反式作用丁型肝炎病毒核酶体外切割活性的研究

丁型肝炎病毒 (ＨＤＶ)在复制过程中 ,基因组ＲＮＡ及复制产生的抗基因组ＲＮＡ均具有自我裂解的活性———核酶(Ｒｉｂｏｚｙｍｅ)活性。ＨＤＶ核酶是在所发现的核酶类型中唯一在人体的细胞中具有天然裂解活性的核酶。通过对ＨＤＶ核酶的研究 ,已经确定了 85ｎｔ长度的核酶活性区 ,并且其二、三级结构也有了阐明。本文根据ＡｎｎｅＴ等人提出的ＨＤＶ核酶自我裂解时的假结样 (ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ ｌｉｋｅ)二级结构 ,将 85ｎｔ的ＨＤＶ核酶从其Ｊ(1/ 2 )连接处分成两段 ,一段作为核酶 ,一段作为底物 ,设计ＨＤＶ核酶的反式作用形式 ;将反…     

反义寡核苷酸抗丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶的研究

以质粒ｐＳＶＬＤ３为模板，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到１条１３９ｂｐ的片段，它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）区的ｃＤＮＡ，该核酶具有自身裂解功能，将此片段插入到ｐＧＥＭ－３Ｚ中，经筛选，鉴定得到重组质粒ｐＨＤＶ１０８，经测序发现有２个碱基变异。以该质粒为模板，通过Ｔ７ＲＮＡ聚合酶，转录出核酶的前体，并观察到其自身裂解产物，自裂率达７１％，针对核酶唯一的自裂位     

丁型肝炎病毒RNA中核酶的研究进展

丁型肝炎病毒ＲＮＡ中存在的二个核酶，本文就近几年来ＨＤＶ ＲＮＡ中核酶的发现，位置、所需的碱基、二级结构及其对核酶的作用、体外作用条件、影响因素等研究和ＨＤＶ ＲＮＡ中核酶的意义作一综述。     

反义寡脱氧核苷酸抗丁型肝炎病毒的作用

在进行中国人ＨＤＶ核酶活性ｃＤＮＡ克隆及序列分析，并构建含ＨＤＶ核酶质粒（ｐＨＤＶｒｚ２７７）的基础上，进行反义寡脱氧核苷酸抗ＨＤＶ作用的研究。设计合成了一条与核酶结构中起重要作用的７２１￣７３５位核苷酸互补的１５聚反义寡脱氧核苷酸。用其中一条含Ｔ７启动子的一对引物，以ｐＨＤＶｒｚ２７７为模板扩增得到１３１ｂｐＨＤＶ核酶基因片段，再以此为模板用Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶进行体外转录，并在转录的同时加入反义     

丁型肝炎病毒基因组RNA中核酶区的cDNA的体外转录

以质粒ｐＳＶＬＤ３为模板，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到１条１３９ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶区的ｃＤＮＡ，将此片段克隆到ｐＧＥＭ－３２中，经筛选、鉴定，得到克隆株ｐＨＤＮＡ１０８，提取质粒后经双脱氧末端终止法测序，发现有２个碱基变异。以该质粒为模板，通过Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶转录出ＨＤＶ基因组ＲＮＡ中核酶区的前体，并观察到其自身裂解产物，自裂率达７１％。     

乙型肝炎病毒在丁型肝炎病毒包装中的作用机理研究

用含ＨＢＶ全基因和ＨＢＶ大、中、小分子表面蛋白基因的真核细胞表达质粒（ＣＭＶ－ＨＢＶ、ＣＭＶ－ＬＳ、ＣＭＶ－ＭＳ、ＣＭＶ－Ｓ）分别与含ＨＤＶ ｃＤＮＡ三聚体的重组质粒共转染ＣＨＯ细胞。转染后３天在上述４种转染细胞内及培养上清中均检出了ＨＤＶ ＲＮＡ和ＨＤＡｇ表明上述４种转染细胞的培养上清中均有ＨＤＶ病毒颗粒的包装和分泌。提示：ＨＤＶ病毒的包装可能仅需ＨＢＶ Ｓ 基因及其小分子表面蛋白的辅助。     

