨术后应用重组肝细胞生长因子(r HGF)对大鼠移植肝细胞再生的促进作用。方法采用改良“二袖套法”建立SD大鼠原位部分肝移植模型,受鼠分为实验组和对照组,术后经尾静脉分别给予r HGF和相同体积的生理盐水,2次/d。两个组分别在术后第1、2、4、7d时随机挑取5只大鼠处死,称取移植物湿重,采血检测血清丙氨酸转氨酶及白蛋白,流式细胞仪检测移植肝的增殖活性,免疫组织化学法检测移植肝Ki-67的表达情况。结果术后第1、2d,实验组移植物湿重较对照组同时间段明显增加;术后第4、7d,实验组血清丙氨酸转氨酶水平较对照组同时间段明显降低,而白蛋白水平较对照组同时间段明显增高;术后第2、4d,实验组的移植肝增殖指数和Ki-67表达较对照组高(P<0.05)。结论大鼠部分肝移植后使用r HGF能够明显促进移植肝细胞的再生。     

肝细胞生长因子基因修饰骨髓间质干细胞移植对大鼠肺内血管生成的影响

目的 评价人肝细胞生长因子(hHGF)基因修饰骨髓间质干细胞(MSCs)移植对大鼠肺内血管生成的影响.方法 F344大鼠20只,体重200～ 250 g,2月龄,采用随机数字表法,将其随机分为2组(n=10),HGF组经颈外静脉注射5× 105个HGF基因修饰MSCs,对照组(C组)给予等容量1ml DMEM培养液.移植后28d,测定平均肺动脉压,然后取肺组织,测定hHGF含量,采用免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原表达,以反映肺小血管内皮增生程度,采用免疫组织化学法检测Ⅷ因子表达,以反映肺小血管密度,光学显微镜下观察肺血管病理学结果.结果 与C组比较,HGF组平均肺动脉压差异无统计学意义(P＞0.05),肺组织hHGF含量、小血管内皮增生程度和小血管密度升高(P＜0.01).HGF组肺小血管结构未见异常.结论 hHGF基因修饰的MSCs移植可促进大鼠肺内血管生成.     

大鼠小体积肝移植中肝动脉重建的意义探讨

目的 探讨肝动脉重建在大鼠小体积肝移植中的意义.方法 采用改良二袖套法建立大鼠40%小体积肝移植模型,实验分动脉重建组(A组)和非动脉重建组(B组),观察1周生存率,并于术后第1、2、4、7天检测肝功能、移植肝组织学变化和免疫组化法检测肝细胞的增殖细胞核抗原(PCNA).结果 A组1周生存率66.7%,B组1周生存率50.0%(P>0.05).ALT和TB术后第1天即开始明显增高,第2天达高峰,以后逐渐降低,B组和A组各时间点相比较,TB第2、7天高于A组,ALT第4、7天高于A脉组,差异有显著性意义(P<0.05).A组术后中央静脉及肝窦扩张程度相对较轻,可见较多二倍体和多倍体肝细胞.PCNA表达于术后第2天最高,A组术后第1天的移植肝细胞PCNA阳性表达率高于B组,而术后第7天移植肝细胞PCNA阳性表达率低于B组,差异有显著性意义(P<0.05).结论 肝动脉重建可明显改善大鼠小体积移植肝的功能,促进移植肝的再生,有效地保护移植肝的组织学结构,减轻术后移植肝的组织学改变.     

