中国株HGV部分基因的分子克隆与核苷酸序列分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ对广东地区３３例肝炎病人血清进行ＨＧＶＲＮＡ检测，结果２例（６．１％）阳性。对其中１株输血后ＨＧＶ（ＣＨ－３）基因组５＇端非翻译区（５＇ＵＴＲ）进行分子克隆与测序，并分别与Ｌｉｎｎｅｎ等报道的２株ＨＧＶ（ＰＮＦ２１６１，Ｒ１０２９１）和Ｌｅａｒｙ等报道的ＧＢＶ－Ｃ相比较，其核苷酸序列的同源性分别为８９．２％、８８．７％、８７．１％。本研究首次证实我国华南地区存在ＨＧＶ感染。ＨＧＶ高度保守区５＇ＵＴＲ的分子克隆与核苷酸序列的测定对开展ＨＧＶ感染的基因诊断具有重要意义。     

HGV NS5A区部分基因的克隆及表达

目的：构建含HGV NS5A区基因的原核表达载体。方法：采用PCR方法从重组了HGV 6672-7292区段基因的pUC19中扩增出HGV 6864-7277nt片段，定向克隆入pGEMEX1质粒，再经SacI、HindⅢ酶切亚克隆入高效表达载体pRSETA.结果：重组pRSETA经序列测定证实插入基因为目的的基因，符合表达框架，经IPTG诱导，在BI21（DE3)菌株中表达连接6个组氨酸的HGV NS5A融合蛋白。Western blotting显示在Marker约25k处可见明显的蛋白带，与预期结果一致。结论：成功构建了重组HGV NS5A区基因表达载体，在BI21(DE3)中能有效表达。     

丙型肝炎病毒Ns_3基因区部分序列的PCR克隆和鉴定

选取HCV－1、HCV－J、HCV－BK、台湾株HCV、中国河北株HCV序列的同源性部分，设计Ns3区部分序列的PCR引物．应用RT－PCR技术，从丙型肝炎患者血浆中扩增一长为448bp的cDNA片段作为目的基因，与经过限制性酶切的pUcI9载体连接，构建重组质粒pUHCV－Ns3．分别或混合应用HCV序列特异的引物和载作序列特异的通用引物，以PCR扩增重组质粒，结果扩增产物的分子量均与预期大小一致．限制性酶切位点分析结果也证实，克隆的基因是HCV的Ns3区部分序列的目的基因．克隆序列的特异性和插入方向同时得到了鉴定．     

陕西株庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV )RNA NS3区 cDNA(4248nt～4465nt)的扩增、克隆和序列分析

目的　了解陕西株庚型肝炎病毒 (HGV,RNA/ GBV-C)的核苷酸序列特点 .方法　从陕西省西安市两位非甲、乙、丙、丁、戊型肝炎患者的血清中 ,应用反转录及套式 PCR技术 ,从血清中提取 RNA,经特异性的反转录引物 P4反转录成c DNA,以此为模板分别用 P3,P4及 P1 ,P2 两对引物进行PCR扩增 ,扩增到 2 18bp的 HGV RNA NS3区部分基因 ,将其克隆入 Pin Point TMXal- T载体 ,挑选阳性克隆并进行了序列分析 .结果　 SG2 与 HGV的核苷酸同源性分别为 85 .6 4%与84.48% ;与 GBV- C的核苷酸同源性为 86 .2 1%与 84.48% ,其二者之间同源性为 97.13% ;二者与 HGV的氨基酸同源性分别为 98.2 8%和 93.10 % ,与 GBV- C的氨基酸同源性也为98.2 8% ,93.10 % ,二者之间的氨基酸同源性达 94.83% .结论　庚型肝炎病毒 NS3区核苷酸同源性较高 ,同义突变率也较高 ,可能是一个对其生存环境较为适应的病毒 .     