成年树Qu实验感染丁型肝炎病毒的初步研究

在证实成年树Ｑｕ可感染人乙型肝炎病毒的基础上，进行了丁型肝炎病毒－乙型肝炎病毒实验感染的探索。ＨＤＶ／ＨＢＶ阳性人血清经同时和重叠感染方式接种于成年树Ｑｕ后，定期留取感染树Ｑｕ血清及肝组织，检测血清中ＨＢｓＡｇ、ＨＤＡｇ、抗－ＤＥ、ＨＢＶＤＮＡ及ＨＤＶＲＮＡ，初步探讨成年树Ｑｕ实验感染ＨＤＶ的可能性。     

重型病毒性肝炎中丁型肝炎病毒的检测

为了探讨丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）感染在重型病毒性肝炎中的作用，对北京佑安医院１９８０年至１９８９年收治的５４例急性和亚急性重型肝炎和３８例急性乙肝患者血清，应用国产ＨＤＶＥＬＩＳＡ试剂测定抗－ＨＤ、抗－ＨＤＩｇＭ和ＨＤＡｇ，应用斑点杂交技术测定ＨＤＶＲＮＡ。结果发现重型肝炎组ＨＯＶ－Ｍ检出率明显高于急性乙肝组（２７．８％比５．３％．Ｐ＜０．０５）。单独ＨＢＶ感染和ＨＤＶ／ＨＢＶ混合感染的重型肝炎患者均有较高的病死率。提示ＨＤＶ感染是重型肝炎中重要的病原学因素之一，ＨＤＶ与ＨＢＶ具有协同作用加重肝损害，导致肝衰竭。     

重庆地区丁型肝炎病毒基因组中核酶活性区的cDNA克隆及序列分析

从重庆地区一HDAg阳性的活动性肝硬化患者血清中,通过逆转录-巢式聚合酶链反应扩增到一含核酶活性区的234bp的片段,将此片段补平和磷酸化后克隆于pGEM-4Z的HincⅡ位点,以双脱氧链末端终止法进行测序。该序列(pHDVrz277)与意大利株、中国河南株、台湾株、美国-1株、日本-1株及秘鲁-1株比较,核苷酸序列同源性分别为100％、97％、97％、97％、96.15％和75.64％,两个自裂位点及核酶活性区绝对保守。     

原位杂交法检测肝组织中丁型和乙型肝炎病毒核酸

利用国外引进的重组质粒获得纯化基因片段，分别以随机引物法和ＰＣＲ法制备地高辛素标记的ＨＢＶＤＮＡ探针和ＨＤＶｃＤＮＡ探针。用原位杂交法检测了石蜡包埋的肝组织切片ＢＶＤＮＡ和ＨＤＶＲＮＡ。４９例感染肝组织分为两组：丁肝组２３例；单纯乙肝组２６例，ＨＢＶＤＮＡ的检出率丁肝组（７８．２６％）与乙肝组（７６．９２％）无统计学差异；而ＨＤＶＮＡ的检出率丁肝组（６０．８７％）明显高于乙肝组（１５．３８％）。ＨＢＶＤＮＡ可见于受染肝细胞的胞核或胞浆内，而ＨＤＶＲＮＡ绝大部分见于肝细胞胞核。两种病毒核酸阳性细胞在肝组织中的分布特点大致相同：弥漫或散在地分布于肝小叶或假小叶内，或局灶性分布于小叶周边。ＨＤＶＲＮＡ阳性的肝组织都或多或少地同时存在ＨＢＶＤＮＡ。同一例肝组织中，ＨＢＶＤＮＡ阳性细胞从数量和颗粒密度上似略高于ＨＤＶＲＮＡ。将乙肝组和丁肝组两组病人肝内ＨＢ－ｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ及血清ＨＢｅＡｇ作了比较，各指标阳性率虽有差异，但均无统计学意义。因此，未发现ＨＤＶ感染对ＨＢＶ的复制有明显抑制作用。此结果对以往用血清学或免疫组化方法对ＨＤＶ的研究有所补充和深入，亦可为研究其它类型病毒性肝炎之间的重叠感染所借鉴。     