大鼠40％小体积肝移植肝动脉重建的意义

目的 探讨肝动脉重建在大鼠小体积肝移植中的意义.方法 采用改良二袖套法建立大鼠40%小体积肝移植模型,实验分重建动脉组和未重建动脉组,观察1周生存率,并于术后1、2、4及7 d检测肝功能、观察移植肝组织学变化以及免疫组化法检测肝细胞增殖细胞核抗原(PCNA)的表达.结果 重建动脉组1周生存率为65.0%(13/20),未重建动脉组1周生存率为50.0%(10/20),2组比较差异无统计学意义(P>0.05).2组ALT和TB于术后第1天即开始明显升高,第2天达高峰,以后逐渐降低;重建动脉组TB于第2、7天低于未重建动脉组,ALT于第2、4天低于未重建动脉组,差异均有统计学意义(P＜0.05).重建动脉组术后中央静脉及肝窦扩张程度较未重建动脉组相对较轻,可见较多二倍体和多倍体肝细胞;2组大鼠移植肝的肝细胞中PCNA表达均于术后第2天达高峰,重建动脉组术后第1天的PCNA表达阳性率高于未重建动脉组(P＜0.01),而术后第7天则低于未重建动脉组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肝动脉重建可明显改善大鼠小体积移植肝的功能,促进移植肝的再生,有效地保护移植肝的组织学结构,重建动脉组术后早期肝细胞增殖较未重建动脉组活跃.     

rhALR在大鼠部分肝移植术后肝再生中的作用及其机制研究

目的 探讨大鼠部分肝移植术后腹腔注射重组人肝再生增强因子(recombinant human augmenter ofliver regeneration,rhALR)促进肝移植术后肝细胞再生的作用及其机制.方法 建立大鼠原位60% 肝脏移植模型,部分肝移植术后腹腔注射rhALR 40 μg/kg 2 次/d(实验组,对照组注射等体积的注射用水);取术后第1、2、3、5、7 天大鼠血清及肝组织,检测血清谷丙转氨酶(ALT),测定肝细胞PCNA LI 的变化,RT-PCR 检测肝组织IL-6 mRNA Cyclin-D1 mRNA 的表达.结果 实验组(A 组)与对照组(B 组)比较,术后第1、2 天A 组血清ALT 显著低于B 组.A 组术后第1、2、3、5 天的PCNA LI 均明显高于B 组同一时点的PCNA LI(P<0.05).A 组术后第2 天的肝细胞AI 明显低于B 组同一时点的肝细胞AI(P<0.05);A 组术后肝组织IL-6 mRNA 的表达与B 组在各观察时点间比较均无统计学差异(P>0.05);A 组术后第1 天肝组织Cyclin D1 mRNA 的表达明显高于B 组同时点的表达(P<0.05),其余观察时点无明显差异.结论 大鼠部分肝移植术后应用rhALR 可以明显促进肝细胞的再生,降低血清ALT,稳定肝细胞膜,保护肝细胞功能.rhALR 促进大鼠部分肝移植术后的肝再生可能并不是通过上调启动阶段重要因子IL-6 mRNA 的表达发挥作用,而是通过上调增殖阶段重要因子CyclinD1mRNA 的表达发挥作用.     

肝细胞生长因子对大鼠减体积肝移植术后肝再生的作用

目的观察肝细胞生长因子(HGF)对大鼠减体积肝移植术后再生的影响。方法建立大鼠减体积(60%)肝移植模型,将大鼠随机分为生理盐水对照组(A组)和肝细胞生长因子治疗组(B组),每组动物60只。受体于术后皮下注射给药(HGF,100mg/kg)每天一次,直至处死。观察术后1、2、3、5、7天受体残肝重/减体积前全肝重,肝细胞有丝分裂指数(MI)、增殖细胞核抗原标记指数(PCNA LI)和溴脱氧核苷尿嘧啶的掺入指数(BrdU LI)以及术后血清丙氨酸氨基转移酶(ATL)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平。结果HGF能显著提高受体肝细胞MI、PCNA LI、BrdU LI及残肝重/减体积前全肝重(P<0.05,P<0.01),两组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平无显著差异(P>0.05)。结论肝细胞生长因子能显著促进大鼠减体积肝移植术后肝组织的再生,而对术后肝脏功能无明显损害作用。     