七株急性散发性戊型肝炎病毒部分核苷酸序列分析

比较我国流行性和散发性戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）的部分核苷酸和氨基酸序列及其与戊型肝炎流行的关系。方法应用逆转录套式聚合酶链反应法（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从急性散发性戊型肝炎病人血清中扩增ＨＥＶ开放读码框架２（ＯＲＦ２）ｃＤＮＡ，并用ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０ＤＮＡ序列分析试剂盒，经双脱氧核苷酸ＤＮＡ链末端终止直接测序法测定ＲＴ－ｎＰＣＲ扩增产物的核苷酸序列。结果从深圳、长春、杭州、西安、北京５个城市４１份急性散发性戊型肝炎病人血清中获得２８株ＨＥＶＯＲＦ２ｃＤＮＡ，对其中７株进行了核苷酸序列分析，表明它们与ＨＥＶ墨西哥株（Ｍ）的同源性为７８．９％～８０．２％；与ＨＥＶ缅甸（Ｂ）流行株（Ｅｐ）的同源性为９３．１％～９５．１％；与ＨＥＶ缅甸（Ｂ）散发株（Ｓｐ）的同源性为９２．３％～９４．２％；与ＨＥＶ中国新疆流行株ＣＨ１．１同源性为９６．５％～９８．９％；７株散发性ＨＥＶ间核苷酸序列的同源性为９５．７％～１００％。结论该７株散发性ＨＥＶ与ＨＥＶ（Ｂ）和ＨＥＶＣＨ１．１核苷酸序列的同源性较高，均属同一亚型。     

中国人庚型肝炎病毒部分基因的克隆及序列分析

目的：分析中国人血清中庚型肝炎病毒（ＨＧＶ或ＧＢＶ－Ｃ）ＮＳ３区部分基因序列。方法：从个体供血者及肝硬化患者血清中，通过逆转录合成ｃＤＮＡ，设计特异性引物进行多聚酶链式聚合反应，将产物克隆于载体上，采用双脱氧核苷酸链终止法进行双向测序。结果：分离出的５株ＮＧＶ毒株的ＮＳ３区部分核苷酸序列之间同源性从８５％到９８％，与国外已发表的ＨＧＶ序列比较，同源性在７９％～９１％。推测的其编码氨基酸序列，５株之间１００％一致，与国外已报告的ＨＧＶ比较，同源性为９４．９％～１００％。结论：从中国人血清中分离出５株ＨＧＶ序列，其ＮＳ３区部分核苷酸存在着一定的变异性，但其编码的氨基酸非常保守。     

散发性庚型肝炎病毒部分核苷酸序列分析

目的 获得散发性庚型肝炎病毒杭州株E2/NS1区部分核苷酸序列。方法 选择1例浙江杭州散发性庚型肝炎患者，从其血清中分离HGVRNA，通过逆转录-套式聚合酶链反应（RT-nPCR)法，扩增该散发性HGV（HZ-2株）E2/NS1区部分cDNA片段，然后克隆到质粒pGEX-4T-3中，并进行核苷酸序列分析结果 HGV杭州株与河北株（HGVC964）、美国株（HGU44402）的核苷酸同源性为92.5%和89.8%。氨基酸同源性为98.0%和93.9%。结论 该项研究将为HGV诊断试剂盒 的研制及基因工程疫苗的研制提供资料。     

陈株病毒部分G2编码区基因在乳鼠中的克隆与序列分析

陈株病毒部分Ｇ２编码区基因在乳鼠中的克隆与序列分析夏国庆１刘彦仿１冯蕾２晏培松１杨守京１（第四军医大学：１病理学教研室，２中心实验室西安７１００３３）关键词汉坦病毒自动测序聚合酶链式反应反转录中图号Ｒ３６５．５１＊国家自然科学基金资助项目Ｎｏ．３９４...     

安徽省不同地区分离的五株庚型肝炎病毒5’末端编码区部分核酸序列比较

目的 :探索安徽省庚型肝炎病毒 (HGV)基因的变异。方法 :采用HGV中国株 5’非编码区序列设计引物、逆转录套聚合酶链反应法 ,检测我省不同地区血清中的HGVRNA ,5份阳性产物采用ABIPrism377DNA自动测序仪进行序列测定。结果 :测定的 2 13个碱基中 ,5株安徽HGV分离株与非洲GBV C(u36 380 )序列同源性分别为 88.2 6 %、85 .92 %、88.2 6 %、85 .45 %和 88.2 6 % ,与美国株 (u444 0 2 )序列同源分别为 92 .0 2 %、86 .85 %、86 .6 7%、89.2 0 %和 91.5 5 % ,而我省HGV分离株间的同源性均高于 92 .0 2 5。结论 :我省HGV分离株基因型不同于美国报道的GBV C和HGV亚型     

中国人庚型肝炎病毒部分基因的克隆及序列分析

分析中国人血清中庚型肝炎病毒ＮＳ３区部分基因序列。     

人地中海贫血基因β654的克隆与序列分析

[目的]克隆人地中海贫血基因β654,并进行序列分析,为下游转基因小鼠模型的建立奠定工作基础。[方法]以PCR法扩增获得人β654基因,将其克隆入卸除了人β基因的质粒pBGT51中,酶切、反应点杂交及测 法鉴定重组质粒。[结果]所构建的重组质粒中含人β654基因,其引入方向正确,序列分析结果正确。[结论]构建所得的重组擀粒可用于下游的传基因工作。     