PIP反义核酸对乙肝病毒PRE转录后调节的影响

目的 研究乙肝病毒转录后调节元件(PRE)结合蛋白PIP在PRE转录后调节机制中的作用。方法 用质粒pcDNA3．1(-)构建PIP反义核酸真核表达重组体pAS-PIP；用pAS-PIP转染HepG2细胞，再将依赖于PRE转录后调节的CAT报告质粒转染上述细胞，通过ELISA方法检测CAT的表达水平。结果 成功构建PIP反义核酸真核表达重组体pAS-PIP；基因转染结果显示，与转染空载体组相比，转染pAS-PIP反义核酸组CAT水平下降21．97％。结论 PIP反义核酸可有效地降低依赖于PRE的CAT的表达,PIP在PRE转录后调节中起着重要的作用。     

地高辛标记探针原位杂交检测肝内HDV RNA

本研究采用随机引物法用地高辛标记ＨＤＶ　ｃＤＮＡ全基因片段作为探针，通过原位杂交方法检测了５８例慢性乙型肝炎患者的肝组织石蜡切片中的ＨＤＶ　ＲＮＡ，发现ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性者９例，检出率为１５．５％。ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性物质在肝细胞内的分布方式有胞浆型、核膜型、核仁型、核膜核仁型和全核型等。ＨＤＶ　ＲＮＡ阳性肝细胞在显微镜下多数正常或只显示轻微病变。本文结果提示ＨＤＶ的致病性并非由于ＨＤＶ的直接细胞毒作用，而是宿主细胞和病毒共同作用结果，但其确切生物学意义还有待进一步探索。     

乙型肝炎患者HBV M和HBV DNA的相关性研究

目的 探讨乙型肝炎患者的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）血清学标志（ＨＢＶ Ｍ）与ＨＢＶ ＤＮＡ检测结果的相关性与临床意义。方法 对４１４例乙型肝炎的ＨＢＶ Ｍ和ＨＢＶ ＤＮＡ检测结果进行比较。ＨＢＶ Ｍ用ＥＬＩＳＡ定量分析法检测,ＨＢＶ ＤＮＡ用斑点杂交法检测。结果 急性、慢性乙型肝炎患者中ＨＢＶ ＤＮＡ的阳性率与乙型肝炎肝硬化患者的ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率比较,差异有显著性;ＨＢｓＡｇ、抗－ＨＢｅ、抗－ＨＢｃ阳性和ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢｃ阳性组的ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率比较,差异无显著性;ＨＢｓＡｇ和／或ＨＢｅＡｇ的滴度与ＨＢＶ ＤＮＡ阳性率呈正相关关系。结论 ＨＢＶ ＤＮＡ是评价ＨＢＶ活动最理想的标志;抗－ＨＢｅ的出现不能作为ＨＢＶ复制停止的指标;ＨＢｓＡｇ的滴度和ＨＢｅＡｇ的滴度变化可作为临床评价病毒复制程度和     

HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBVcccDNA相关性的研究

目的探讨HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBVcccDNA之间的关系。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测30例经肝组织活检病理检查确定为HBV携带者的肝组织中HBVcccDNA、HBVtDNA和血清HBV DNA,同时用化学发光免疫分析法检测HBsAg、HBeAg定量,分析感染者肝组织内HBVcccDNA与肝组织内HBVtDNA、血清HBVDNA、HBsAg及HBeAg定量水平之间的关系。结果HBV携带者肝组织中均可检出HBVcccDNA,范围在3．15×10^3拷贝／mg～1．06×10^7拷贝／mg（对数值：5．66±O．93）;肝组织cccDNA定量与肝组织总HBVDNA定量呈正相关（r=0．375,P〈0．05）,与血清HBVDNA无相关性（r=0．174,P〉0．05）。肝组织中HBVcccDNA水平与血清HBsAg定量呈高度正相关（r=0．562,P〈0．001）;而与血清HBeAg定量无相关性（r=0．152,P〉0．05）。结论HBV携带者肝组织内HBVcccDNA成稳定的中等水平复制;血清HBVDNA载量不能直接代表其肝组织中的HBVcccDNA水平;血清HBsAg定量可作为反映肝幺日织中HBVcccDNA水平的指标。     