肝细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对脂肪颗粒移植存活率的影响

目的研究携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒（Ad—HGF）修饰骨髓间充质干细胞（MSCs）对大鼠脂肪颗粒移植存活率的影响。方法用携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒（Ad-GFP）、Ad—HGF转染雄性Wistar大鼠MSCs,测定转染效率与感染上清中肝细胞生长因子（HGF）的表达。用雌性Wistar大鼠150只,随机分为5组：空白对照组（A组）、Ad—HGF组（B组）、MSCs组（C组）、Ad—GFP感染MSCs组（D组）和Ad—HGF感染MSCs组（E组）,每组30只。各组均匀振动5分钟,将颗粒脂肪移植于自体背部皮下;移植后3、5、7、14、28、60d,每组各取5只大鼠脱颈处死,取出移植物;测体积、HE、Masson染色观察病理改变,免疫组织化学法测定组织中HGF表达和血管生成。结果积分吸光度＝100时,Ad—GFP转染MSCs效率可达89．6％;移植后3、5、7、14d,E组移植物中HGF的表达高于其他各组（P〈0．05）;移植后5、7、14、28、60d,E组血管数量也多于其他各组（P〈0．05）;28d和60d时,E组脂肪颗粒体积保持率明显好于其他4组（P〈0．05）。结论携带HGF基因的MSCs在移植物中能够持续表达HGF,有效地减少脂肪颗粒移植后的吸收,从而提高移植颗粒脂肪的存活率。     

冷缺血对大鼠小体积肝移植肝再生的影响

目的探讨冷缺血对大鼠小体积肝移植术后肝再生的影响.方法本组在2002年9月～2004年8月利用大鼠肝总量30%原位肝移植模型,实验分为肝总量70%肝切除组(C组)和冷缺血1、3、5 h组(E1、E2、E3组),观察1w生存率及肝重量/受体原肝重量比值(EGW/RLW),并检测术后1、2、3、7d肝细胞增殖活性及肝组织学变化.结果E1组1w生存率及EGW/RLW分别达100%和95%,均明显高于E2、E3组(P均＜0.05);E1、E 、E3组均于术后2d达到增殖高峰,其中E1组峰值显著高于E2、E3组(P＜0.001),且与C组峰值无差异(P＞0.05);组织学检查见E1组肝细胞核分裂明显活跃.结论冷缺血1 h的小体积供肝和70%肝切除后肝脏具有同样的增殖活性,仅增殖高峰稍晚;冷缺血超过3h严重影响小体积供肝的再生能力和受者的存活率.     

骨髓间充质干细胞促进大鼠小体积肝移植后肝再生的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞能否促进大鼠小体积肝移植后移植肝的再生.方法 体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞.在30％大鼠部分肝移植的模型基础上,实验分为对照组(30％ PLT)和骨髓间充质干细胞干预组(30％PLT+ MSC).比较两组肝移植术后的存活率,分析肝功能的变化,通过免疫组化来观察移植肝标本Cyclin D1和PCNA的表达,并对移植肝组织结构进行电镜观察.结果 骨髓间充质干细胞的干预,能够改善小体积肝移植术后肝功能状况,减轻组织学损伤,并能够提高存活率,30％ PLT组与30％ PLT+ MSC组一周存活率分别为16.7％和58.3％.而在Cyclin D1和PCNA的免疫组化表达中,30％ PLT组表达明显抑制,30％ PLT+ MSC组表达上调.结论 骨髓间充质干细胞可以存进大鼠小体积肝移植后移植肝的再生,改善肝功能,并提高存活率.     

两种不同方法的大鼠小体积肝移植模型建立的比较

目的　探索一种大鼠小体积肝移植模型简单有效的建立方法。方法　选取体重相近的SD大鼠作为供受体 ,采用体外和体外两种方法切除部分肝叶以获取小体积供肝 ,按Kamada两套管法做供肝植入。比较两种方法的技术并发症。结果　体外法在术后肝断面出血、渗血 ,肝后下腔静脉狭窄和继发血栓 ,术中因出血引起的低血压休克 ,相近肝叶静脉误扎引起的回流障碍等并发症发生方面较体内法多。两者总的并发症发生率分别为 35 % (6 / 16 )和 5 % (4 / 78) (P <0 0 5 ) ,而两种方法在无肝期 ,冷缺血时间及总的手术时间上无统计学差异。结论　选取体重相近的供受体进行体内切除减体积是大鼠小体积肝移植模型建立的可行有效方法     

Implanted adipose-derived stem cells attenuate small-for-size liver graft injury by secretion of VEGF in rats