庚型肝炎病毒不同地理株5‘端非编码区序列的变异性分析

目的：为明确了解中国不同地区（广东，云南，香港）庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）株５‘端非编码区（ＮＣＲ）序列的差异。方法：采用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，从广东省２例，云南省１例，香港３例共６例ＨＧＶ感染者血浆中扩增ＨＧＶ５’ＮＣＲ ｃＤＮＡ片段，为２３８ｂｐ，ＰＣＲ产物纯化后直接经对脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果：中国ＨＧＶ株间５‘ＮＣＲ相应序列的同源性介乎９２．９３％￣９７．９８     

安徽省不同地区分离的五株庚型肝炎病毒5‘末端编码区部分 …

目的：探索安徽省庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）基因的变异，方法：采用ＨＧＶ中国株５’非编码区序列设计引物，逆转录套聚合酶链反应法，检测我省不同地区血清中的ＨＧＶＲＮＡ，５份阳性产物采用ＡＢＩＰｒｉｓｍ３７７７ＤＮＡ自动测序仪进行序列测定。结果：测定的２１３个碱基中，５株安徽ＨＧＶ分离民非洲ＧＢＶ－Ｃ（ｕ３６３８０）序列同源性分别为８８．２６％、８５．９２％、８７８．２６％、８５．４５％和８８．２６％，与美     

HCVC基因部分序列的克隆测序

选取５株ＨＣＶ共有序列合成一时５’端加端引物。上游加端为ＥｃｏＲⅠ切点，下游加端为ＢａｍＨＩ切点。以ＲＴ－ＰＣＲ扩增一长为５７８ｂｐ的ｃＤＮＡ作目的基因，相应酶切后，反向插入ＰＵＣ１８的多克隆位点，构建ｐＵＨＣ－Ｃ重组体。分别或混合应用ＨＣＶ特异内外引物和ｐＵＣ特异通用引物以ＰＣＲ扩增重组体，扩增产物分子片段均同预期一致。测序表明克隆基因与ＨＣＶ－ＣＨＮ最同源，在所测ＣＥ４９７个核苷酸及由之推导的１６０个氨基酸区域内。其核苷酸与氨基酸同源性都是９７．５％。     

聚合酶链反应检测HGV RNA方法的建立及应用

了解我国不同人群中庚型肝炎病毒感染的状况。方法；以ＮＢ５区序列分析为基础设计引物，建立了聚合酶链反应方法，并对我国几个地区，不同疾病状况的２６８例患者进行庚型肝炎病毒核酸的检测。结果；有输血史的健康人群，ＨＢＶ和ＨＣＶ感染者及慢性非乙非丙型肝炎患者的ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ ＲＮＡ阳性率均高于自然人群，分别为１３．３％，１８．４％，１９．８％，８．９％，其中有明显血液暴露史者的检出率达２０．１％。     

HCV广东株基因组部分片段的序列测定

ＨＣＶ广东株基因组部分片段的序列测定李刚，姚集鲁，彭文伟，吕凌，王斌（中山医科大学传染病学教研室；广州，５１０６３０）关键词丙型肝炎病毒（ＨＣＶ），逆转录聚合酶链反应，分子克隆，ＤＮＡ序列测定中图号Ｒ５１２．６２；Ｑ５２３．１采用逆转录聚合酶链反应技...     

赖型钩体内鞭毛基因的扩增,克隆,核苷酸序列测定及其在大肠杆…

根据钩体内鞭毛蛋白ｆｌａＢ基因核苷酸序列自行设计一对引物，以赖型钩体ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ扩增到约８４０ｂｐ的片段。扩增片段经酶切（Ｂａｍ ＨＩ、Ｐｓｔ Ｉ）定向克隆入ｐＵＣ８。重组质粒ｐＬＦ１插入片段与哈勒焦型钩体ｆｌａβ基因相比，核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性很高。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明有一约３３ｋｄ的特异蛋白带，表达量占菌体蛋白１１％。免疫印迹试验表明此区带能被抗赖型钩体内鞭毛（轴丝）抗血     

金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的克隆和序列测定

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列，设计并合成一对特异性的引物。以鼠金黄色葡萄球菌临床分离株SA.m0109的基因组DNA为模板，利用PCR技术对其耐热核酸酶nuc基因片段进行扩增，获得了预计大小的片段。将这一片段克隆到质粒载体pGEM-T中，对重组质粒pGEM-NUC进行限制内切酶分析，PCR鉴定和克隆片段的序列测定。证实了克隆片段的可靠性。