B7-2表达质粒对HBV DNA疫苗诱导的特异性免疫应答的影响

目的：探讨B7－2分子是否能够增强乙型肝炎病毒（HBV）DNA疫苗诱导的特异性免疫应答。方法：将B7－2表达质粒与HBV DNA疫苗共接种于小鼠腓肠肌内，检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性，迟发性超敏反应（DTH）及抗－HBs滴度。结果：B7－2表达质粒与HBV DNA疫苗共接种组的DTH反应和CTL活性，明显强于单独接种HBV DNA疫苗组（P＜0．01）。两组的抗－HBs滴度差异无显著性（P＞0．05）。结论：B7－2表达质粒与HBV DNA疫苗共接种可显著增强抗－HBV特异性细胞免疫应答（CMI）。     

肾小球肾炎肾组织中HBV感染的标志

为了解肾组织中ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶ抗原存在的关系，探讨肾组织中ＨＢＶ抗原的来源及其与病理变化的关系，我们检测２４６例肾炎肾组织中三种ＨＢＶ抗原。发现除肾小球沉积外，肾小管常有阳性表达。肾小管ＨＢｃＡｇ阳性率达２１．５４％，高于肾小球（１０．９８％）。有１８例肾组织经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交检测ＨＢＶＤＮＡ，１５例阳性者中１４例肾组织ＨＢＶ抗原同时阳性，１２例血清感染标志亦阳性。结果提示某些肾炎可能与肾组织感染ＨＢＶ相关，肾组织中出现的ＨＢＶ抗原抗体免疫复合物除来自血循环外，有肾源性──原位形成的可能。     

Assessment of hepatitis B surface antigen negative blood units for HBV DNA among replacement blood donors in a hospital based blood bank in Nigeria

BackgroundHepatitis B virus infection is one of the greatest threats to blood safety all over the world. The laboratory algorithm based on only the detection of hepatitis B surface antigen (HBsAg) leaves a gap for infected HBsAg negative donors to donate blood during the “window period” (WP) and late stages of infection.ObjectiveTo estimate the frequency of the presence of HBV deoxyribonucleic acid (DNA) in HBsAg negative blood units screened using two different assays for HBsAg in a high endemic region.MethodsFrozen serum aliquot of 100 replacement blood donors who donated blood units that were HBsAg negative were retrieved and tested for HBV DNA. Sample positive for HBV DNA was sequenced by Sanger''s method, genotyped and the viral load was determined.ResultsOne sample (1%) was positive for HBV DNA. The HBV viral load of the sample was 768,000 IU/ml. The partial S-gene of the Hepatitis B virus isolated was genotype E using the NCBI viral genotyping tool.ConclusionsThere is still a risk of HBV infected blood unit escaping detection when donor testing is limited to HBsAg screening. The use of NAT which can substantially reduce HBV infected blood donors from the donor pool should be considered.     

HCV/HBV复合DNA免疫的初步研究

目的 探讨HCV/HBV复合抗原PCX/S免疫原性。方法 将已证实具有良好免疫原性的人工合成的HCV复合多表位抗原基因PCX与HBV的S抗原基因融合于真核表达载体pcDNA3.0,构建真核表达载体pcDNA-PCXS。大量提取质粒并免疫小鼠,用ELISA的方法检测抗-HBs和抗-HCVAb;~3H-TdR渗入法检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖;用~(51)Cr释放法检测免疫小鼠特异性CTLs杀伤作用。结果 免疫后均能检测到抗-HBsAb和抗-HCVAb,抗体水平随着时间的推移逐渐升高,但后者OD_(450nm)平均值低于抗-HBsAb的OD_(450nm)。免疫小鼠诱发针对PCX或S抗原的CTL反应和淋巴细胞转化。结论 复合型PCX/S抗原基因可诱发特异性免疫应答,为HCV/HBV双价疫苗的研究提供一定实验基础。