Graft injury after small-for-size liver transplantation impairs graft function and threatens the survival of the recipients. The use of adipose-derived stem cells (ADSCs) for liver injury protection and repair is promising. Our aim was to investigate the role of vascular endothelial growth factor (VEGF) secreted by ADSCs in the treatment of small-for-size liver graft injury. Studies were performed using ADSCs with VEGF secretion blocked by RNA interference. In vitro, ADSCs prevented apoptosis of freshly isolated liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) by secretion of VEGF. Syngeneic 35% orthotopic liver transplantation followed by implantation of syngeneic ADSCs through the portal vein system was performed using Wistar rats. We found VEGF secreted by implanted ADSCs improved graft microcirculatory disturbances, serum liver function parameters and survival. The improved microcirculatory status was also reflected by reduced hepatocellular damage, especially LSEC apoptosis and improved liver regeneration. These effects were accompanied by decreased expression of endothelin receptor type A, increased Bcl-2/Bax ratio, decreased expression of Bad and elevated proportion of phosphorylated Bad. In conclusion, implanted syngeneic ADSCs attenuated small-for-size liver graft injuries and subsequently enhanced liver regeneration in a rat 35% liver transplantation model. The VEGF secreted by implanted ADSCs played a crucial role in this process.     

Impaired hepatic regeneration by ischemic preconditioning in a rat model of small-for-size liver transplantation

OBJECTIVE: Graft size is one of the major risk factors in adult-to-adult living donor liver transplantation and rapid regeneration is an essential post-operative requirement. Ischemic preconditioning (IPC) has been shown to be an effective strategy in the reduction of hepatic ischemia-reperfusion injury and stimulation of liver regeneration. This study was designed to evaluate the effects of IPC on liver regeneration in small-for-size liver grafts. METHODS: We employed a rat orthotopic liver transplantation model using small-for-size (30%) grafts, in the presence or absence (control) of IPC (10 min of ischemia followed by 15 min of reperfusion). Survival rate, graft injury, hepatocellular proliferation, cell cycle progression, Stat3 activation, as well as TNF-alpha and IL-6 expression were assessed. RESULTS: IPC significantly enhanced the extent of graft injury and hindered hepatic regeneration in small-for-size liver grafts. The 7-day survival rate was also reduced by IPC, but failed to reach statistical significance. IPC did not affect TNF-alpha levels, but significantly decreased the elevation of IL-6 after reperfusion. These findings were correlated with down-regulation of cyclin E and cyclin D1, and decreased numbers of PCNA-positive nuclei in IPC grafts. These results were inconsistent with Stat3 activation, as P-Stat3 exhibited a stronger and prolonged pattern of expression in the IPC group, compared to controls. CONCLUSIONS: Ischemic preconditioning may impair liver regeneration in small-for-size liver grafts by decreasing IL-6 and blunting cell cycle progression, through a mechanism at least partially independent of Stat3.     

大鼠小体积肝移植后肝细胞再生的研究

目的 探讨小体积肝移植术后肝再生的情况。方法 建立大鼠30％原位肝移植模型,实验分为肝切除（PH）组、全肝移植（0LT）组和30％小体积肝移植（30％POLT）组,观察1w生存率,并于术后1、2、3、7d检测肝细胞增殖活性、肝功能和肝组织学变化。结果 各组1w生存率均为100％;30％POLT组术后2d达到增殖高峰,峰值与PH组无差异（P〉0．05）;其肝功能酶学指标在术后1、3d明显升高,组织学见肝细胞核分裂极其活跃。结论 冷缺血1h的30％供肝和肝切除后肝脏具有同样的增殖活性,仅增殖高峰稍晚;较短的冷缺血时间以及熟练的手术技术可能对小体积供肝的再生起重要作用。     

NIM811, a Mitochondrial Permeability Transition Inhibitor, Prevents Mitochondrial Depolarization in Small-for-Size Rat Liver Grafts

ATP decreases markedly in small-for-size liver grafts. This study tested if the mitochondrial permeability transition (MPT) underlies dysfunction of small-for-size livers. Half-size livers were implanted into recipients of about twice the donor weight, resulting in quarter-size liver grafts. NIM811 (5 microM), a nonimmunosuppressive MPT inhibitor was added to the storage solutions. Mitochondrial polarization and cell death were assessed by confocal microscopy of rhodamine 123 (Rh123) and propidium iodide (PI), respectively. After quarter-size transplantation, alanine aminotransferase (ALT), serum bilirubin and necrosis all increased. NIM811 blocked these increases by >70%. After 38 h, BrdU labeling, a marker of cell proliferation and graft weight increase were 3% and 5%, respectively, which NIM811 increased to 30% and 42%. NIM811 also increased survival of quarter-size grafts. In sham-operated livers, hepatocytes exhibited punctate Rh123 fluorescence. By contrast, in quarter-size grafts at 18 h after implantation, mitochondria of most hepatocytes did not take up Rh123, indicating mitochondrial depolarization. Nearly all hepatocytes not taking up Rh123 continued to exclude PI at 18 h, indicating that depolarization preceded cell death. NIM811 and free radical-scavenging polyphenols strongly attenuated mitochondrial depolarization. In conclusion, mitochondria depolarized after quarter-size liver transplantation. NIM811 decreased injury and stimulated regeneration, probably by inhibiting free radical-dependent MPT onset.     

大鼠小体积肝移植后肝再生障碍的实验研究

目的探讨部分肝移植后肝再生状况和小体积移植物发生肝再生障碍的可能机制。方法实验分为大鼠全肝移植组（OLT）、50%部分肝移植组（50%PLT）和30%部分肝移植组（30%PLT）。分析各组术后肝功能的变化,通过免疫组化观察移植肝标本Cyclin D1和PCNA的表达,并对移植肝组织结构进行电镜观察。结果各组ALT和AST于术后24hr达到峰值,且30%PLT组上升显著。Cyclin D1和PCNA的免疫组化表达中,50%PLT组表达明显上调,而30%PLT组表达则明显抑制。电镜观察发现30%PLT组术后微观结构改变显著。结论 30%PLT组术后肝细胞增殖再生受到明显抑制,推测与肝细胞微环境的恶化和叠加的缺血再灌注损伤有关。     

Rapamycin Attenuates Liver Graft Injury in Cirrhotic Recipient—The Significance of Down-Regulation of Rho-ROCK-VEGF Pathway

To investigate whether rapamycin could attenuate hepatic I/R injury in a cirrhotic rat liver transplantation model, we applied a rat orthotopic liver transplantation model using 100% or 50% of liver grafts and cirrhotic recipients. Rapamycin was given (0.2 mg/kg, i.v.) at 30 min before graft harvesting in the donor and 24 h before operation, 30 min before total hepatectomy and immediately after reperfusion in the recipient. Rapamycin significantly improved small-for-size graft survival from 8.3% (1/12) to 66.7% (8/12) (p = 0.027). It also increased 7-day survival rates of whole grafts (58.3%[7/12] vs. 83.3%[10/12], p = 0.371). Activation of hepatic stellate cells was mainly found in small-for-size grafts during the first 7 days after liver transplantation. Rapamycin suppressed expression of smooth muscle actin, which is a marker of hepatic stellate cell activation, especially in small-for-size grafts. Intragraft protein expression and mRNA levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) were down-regulated by rapamycin at 48 h both in whole and small-for-size grafts. Consistently, mRNA levels and protein expression of Rho and ROCK I were decreased by rapamycin during the 48 h after liver transplantation. In conclusion, rapamycin attenuated graft injury in a cirrhotic rat liver transplantation model by suppression of hepatic stellate cell activation, related to down-regulation of Rho-ROCK-VEGF pathway.     

骨髓间充质干细胞输注治疗大鼠小体积肝移植术后肝衰竭

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞输注治疗大鼠小体积肝移植术后肝衰竭的可行性.方法 体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,采用细胞膜染料PKH26对骨髓间充质干细胞进行标记.将雄性SD大鼠随机分为对照组和治疗组.对照组于小体积(30 %)肝移植术中,在移植肝血供恢复时自尾静脉注入磷酸盐缓冲液(PBS) 0.5 ml,治...